乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第1页,【,试验目标,】,学习乙酸纤维素薄膜电泳原理，掌握相关操作技术。,【,试验原理,】,电泳,:,带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反方向泳动现象。,因为被分离物质所带电荷性质、数量和分子大小以及形状不一样，在同一电场作用下其移动方向和移动速度也不一样，即它们电泳迁移率（,）不一样。所以，经过一定时间电泳后即可被,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第2页,分离开来。利用此性质，将混合物中各组分进行分离分析方法称为电泳法。,影响电泳迁移率外界原因：电场强度、溶液,pH,值、溶液离子强度和电渗现象。,影响电泳迁移率内在原因：质点所带净电荷量、质点大小和形状。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第3页,血清蛋白,组分,蛋白质名称,等电点（,pI,）,相对分子质量,白蛋白,1,球蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,4.8,5.06,5.06,5.12,6.85,7.5,69000,00,300000,90000,150000,156000300000,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第4页,血清中各主要蛋白质等电点均低于,pH8.6,，在该缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极移动。,以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在,pH8.6,缓冲体系中电泳，染色后可显示,5,条主要区带。其中清蛋白泳动速度最快，其余依次为,1-,、,2-,、,-,及,-,球蛋白。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第5页,【,试验材料与试剂,】,（一）醋酸纤维薄膜（,2,8 cm,）、电泳仪、电泳槽、点样器（盖玻片）、载玻片、培养皿、镊子,（二）新鲜血清、巴比妥,/,钠缓冲液（,pH8.6,，离子强度,0.07,）、染色液（氨基黑,10B,）、漂洗液,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第6页,【,试验步骤,】,1.,薄膜处理,将醋酸纤维薄膜置于盛有巴比妥,/,钠缓冲液平皿中，浸泡,30 min,以上。,用镊子取出浸透薄膜，夹在两层粗滤纸内吸去多出缓冲液，然后平铺在载玻片上（无光泽面朝上）。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第7页,用毛细管取一滴血清，滴在另一 载玻片上，用盖玻片一侧边在血清上均匀蘸一下，再轻轻印在薄膜点样处片刻，使血清渗透到薄膜内，形成均匀直线。,2.,点样,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第8页,3.,电泳,将薄膜平贴在电泳槽支架上，点样端在阴极。两端用已浸透缓冲液纱布压住（引桥）。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第9页,盖上电泳槽盖，使薄膜平衡,10 min,。,连接电源、电极线。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第10页,通电，调整电压至,100 V,，电流强度为,0.4,0.6 mA/cm,膜宽度，电泳时间约,45 60 min,。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第11页,4.,染色,电泳完成后将薄膜取下,放在氨基黑,10B,染色液中浸泡,5 10min,。,5.,漂洗,将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清楚为止，可得到色带清楚电泳图谱。,+,-,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第12页,【,注意事项,】,1.,市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜选择与浸润是电泳成败关键之一。若浸透后薄膜色泽均匀，深浅一致，则可用于电泳。,2.,醋酸纤维素薄膜电泳常选取,pH8.6,巴比妥巴比妥钠缓冲液，其浓度为,0.05,0.09 mol/L,。选择何种浓度与样品和薄膜厚薄相关。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第13页,3.,点样时，应将薄膜表面多出缓冲液用滤纸吸去，以免引发样品扩散。但不宜太干，不然样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不齐，影响分离效果。,4.,点样时，点样不要过多，恰到好处，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。,乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白实验,第14页,