SN∕T 4876.7-2019 DNA条形码方法 第7部分：一品红亚属.pdf

书 书 书犐 犆犛 犅 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 犇犖犃条形码方法第部分：一品红亚属犕犲 狋 犺 狅 犱犳 狅 狉犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲犘 犪 狉 狋：犛 狌 犫 犵 犲 狀犘狅 犻 狀 狊 犲 狋 狋 犻 犪 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院，中华人民共和国南京海关动植物与食品检测中心，中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，中华人民共和国广州海关，中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国福州海关，中华人民共和国青岛海关。本部分起草人：徐瑛，伏建国，印丽萍，张吉红，张慧丽，傅艺宁，吴海荣，范晓红，于文涛，宋涛。犛犖犜 SN/T 4876DNA条形码方法分为7个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；第2部分：检疫性断眼天牛；第3部分：检疫性卷蛾；第4部分：检疫性高粱属；第5部分：曼陀罗属；第6部分：瘤背豆象属；第7部分：一品红亚属。本部分为SN/T 4876的第7部分。犇犖犃条形码方法第部分：一品红亚属范围本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的条形码检测方法。本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的条形码的测定、结果的比对分析与判定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 齿裂大戟检疫鉴定方法术语与定义下列术语与定义适用于本文件。 犇犖犃条形码犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲 狊条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行扩增。 内部转录间隔区犻 狀 狋 犲 狉 狀 犪 犾狋 狉 犪 狀 狊 犮 狉 犻 犫 犲 犱狊 狆 犪 犮 犲 狉，简称犐 犜犛 在真核生物核糖体中， 和 基因间隔序列称为（） ，其所在的核糖体基因组序列从到依次为：外部转录间隔区（ ，） 、 基因、内部转录间隔区（ ）、 基因、内部转录间隔区（ ） 、 基因和基因间隔序列（ ，） 。核糖体中的 、 和 的基因组序列在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区 和 作为非编码区，承受的选择压力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本标准选用引物的扩增区域包括 部分序列， 全序列和 部分序列，扩增总长度约 ，其中齿裂大戟 长度为 。 狀 犱 犺犉基因又称叶绿体脱氢酶复合体亚基基因 ，位于叶绿体基因组的小单拷贝区，定位于类囊体复合体疏水臂末端。为编码假定的叶绿体脱氢酶的一个亚基。本标准扩增区是位于狀犱犺的 和 间的一段，扩增去除引物后长度约 。一品红亚属基本信息分类地位：大戟科 ，大戟属犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犔，一品红亚属犘狅 犻 狀 狊 犲 狋 狋 犻 犪。大戟属是被子植物中特大属之一，约 种，遍布世界各地，其中以非洲和中南美洲较多；我国检犛犖犜 疫性有害生物名单中大戟属仅一种 齿裂大戟（犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪 ） ，归入一品红亚属，根据 （ ）对大戟属一品红亚属的分类处理，该亚属在全球约 种，大部分为局部分布，有的甚至为稀有物种，除齿裂大戟外常见种还包括戴维大戟（犈犱犪 狏 犻 犱 犻 犻 ） ，猩猩草（犈犮 狔犪 狋 犺 狅 狆犺 狅 狉 犪 ） ，白苞猩猩草（犈犺 犲 狋 犲 狉 狅 狆犺狔 犾 犾 犪） 、一品红（犈狆狌 犾 犮 犺 犲 狉 狉 犻犿犪 ） 。其中齿裂大戟、戴维大戟和白苞猩猩草为有害杂草，一品红和猩猩草为园林植物。近似种信息详见 。方法原理根据植物 和狀犱犺的序列特征，应用条形码技术对大戟属一品红亚属常见种进行鉴定。仪器设备和主要试剂 仪器设备与用具仪、电子天平（感量 ） 、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解剖镜、涡旋振荡器、冰箱、水浴锅、测序仪、高压灭菌锅、可调式微量移液器（、 、 、 、 ， ）及相应吸头、离心管、管等。 主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。植物基因组提取试剂盒、超纯水、 、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸（ ） 、 酶、 缓冲液、 加样缓冲液， 缓冲液、引物（见附录 ） 。法提取试剂（参见附录 ） 。筛查鉴定方法 样品的处理样品鉴定见 。将需要提取的植物材料（种子为粒 粒，硅胶干燥的叶片为 ） ，放入圆底离心管中，每个管内加粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 （ 次秒） 。 犇犖犃制备使用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的法提取植物基因组总。改良的法方法参见附录 。 犇犖犃条形码基因片段扩增利用 和狀犱犺基因的通用引物进行 和狀犱犺基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录。 犘犆犚产物的检测取产物， 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 引物对可获得约 左右的扩增片段，狀犱犺引物对可获得约 的扩增片段。犛犖犜 测序与序列处理取剩余的扩增产物 ，经 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两端测序质量值 的序列去除。结果判定 中国检疫性有害生物犇犖犃条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物条形码鉴定系统（ ： ） ，点击“物种识别”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输入格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定” ，系统进行后，自动生成鉴定结果（参见附录） 。当相似度最高的 条序列为相同物种，最大相似度在 以上， 和狀犱犺结果相符，且形态学鉴定与 一致，可判定为该物种；否则请辅以其他鉴定方法。 植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（ ： ） ，使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，对符合该类群鉴定特征的且相似度为 的物种判定为该未知种。 和狀犱犺结果相符，且形态学鉴定与 一致，可判定为该物种。否则请辅以其他鉴定方法。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录。 国际通用数据库判定登录 数据库鉴定系统（ ： ）对获得的 和狀犱犺序列进行比对，在结果中查看序列相似性最高的物种，相似度最高的 条序列为相同物种，最大相似度在 以上， 和狀犱犺结果相符，且形态学鉴定与 一致，可判定为该物种。齿裂大戟及常见近似种基因序列信息见参见附录。标本与原始数据保存 标本保存将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或置于 低温保存。并注明来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。 原始数据保存样品检测结束后，其原始记录单（应包括序列及测序峰图等内容）和检验报告须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。犛犖犜 附录犃（资料性附录）犇犖犃提取方法（改良犆犜犃犅法）犃 试剂犃 提取液 ，氯化钠 ， （ ） ， （ ） ，高压灭菌备用。犃 缓冲液（ ）分别加入 （ ） 和 （ ）溶液，加水定容至 。在 （ ）条件下灭菌 。犃 三氯甲烷：异戊醇溶液将三氯甲烷和异戊醇按照 的体积比混合。犃 异丙醇。犃 乙醇（体积分数） 。犃 提取步骤在含植物粉末的离心管加入已预热至 的 提取液，充分振荡混匀； 水浴 ，不时颠倒混匀； 离心 ，取上清，等体积三氯甲烷：异戊醇（ ）抽提一次；取上清，再加入等体积异丙醇，沉淀 以上，然后 离心 ，弃上清； 乙醇洗涤次，晾干后，加入 缓冲液溶解沉淀，保存于 冰箱冷冻备用。犛犖犜 附录犅（规范性附录）犐 犜犛 狀 犱 犺犉序列扩增流程犅 引物序列引物序列见表 。表犅 引物序列目标基因引 物 序 列扩增片段大小（ ） 约 狀犱犺 约 犅 犘犆犚反应体系及参数反应体系及参数见表 。表犅 犘犆犚反应体系及参数成分储备液浓度 反应体系加样体积（）混合物 缓冲液（含） 正向引物 反向引物 酶 模板 注：该引物为通用引物，每次反应必须做空白对照，以确认是否污染。可用商品化的 。犅 犐 犜犛 基因犘犆犚反应程序 基因反应程序见表 。犛犖犜 表犅 犐 犜犛 基因犘犆犚反应程序步骤反应温度（）时间循环数预变性 变性退火延伸 延伸 犅 狀 犱 犺犉基因犘犆犚反应程序狀犱犺基因反应程序见表 。表犅 狀 犱 犺犉基因犘犆犚反应程序步骤反应温度（）时间循环数预变性 变性退火延伸 延伸 犛犖犜 附录犆（资料性附录）中国检疫性有害生物犇犖犃条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物条形码鉴定系统操作方法见图 。图犆 物种识别页面图犆 鉴定结果页面犛犖犜 附录犇（资料性附录）基因条形码分析软件操作方法登陆植物有害生物检疫鉴定系统（ ： ） ，首页选择“基因条码”模块，在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对” ，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比” ，将符合该类群鉴定特征的且相似度为 的物种判定为该未知种。以齿裂大戟犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪为例，在“输入比对的序列”窗口中粘贴 基因片段，点击“比对” ，结果见图 ，相似性最高的条码序列对应分类阶元为大戟属，相似性为 。在这一栏点击“开始对比” ，结果见图 ，相似度为 的序列对应物种为齿裂大戟犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪，即可判定查询序列为该物种。图犇 齿裂大戟犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪在条形码数据库分类阶元中的比对结果图犇 齿裂大戟犈狌狆犺 狅 狉 犫 犻 犪犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪在一品红亚属条形码数据库中的比对结果犛犖犜 附录犈（资料性附录）一品红亚属常见种序列犈 一品红亚属常见种序列信息一品红亚属常见种序列信息见表 。犈 一品红亚属常见种序列信息学名 登陆号 狀犱犺犈犱 犲 狀 狋 犪 狋 犪 、 犈犱犪 狏 犻 犱 犻 犻 、 、 犈犮 狔 犪 狋 犺 狅 狆犺 狅 狉 犪 、 犈狆狌 犾 犮 犺 犲 狉 狉 犻犿犪 犈犺 犲 狋 犲 狉 狅 狆犺 狔 犾 犾 犪 、 、 犛犖犜