小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析.pdf

54卷南 方 农 业 学 报 982小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析王杨铭1，2，王晓琼2，郑贝贝2，韩玲玲3，刘松涛2*，张亚菲2，许海霞1，程西永1*（1河南农业大学农学院，河南郑州450002；2河南农业职业学院，河南郑州451450；3河南秋乐种业科技股份有限公司，河南郑州450002）摘要：【目的】克隆小麦丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CIPK）TaCIPK15基因，并分析该基因编码的蛋白与小麦钙调素B类似蛋白（TaCBLs）的互作关系，为深入研究TaCIPK15基因在小麦逆境胁迫应答机制中的作用提供参考。【方法】通过PCR扩增小麦TaCIPK15基因编码区（CDS）全长序列，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究其对逆境的响应，通过酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术研究TaCIPK15与TaCBLs的互作关系。【结果】克隆获得的小麦TaCIPK15基因CDS序列全长1302 bp，编码433个氨基酸残基，与NCBI数据库中参考序列XR_006454427.1相似性为100%，蛋白分子量为48.48 kD，原子总数为6896，分子式为C2166H3487N599O628S16，理论等电点（pI）为9.38，不具备跨膜结构和信号肽。TaCIPK15蛋白含有CIPK家族保守NAF结构域和激活环，与大麦HvCIPK15（XP_044946251）氨基酸序列最为相似且亲缘关系最近。盐胁迫（NaC1）下TaCIPK15基因呈下调表达趋势；在冷胁迫（4）下，根系中TaCIPK15基因上调表达；脱落酸（ABA）处理后，根系和叶片中12 h的表达量均上调。TaCIPK15与TaCBL1和TaCBL2在酵母双杂交试验中能在四缺培养基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-gal/ABA上长出蓝色菌斑；在双分子荧光互补试验中，TaCIPK15与TaCBL1在细胞核上检测到黄色荧光，TaCIPK15与TaCBL2在细胞质和细胞膜上检测到黄色荧光。【结论】TaCIPK15基因属于CIPK家族，TaCIPK15与TaCBL1和TaCBL2存在互作关系且在细胞内的互作位置不同，并在小麦响应高盐胁迫、冷胁迫和ABA胁迫的Ca2信号转导过程中发挥作用。关键词：小麦；TaCIPK15；基因克隆；互作蛋白中图分类号：S512.1文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）04-0982-11收稿日期：2023-01-29基金项目：河南省自然科学基金项目（202300410217）；河南省重大科技专项（221100110300）通讯作者：刘松涛（1971-），https:/orcid.org/0009-0008-8649-9928，教授，主要从事农作物栽培与育种研究工作，E-mail：；程西永（1972-），https:/orcid.org/0009-0009-8762-8565，副教授，主要从事小麦遗传育种研究工作，E-mail：第一作者：王杨铭（1990-），https:/orcid.org/0000-0002-1496-6813，主要从事作物遗传育种研究工作，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（4）：982-992ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.04.002Cloning of TaCIPK15 gene and interaction analysis withTaCBLs protein in wheatWANG Yang-ming1，2，WANG Xiao-qiong2，ZHENG Bei-bei2，HAN Ling-ling3，LIU Song-tao2*，ZHANG Ya-fei2，XU Hai-xia1，CHENG Xi-yong1*（1HenanAgricultural University，Zhengzhou，Henan 450002，China；2Henan Vocational College ofAgriculture，Zhengzhou，Henan 451450，China；3Henan Qiule Seeds Technolygy，Co.，Ltd.，Zhengzhou，Henan 450002，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to clone the wheat serine/threonine protein kinases（CIPK）TaCIPK15 gene and analyze the interaction between the protein encoded by TaCIPK15 gene and wheat calcineurin B-likeprotein（TaCBLs），so as to provide reference for the in-depth study of the function of TaCIPK15 gene in the mechanismof response to adversity stress in wheat.【Method】The full length of coding region sequence（CDS）of wheat TaCIPK15gene was amplified by PCR and analyzed by bioinformatics methods.The real-time fluorescence quantitative PCR（qRT-PCR）method was used to study its response to adversity，and the interaction between TaCIPK15 and TaCBLs was studiedby yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation techniques.【Result】The CDS sequence of wheatTaCIPK15 gene obtained by cloning was 1302 bp in length，encoding 433 amino acid residues，which was 100%similarwith the reference sequence XR_006454427.1 in the NCBI database.TaCIPK15 protein had a molecular weight of 48.48 kD，4期9830引言【研究意义】小麦（Triticum aestivum L.）是我国乃至世界重要的粮食作物，是全世界1/3以上人口的主食。在小麦生长发育过程中，时常面临干旱、盐渍、低温、高温等不良环境，严重影响小麦正常的生长发育，造成小麦产量降低或品质下降（Gupta etal.，2020）。研究小麦对逆境的响应机理，有助于提升小麦对于逆境胁迫的抗性，增强小麦的稳产性，有利于培育高产、优质、抗逆性强的小麦新品种，对保障我国粮食安全有着重要作用（李海泳和殷贵鸿，2022）。Ca2+是植物生长发育过程中必不可少的一种大量元素，并作为重要的第二信使参与多种调节植物逆境响应的过程（Yin et al.，2017；Kudla et al.，2018；Kster et al.，2019；吴春婷等，2022）。钙调素B类似蛋白（Calcineurin B-like protein，CBL）作为Ca2+传感器，通过与一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶CIPK（CBL interacting protein kinase）相互作用而形成一套Ca2+信号转导系统CBL-CIPK信号系统，在盐、干旱、寒冷、低钾等非生物逆境的应答机制中起 着 重 要 作 用（Kolukisaoglu et al.，2004；Luan，2009；Tang et al.，2020）。在CBL-CIPK信号系统中，CBL蛋白是Ca2+信号响应蛋白，与Ca2+结合形成Ca2+-CBL复合物，但CBL蛋白本身无激酶活性，必须与CIPK蛋白结合，激活CIPK蛋白激酶活性，启动相关的抗逆响应（谢玲玲等，2021）。因此，研究小麦CBL-CIPK信号系统及其功能，有利于探索小麦响应逆境胁迫机制。【前人研究进展】CIPK家族具有N端保守激酶结构域和C端调节结构域，二者间存在1个连接结构域，C端结构域包含2个保守的相互作用域，即NAF结构域和PPI结构域，NAF结构域负责CBL-CIPK相互作用，相邻的PPI结构域可使CIPK与ABI1、ABI2等PP2C型蛋白磷酸酶进行互作（Weinland Kudla，2009；Kudla et al.，2010；程西永等，2018）。CIPK家族广泛存在于植物中。在拟南芥中发现了10个CBLs和26个CIPKs，其中AtCIPK24与AtCBL4相互作用，维持植物细胞内Na+和K+的动态平衡，提高植物抗盐性（Halfter et al.，2000）；AtCIPK23与AtCBL1、AtCBL9互作，可促进植物吸收K，也能通过参与脱落酸（ABA）信号通路调节气孔运动（Gei-ger et al.，2009；Ragel et al.，2015；Lara et al.，2020）；AtCBL2/AtCBL3与AtCIPK2/AtCIPK3/AtCIPK2326形成多价相互作用网络，减轻Mg2+对植物的毒害（Gu et al.，2020）；拟南芥AtCIPK6的缺失会导致植株发育缺陷，并对盐胁迫更加敏感（Tripathi et al.，2009）；AtCIPK7与AtCBL1相互作用，在冷胁迫应答过程中起重要作用（Huang et al.，2011；黄聪琳等，2013）。水稻中发现了31个OsCIPKs基因，目前关于水稻CIPK家族的功能已有较多报道，在响应生物胁迫和非生物胁迫过程中均起着关键作用（Weinl andKudla，2009）。基因表达分析表明，水稻OsCIPK1/OsCIPK2/OsCIPK10/OsCIPK11/OsCIPK12 在 感 染细菌性枯萎病后表达量均上调（Chen et al.，2011）；OsCIPK29蛋白激酶能磷酸化修饰水稻条纹病毒的NS3蛋白，减弱病毒致病性（庄新建，2021）；过表达OsCIPK3基因后能增强水稻的耐冷性，过表达Os-CIPK12基因使水稻更耐旱，过表达OsCIPK15基因可增强水稻的耐盐性（Xiang et al.，2007）；OsCIPK31蛋白激酶在水稻抗纹枯病和生长发育过程中发挥其功能（Piao et al.，2010；Peng et al.，2018；陈欢，2022）。大豆CIPK家族包含54个成员，在植物应对盐胁迫、干旱胁迫等过程中起着重要作用，其中GmCIPK9/GmCIPK12/GmCIPK24/GmCIPK49在干旱处理后表达量显著提高；大豆CIPK基因GmPKS4在盐碱胁迫下表达量上调，过表达该基因能提高大豆的耐盐性with a total number of atoms of 6896，a molecular formula of C2166H3487N599O628S16，and theoretical isoelectric point（pI）of 9.38.TaCIPK15 protein had no transmembrane structure and signal peptide.TaCIPK15 protein contained conservedNAF structural domain and activation loop of CIPK family，and the amino acid sequence was most similar and the closestrelative to that of barley HvCIPK15（XP_044946251）.The expression of TaCIPK15 gene was down-regulated under saltstress（NaCl）.The expression of TaCIPK15 gene was up-regulated in root under cold stress.The expression was up-regu-lated in root and leaf at 12 h after abscisic acid（ABA）treatment.TaCIPK15，TaCBL1 and TaCBL2 showed the ability togrowblueplaquesonfour-deficientmediaSD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-gal/ABAinyeasttwo-hybridtest.Inthebimolecularfluorescence complementation test，TaCIPK15 and TaCBL1 detected yellow fluorescence in the nucleus，and TaCIPK15and TaCBL2 detected yellow fluorescence in the cytoplasm and cell membrane.【Conclusion】The TaCIPK15 gene belongsto CIPK gene family.TaCIPK15 interacts with TaCBL1 and TaCBL2 and has different interaction positions in cells.TaCIPK15 gene plays a role in Ca2+signaling transduction in wheat in response to high salt stress，cold stress and ABAstress.Key words：wheat；TaCIPK15；gene cloning；interacting proteinsFoundation items：Henan Natural Science Foundation（202300410217）；Henan Major Science and TechnologyProject（221100110300）王杨铭等：小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析54卷南 方 农 业 学 报 984（Zhu et al.，2016；Ketehouli et al.，2021）。小麦是异源六倍体作物，染色体组成较复杂，小麦中CIPK基因家族成员众多。研究人员通过数据库检索，从小麦基因组中鉴定出24个TaCBL基因和79个TaCIPK基因（Sun et al.，2015），已有部分CIPK基因功能被研究，如小麦TaCIPK16在盐胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫和乙烯胁迫信号转导途径中发挥重要作用（马晶飞，2015）；小麦TaCIPK3与TaCBL1/TaCBL2/TaCBL3/TaCBL4之间存在相互作用（程西永等，2018）；小麦TaCIPK2能与TaCBL2互作，且TaCIPK2的表达受ABA、低温和盐胁迫的诱导（程西永等，2016）。【本研究切入点】小麦CIPK家族成员较多，但大多数TaCIPKs基因的生物学功能和互作调控通路尚不清晰，而TaCIPK15基因的相关研究尚未见报道，克隆小麦TaCIPK15基因并研究其与TaCBLs的互作关系，有助于了解小麦对逆境响应的信号转导机制。【拟解决的关键问题】从普通六倍体小麦中克隆得到TaCIPK15基因，对其进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）研究其对逆境的应答，并利用酵母双杂交系统和双分子荧光互补系统检测TaCIPK15 与 TaCBLs 的 互 作 关 系，为 深 入 研 究TaCIPK15基因在小麦逆境胁迫应答机制中的作用提供参考。1材料与方法1.1试验材料供试材料六倍体普通小麦品种德抗961由河南农业大学小麦遗传育种研究室提供；酵母菌株Y187、Y2HGold及酵母载体pGBKT7、pGADT7购自Clontech公司；双分子荧光互补载体pSAT4-cEYFP-C1-B与pSAT4-nEYFP-C1由河南农业大学小麦遗传育种研究室保存提供。主要试剂：RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司；RNA反转录试剂盒、感受态细胞制备试剂盒、pMD-19T和酵母双杂交SD培养基购自TAKARA公司；高保真酶KOD PlusNeo和T4 DNA聚合酶购自TOYOBO公司，DNA限制性内切酶购自Thermo Fisher公司；胶回收试剂盒、产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、氨苄青霉素、X-gal和ABA购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Cellonlase R10和Macerozyme R10购自南京斯博慕生物科技有限公司，质粒大量提取试剂盒购自QIAGEN公司。1.2试验方法1.2.1样品处理挑选大小一致的饱满小麦种子，用70%乙醇进行消毒处理，置于光照培养箱内培养15 d，取幼嫩叶片提取小麦总RNA，采用反转录试剂盒合成cDNA第一链，保存于-20 冰箱。挑选大小一致的饱满拟南芥种子，消毒后于光照培养箱中培养，光照条件为12 h光照/12 h黑暗，23、相对湿度55%，光子通量密度75 E/（m2s），培养4周后用于原生质体提取。1.2.2基因克隆根据NCBI网站（https:/www.nc-bi.nlm.nih.gov/）中查询到的小麦TaCIPK15基因序列（XR_006454427.1），使用Primer Premier 5.0设计正向引物TaCIPK15-F（5-ATGGAGAACAGTGGGAAGAT-3）和反向引物TaCIPK15-R（5-TCAGCCCCATGCCATGCC-3，以cDNA为模板扩增TaCIPK15基因编码区（CDS）序列。PCR反应体系25.0 L：模板cDNA1.0 L，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 L，10Buffer2.5 L，KOD Plus Neo 0.5 L，10 mmol/L dNTP 0.5L，ddH2O 19.5 L。扩增程序：94 预变性5 min；94 30 s，58 30 s，72 90 s，进行35个循环；72 延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，将符合目标大小的产物连接pMD-19T载体，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。1.2.3生物信息学分析使用ORF Finder（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测基因CDS全长；使用ProtParam（https:/web.expasy.org/protparam/）在线工具对TaCIPK15蛋白的理化性质进行预测；使用TMHMM 2.0（https:/services.healthtech.dtu.dk/ser-vice.php？TMHMM-2.0）对TaCIPK15蛋白跨膜结构进行预测；使用SignalP（https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-4.1）对TaCIPK15蛋白信号肽进行预测；使用NetPhos 3.1 Server（http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）进行蛋白磷酸化预测；使用NCBI数据库BLAST查找TaCIPK15蛋白的同源序列，并用Clustal X进行多序列比对，比对结果由GeneDoc显示；使用MEGA 5.0的Neighbor-joining构建系统发育进化树。1.2.4TaCIPK15基因表达分析将小麦种子于25 光照培养至2叶1心期，用200 mmol/L NaCl、100 mol/L ABA和4 低温分别进行盐胁迫、ABA胁迫和冷胁迫处理，未处理的小麦作对照组。分别在0、4、8、12和24 h取小麦的叶片和根系提取RNA，逆转录合成cDNA为模板，使用表1中引物Actin-F、Actin-R、qRT-TaCIPK15-F和qRT-TaCIPK15-R，通过qRT-PCR检测TaCIPK15基因表达量。1.2.5TaCIPK15与TaCBLs酵母双杂交互作鉴定酵母双杂交载体构建所需引物及酶切位点见表1。用与引物酶切位点相同的限制性内切酶对扩增后带有4期985酶切位点的TaCIPK15和TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7分别进行双酶切，载体pGADT7和pGBKT7用同样的限制性内切酶酶切，T4连接酶将酶切后的TaCIPK15与pGADT7连接，TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6、TaCBL7与pGBKT7连接。将构建好的重组质粒pGADT7-TaCIPK15转入酵母菌株Y187中，涂布于营养缺陷的固体培养基SD/-Leu上，重组质粒pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6和pG-BKT7-TaCBL7分别转入Y2HGold中，涂布于营养缺陷的固体培养基SD/-Trp上，30 倒置培养3 d，至阳性菌落出现。挑取阳性克隆进行自激活活性检测，检测所用培养基为SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/X-gal、SD/-Trp/X-gal、SD/-Trp/-Leu、SD/-Leu/X-gal/ABA和SD/-Trp/X-gal/ABA。酵母双杂交互作鉴定方法参考Clontech公司Gold Yeast Two-HybirdSystem说明书，将分别含有pGADT7-TaCIPK15和空载体pGADT7的酵母菌株Y187，与对应的分别含有pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7 和 空 载 体 pGBKT7 的Y2HGold酵母菌株，成对接种于2YPDA液体培养基中，分别涂于相应的固体培养基SD/-Leu、SD/-Trp、SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/X-gal/ABA和SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His/X-gal/ABA，观察菌落生长情况。1.2.6TaCIPK15与TaCBLs双分子荧光互补鉴定拟南芥原生质体制备参考Yoo等（2007）的方法。双分子荧光互补载体构建所需引物及酶切位点见表1。构建双分子荧光互补载体nEYFP-TaCIPK15、cEYFP-TaCBL1、cEYFP-TaCBL2、cEYFP-TaCBL6和cEYFP-TaCBL7。使用PEG介导法将重组质粒成对转入原生质体细胞中，23 静置避光培养16 h后，使用荧光显微镜观察。2结果与分析2.1TaCIPK15基因克隆与序列分析结果从六倍体普通小麦的叶片中提取RNA，以反转录cDNA为模板，使用基因特异性引物对目的基因进行扩增，获得一条约1300 bp的条带（图1）。将目的条带回收产物进行测序，使用Clustal X将测序结果与参考序列（XR_006454427.1）进行比对，结果显示扩增获得的目的片段与参考序列相似性为100%，克隆得到的片段为目的基因TaCIPK15。2.2生物信息学分析结果ORF Finder结果显示，TaCIPK15基因CDS全长1302 bp，编码433个氨基酸残基，蛋白分子量48.48kD，原子总数6896，分子式为C2166H3487N599O628S16，理论等电点（pI）为9.38，为碱性蛋白；不稳定系数为引物名称PrimerpGBKT7-TaCBL1-FpGBKT7-TaCBL1-RpGBKT7-TaCBL2-FpGBKT7-TaCBL2-RpGBKT7-TaCBL6-FpGBKT7-TaCBL6-RpGBKT7-TaCBL7-FpGBKT7-TaCBL7-RpGADT7-TaCIPK15-FpGADT7-TaCIPK15-RcEYFP-TaCBL1-FcEYFP-TaCBL1-RcEYFP-TaCBL2-FcEYFP-TaCBL2-RcEYFP-TaCBL6-FcEYFP-TaCBL6-RcEYFP-TaCBL7-FcEYFP-TaCBL7-RnEYFP-TaCIPK15-FnEYFP-TaCIPK15-RActin-FActin-RqRT-TaCIPK15-FqRT-TaCIPK15-R引物序列Premer sequence5-ATAGAATTCATGGGGTGCATCCAGTCC-35-AGTGGATCCTCATGTAATGATATCATCAA-35-ATAGAATTCATGGTGCAGTGTCTCGACG-35-AGTGGATCCTCAGGTATCGTCGACCTGAG-35-ATACATATGATGGTGGATTTCCCGGAAG-35-TATCTGCAGTCAAGCATCCTCGACCTGA-35-ATACATATGATGGGCTGTGTATCATCGA-35-TATCTGCAGCTACAACTCTTCGTCGCCGG-35-CGGGGTACCATGGAGAACAGTGGGAAGAT-35-CGCGGATCCTCAGCCCCATGCCATGCC-35-GGAGGTACCATGGGGTGCATCCAGTCC-35-CGGGGATCCTCATGTAATGATATCATCAA-35-CGGGGTACCATGGTGCAGTGTCTCGACG-35-CGCGGATCCTCAGGTATCGTCGACCTGAG-35-GGCAGATCTATGGTGGATTTCCCGGAAG-35-CCGGGTACCTCAAGCATCCTCGACCTGA-35-CCGGGTACCATGGGCTGTGTATCATCGA-35-CCGGGATCCCTACAACTCTTCGTCGCCGG-35-CGGGGTACCATGGAGAACAGTGGGAAGAT-35-CGCGGATCCTCAGCCCCATGCCATGCC-35-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-35-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-35-TACCTGGTCTTGCGGTGTCATCC-35-GCAGCATCACTTGGCAGTCTCTC-3酶切位点Enzyme cutting siteEcoR BamH EcoR BamH Nde Pst Nde Pst Kpn BamH Kpn BamH Kpn BamH Bgl Kpn Kpn BamH Kpn BamH 表 1试验所用引物及序列Table 1Name and sequence of primers used in experiment划线部分为酶切位点序列The underline indicated sequence of enzyme cutting site王杨铭等：小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析54卷南 方 农 业 学 报 98637.35，属于稳定蛋白。蛋白质主要由亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）组成，二者各占10.4%。在所有氨基酸残基中，带负电荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）的氨基酸残基总数为52个，带正电荷的赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）和组氨酸（His）的氨基酸残基总数为77个。TaCIPK15蛋白无跨膜结构，不属于膜蛋白（图2）；无信号肽（图3），是非分泌型蛋白。TaCIPK15蛋白序列中，氨基酸磷酸化位点含有丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr），其中丝氨酸磷酸化位点有18个，苏氨酸磷酸化位点有8个，酪氨酸磷酸化位点有6个（图4）。2.3TaCIPK15氨基酸序列比对及进化分析结果使用NCBI数据库BLAST检索已知其他植物的CIPK15蛋白，与TaCIPK15蛋白进行氨基酸序列比对，结果发现TaCIPK15蛋白含有典型的CIPK家族保守结构域，属于CIPK家族。TaCIPK15蛋白的激活环图 1TaCIPK15基因PCR扩增电泳结果Fig.1PCR amplification electrophoresis results of TaCIPK15geneM：DL2000 DNAMarker；1、2：TaCIPK15基因扩增条带M：DL2000 DNAMarker；1，2：Amplification band of TaCIPK15 gene图 3TaCIPK15蛋白信号肽预测结果Fig.3Prediction of signal peptide of TaCIPK15 protein图 2TaCIPK15蛋白跨膜域预测结果Fig.2Prediction of transmembrane domain of TaCIPK15 protein2000 bp1000 bp750 bp500 bp250 bp100 bpM121.21.00.80.60.40.20.050100150200250300350400概率 ProbabiltyTMHMM posterior probabilities for WEBSEQUENCE跨膜 Transmembrane内部 Inside外部 Outside1.00.80.60.40.20.0分值 Score010203040506070位置 PositionSignalP-4.1 prediction（euk networks）：SequenceC-scoreS-scoreY-score位置 Position4期987（Activation loop）由30个氨基酸残基组成，位于氨基酸序列第153183位置，NAF/FISL结构域由24个氨基 酸 残 基 组 成，位 于 第 308331 位 置（图 5）。TaCIPK15蛋白与其他9个不同物种CIPK15蛋白的比对结果显示，TaCIPK15蛋白与禾本科植物大麦HvCIPK15蛋白的同源性最高，达94.52%，与拟南芥亲缘关系较远（图6）。2.4TaCIPK15基因表达分析结果采用qRT-PCR方法分析TaCIPK15对高盐胁迫、ABA胁迫和低温胁迫的特异性表达。盐胁迫处理下，叶片中TaCIPK15基因表达水平在012 h内下降，12 h后上升，根系中TaCIPK15基因表达规律与叶片一致（图7-A）；低温胁迫处理下，叶片中TaCIPK15基因表达水平迅速下降，根系中TaCIPK15基因相对表图 4TaCIPK15蛋白磷酸化位点预测结果Fig.4Prediction of phosphorylation site of TaCIPK15 protein图 5TaCIPK15蛋白与其他物种CIPK15蛋白氨基酸序列多重比对结果Fig.5Multiple sequence alignment of TaCIPK15 protein and CIPK15 protein in other speciesHvCIPK15：XP_044946251；LpCIPK15：XM_051324388.1；BdCIPK15：XM_003578975.4；OsCIPK15：XM_015761969.1；SbCIPK15：XM_002450091.2；SvCIPK15：XM_034747208.1；PvCIPK15：XM_039979478.1；ZmCIPK15：XM_020545867.2；AtCIPK15：NM_001036743.1Netphos 3.1a:predicted phosphorylation sites in sequenceSerineThreonineTyrosineThreshold序列位置 Sequence position磷酸化概率Phosphorytstion potential10050100150200250300350400王杨铭等：小麦TaCIPK15基因克隆及与TaCBLs蛋白的互作分析54卷南 方 农 业 学 报 988达量呈先上升后下降再上升的变化趋势，在处理后4 h达最高，约为起始表达量的13倍（图7-B）；ABA胁迫处理下，叶片中TaCIPK15基因相对表达量呈先下降后上升的变化趋势，在12 h时表达量最高，约为起始表达量的2.5倍，根系中TaCIPK15基因在处理12 h时表达量最高，整体为上升趋势（图7-C）。2.5TaCIPK15与TaCBLs互作分析结果2.5.1TaCIPK15与TaCBLs酵母双杂交鉴定分别构建酵母表达载体pGADT7-TaCIPK15、pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6和pG-BKT7-TaCBL7，测序正确后转入酵母菌株中进行自激活活性检测。pGADT7-TaCIPK15转化酵母菌株Y187，只能在SD/-Leu和SD/-Leu/X-gal上长出白色菌斑。pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6和pGBKT7-TaCBL7转化酵母菌株Y2HGold，只能在SD/-Trp和SD/-Trp/X-gal上长出白色菌斑（表2）。以上结果表明，TaCIPK15、TaCBL1、TaCBL2、TaCBL6和TaCBL7蛋白均不能激活酵母菌中的报告基因，无自激活活性。将酵母菌株Y187（pGADT7-TaCIPK15）与Y2H-Gold（pGBKT7-TaCBL1、pGBKT7-TaCBL2、pGBKT7-TaCBL6、pGBKT7-TaCBL7）分别融合，同时设置阳性对照pGBKT7-53pGBKT7-T。结果（图8）显示，同 时 转 化 pGADT7-TaCIPK15pGBKT7-TaCBL1、pGADT7-TaCIPK15pGBKT7-TaCBL2和阳性对照的酵母菌能在四缺培养基SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-gal/ABA上长出蓝色菌斑。说明在酵母双杂交系统内，TaCIPK15可与TaCBL1、TaCBL2发生相互作用，从而激活报告基因，产生蓝色菌斑。而同时转化pGADT7-TaCIPK15pGBKT7-TaCBL6、pGADT7-TaCIPK15pGBKT7-TaCBL7的酵母菌在二缺培养基SD/-Trp/-Leu不能长出菌斑，说明Ta-CIPK15与图 7不同胁迫处理下TaCIPK15基因的相对表达量Fig.7TherelativeexpressionofTaCIPK15geneunderdifferentstress treatments图 6基于不同物种CIPK15蛋白氨基酸序列构建的系统发育进化树Fig.6Phylogenetic tree based on amino acid sequence of CIPK15 protein of different species0.051009280559953100拟南芥Arabidopsis thaliana NM_001036743.1玉米 Zea mays XM_020545867.2柳枝稷 Panicun virgatum XM_039979478.1狗尾草 Setaria viridis XM_034747208.1高粱 Sorghum bicolor XM_002450091.2水稻 Oryza sativa L.XM_015761969.1二穗短柄草 Brachypodium distachyon XM_003578975.4黑麦 Lolium perenne XM_051324388.1大麦 Hordeum vulgare XP_044946251TaCIPK15处理时间（d）Treatment time04812241.21.00.80.60.40