谷氨酸生产菌的选育.pptx

,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,谷氨酸生产菌的选育,生化,121,22,号,谷氨酸生产菌的选育方法，主要是采用常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。,诱变育种,利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随即突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。,诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中,DNA,结构用适宜的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。,诱变育种的基本流程,合适的出发菌株,制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验,谷氨酸生产菌的诱变育种流程,以菌株,ASL299,为出发菌株，采用,复合诱变,剂进行诱变,在诱变育种实践中，为了获得协同效应，常常采取诱变剂进行复合处理，可以是两种或多种诱变剂的先后使用，或是同一种诱变剂的重复使用，或是两种或多种诱变剂的同时使用。,出发菌株,ASL299,菌悬液制备硫酸二乙酯诱变单氟乙酸平板筛选高糖平板筛选高谷氨酸平板筛选摇瓶筛选,DES,突变株原生质体制备紫外线诱变原生质体再生香豆素和氯化锂平板筛选谷氨酸为唯一碳源平板筛选摇瓶筛选,UV,突变株稳定性试验生产条件试验,谷氨酸菌诱变选育操作步骤,（,1,）菌悬液的制备 将出发菌株,AS1.299,斜面菌接入一级种子培养集中，,32,摄氏度振荡培养,8h,，离心去清夜，加入,7.0,缓冲液稀释菌体泥制菌悬液。,（,2,）,硫酸二乙酯诱变 在菌悬液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为,1%,（体积分数），在电磁搅拌下处理,2030,分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。,（,3,）,单氟乙酸平板筛选 将诱变的菌悬液涂布在含,0.5%,单氟乙酸的平板上，在,32,摄氏度的条件下避光培养,3648h,挑取生长良好的菌落。,（,4,）,高糖平板筛选与高谷氨酸平板筛选 将抗单氟乙酸的菌株涂在含,25%,葡萄糖的平板上，培养,48h,后，挑取生长良好的菌落，可得到耐高糖菌株。然后，将耐高糖菌株涂在含,20%,谷氨酸的平板上，培养,48h,后，挑取生长良好的菌株，即得到耐高谷氨酸菌株。,（,5,）摇瓶筛选 将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸高产菌株。,(6),原生质体制备 将,DES,突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，,32,摄氏度振荡培养,5h,，加入青霉素,G,，使青霉素,G,的浓度为,0.6U/ml,，继续培养,3h,，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤,2,次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（,1-3,）,个,/ml,。然后，加入溶菌酶，使其浓度为,200-800U/ml,，恒温,32,摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当,95%,以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤,2,次，最后制成原生质体的高渗悬液。取,1ml,原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温,28,摄氏度培养,72h,，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率,=,(7),原生质体的紫外线诱变 取,5ml,原生质体悬液放入已灭菌的,9cm,的培养皿中，采用,15W,，波长为,253.7nm,左右的紫外线灯进行照射，照射距离为,30cm,，照射时间为,20-40h,。照射过程采用电磁搅拌以使照射均匀。,(8),原生质体再生 紫外线诱变后，用高渗稳定液对原生质体悬液进行适当稀释，吸取,0.1ml,涂布于下层固定体再生培养基上，再加入上层固体再生培养基，轻微摇匀，双层平板法于,28,摄氏度培养,72h,。取,1ml,原生质体悬液，用高渗稳定液稀释后涂布于下层固体再生培养基上恒温,28,摄氏度培养,72h,。更具在平板上形成的菌落数计算原生质体再生率，原生质体再生率,=,（,9,）香豆素和氯化锂平板筛选 挑取再生菌落涂在,0.15%,香豆素和,0.5,氯化锂的平板上，在,32,摄氏度的条件下培养,48h,后，挑取生长良好的菌落。,（,10,）谷氨酸唯一碳源平板筛选 用牙签法将抗维生素,P,类衍生物菌株接到以谷氨酸为唯一碳源平板上，在,32,摄氏度的条件下培养,48h,后，挑取省长微弱或不声张的菌株，即为不利用谷氨酸的菌落。,（,11,）摇瓶筛选与稳定性试验 经谷氨酸为唯一碳源平板筛选后，再对所选菌株进行筛选，选出谷氨酸产量最高的菌株。然后，将其连续进行斜面传代,10,次，对每代菌种都进行摇瓶试验，比较各代菌种的谷氨酸生产能力。如果谷氨酸生产稳定，则该菌株可用于生产条件试验。,The end,