我国临床检验蛋白类标志物标准物质研制的现状与发展.pdf

亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期4项目资助：国家自然科学基金（82070916）作者简介：邓凤琳（1999），女（汉族），硕士研究生，研究方向为临床检验诊断学。E-mail：*通讯作者：鄢盛恺（1969），男（汉族），教授研究员，研究方向为临床检验诊断学。E-mail：我国临床检验蛋白类标志物标准物质研制的现状与发展邓凤琳1,2，黄彦捷3，于婷4，鄢盛恺1,2*（1.遵义医科大学附属医院医学检验科，贵州，遵义563000；2.遵义医科大学检验医学院，贵州，遵义563006；3.广东省计量科学研究院，广东，广州510405；4.中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，北京100050）Abstract:The reference material has sufficient accuracy,uniformity and stability,which is an important carrier for the traceability of clinical laboratory values.Due to the fact that the raw materials of protein markers in clinical laboratory in China are mostly dependent on imports,and it is difficult to determine the quasi-value.As a result,this kind of reference materials lags far behind developed countries in terms of variety,quantity and quality.Therefore,it is urgent to solve the key generic technical problems of bottleneck.This paper analyzes the development situation in the field of clinical laboratory reference materials at home and abroad,and introduces the generic technology problems such as the preparation,quasi-determinative values and accurate characterization of protein markers reference materials in clinical laboratory in China,and puts forward the possible development countermeasures and solutions,and looks forward to the future development of this kind of reference materials in China.Key words：Clinical laboratory;protein markers;reference materials;generic technology鄢盛恺，教授/研究员，临床检验诊断学专业硕士/博士研究生导师。先后任中国医学科学院北京协和医院检验科主任助理、中日友好医院检验科副主任（主持工作）、遵义医科大学“候鸟人才”专家。中国计量协会医学计量专业委员会副主任委员、中国生物化学与分子生物学会脂蛋白专业委员会/临床医学专业分会常务委员、中国电子学会生命电子学分会常务委员、中国生物工程学会临床医学工程分会委员。担任全国高等医学院校医学检验技术专业本科规划教材临床生物化学检验主编（医药版）及国内外十余本专业杂志编委等。主要研究方向：动脉粥样硬化的基础与临床、临床检验方法学与关键技术、医学实验室认可与评定等。已在国内外各类专业杂志上发表论文150余篇，参加编写专著42本，主编17本。主持国际合作项目、国家863项目、国家自然科学基金面上项目等6项，获省部级以上科技成果贰等奖2项次。Development of Protein Marker Reference Materials in Clinical Laboratory in China：Current Status and DevelopmentDENG Fenglin1,2,HUANG Yanjie3,YU Ting4,YAN Shengkai1,2*(1.Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou,Zunyi 563000;2.College of Laboratory Medicine,Zunyi Medical University,Guizhou,Zunyi,563000;3.Guangdong Provincial Institute of Metrology,Guangdong,Guangzhou 510405;4.National Institutes for Food and Drug Control,Beijing,China,100050)摘要：标准物质具有足够的准确性、均匀性和稳定性，是临床检验量值溯源的重要载体。由于我国临床检验蛋白类标志物标准物质原料多依赖进口，准确定值困难，导致这类标准物质在品种、数量及质量方面远落后于发达国家，急需解决“卡脖子”关键共性技术难题。本文分析了国内外在临床检验标准物质领域的发展情况，介绍了我国临床检验蛋白类标志物标准物质制备、准确定值、精准表征等共性技术方面存在的问题，提出了可能的研制对策与解决方案，并对我国这类标准物质研制的未来发展进行了展望。关键词：临床检验；蛋白类标志物；标准物质；共性技术中图分类号：TP181 文献标识码：A DOI:10.11967/2022200201 亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期50 引言众所周知，标准物质是具有足够均匀和稳定特性的物质，具有复现、保存和传递量值的作用1，也是临床检验量值溯源的重要载体。实现量值溯源是保证检验结果准确性和可比性的重要方法之一2,3，国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）文件“体外诊断医疗器械校准品、正确度控制品、人源样品定值的量值溯源性的建立要求”（ISO 17511：2020）明确提出临床检验的量值溯源是应用参考测量程序或参考物质建立或验证常规检验结果准确性4。由于我国临床检验蛋白类标志物（如恶性肿瘤、代谢性疾病标志物）标准物质原料多依赖进口，准确定值困难，导致这类标准物质在品种、数量及质量方面远落后于发达国家，急需解决“卡脖子”关键共性技术难题，实现这类标准物质国产化，以更好地推进临床这类重大疾病检验结果的量值溯源及结果互认，努力实现我国标准物质建设管理2035年目标。本文分析了国内外在临床检验标准物质领域的发展情况，介绍了我国临床检验蛋白类标志物标准物质研制的具体情况及可能的研制对策与解决方案，并对我国这类标准物质的未来发展进行展望。1 国内外临床检验标准物质现状国外临床检验相关机构十分重视标准物质在临床检验量值传递中的作用。美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）是世界上开展标准物质研制最早的机构。1968年NIST首次推出纯试剂尿酸标准物质，并在同期相继研制出胆固醇系列标准物质。现已研制超过70种临床检验标准物质，如血管紧张素I、重组肌钙蛋白等，极大地促进了临床检验标准化。NIST在采纳由ISO制定的国际计量学通用基本术语中除对有证标准物质（Certified Reference Material，CRM）、标准物质（Reference Material，RM）的定义外，还将其标准物质分为标准参考物质（Standard Reference Material，SRM）、RM及可溯源至NIST的标准物质（NIST Traceable Reference Material，NTRM）5。欧盟标准物质主要指以欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院（Institute of Reference Materials and Measurement，IRMM）为核心，在欧盟资金支持下研发的标准物质，具有以欧共体标准局（Community Bureau of Reference，BCR）、欧洲标准物质（European Reference Materials，ERM）或IRMM开头的标准物质编号。IRMM已研制超过50种临床检验相关的标准物质，包括纯物质、溶液标准物质和基体标准物质，如前列腺特异性抗原、载脂蛋白AI、甲胎蛋白等。英国政府化学家实验室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）是英国国家化学计量实验室，为商业化运作的检测实验室，除参与欧盟BCR与ERM标准物质的研制外，也研制标准物质（称之为LGC标准物质），包括CRM与质量控制标准物质5，LGC集团旗下的LGC标准品公司是欧洲较综合全面的标准物质提供者。LGC研制的甘氨酸稳定碳同位素绝对比值标准物质，可使定值结果向SI单位溯源。英国国家生物制品检定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）作为世界卫生组织（World Health Organisation，WHO）指定的一家标准物质研究与供应机构，研制了较多蛋白、抗体、激素等国际标准物质，如甲胎蛋白、癌胚抗原、人绒毛膜促性腺激素、血管内皮生长因子等2。此外，日本国家计量研究所（National Metrology Institute of Japan，NMIJ）、韩国标准科学研究院（Korea Research Institute of Standards and Science，KRISS）等近年来分别在临床化学（如C反应蛋白、C肽、血清酶等）、新生儿遗传代谢指标（如多种氨基酸干血斑）等标准物质研制方面也取得了诸多研究成果6-8。自20世纪90年代起，国际临床化学联合会（International Federation of Clinical 亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期6Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）就开始了糖化血红蛋白检测的标准化研究，现已研制出糖化血红蛋白、心肌肌钙蛋白I等标准物质，并建立了载脂蛋白AI和B的参考方法9。为了促进临床检验溯源性进一步发展，2002年6月IFCC联合国际计量局（International Bureau of Weights and Measures,BIPM）和国际实验室认可合作组织（International Laboratory Accreditation Cooperation,ILAC）成立了检验医学溯源联合委员会（Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM），秘书处设在BIPM10。目前JCTLM已认可、发布了50多个参考测量程序、200余种参考物质和一批参考测量实验室，极大推动了临床检验量值溯源与标准物质的发展11。我国临床检验标准物质研究起步晚，1987年制订了标准物质管理办法，标志着标准物质纳入了依法管理的计量器具范围。此后相继颁布了中华人民共和国依法管理的计量器具目录、制备标准物质办理许可证的具体规定等法规，以及标准物质通用术语和定义、标准物质证书编写规则、标准物质研制(生产)机构通用要求、国家一级标准物质技术规范等规范性文件，为我国标准物质的研究提供了技术支持和规范要求2,5,12-14。我国将标准物质分为一级标准物质和二级标准物质，并规定凡是新研制的标准物质都需要经过定级、鉴定、评审，最终才能获得标准物质定级证书。根据学科和专业的不同，标准物质又分为13类，包括临床检验所属的临床化学分析与药品成分分析标准物质类等。自上世纪80年代开始，中国计量科学研究院、中国食品药品检定研究院、北京市医疗器械检验研究院（北京市医用生物防护装备检验研究中心）、国家卫健委临床检验中心、广东省计量科学研究院等国内多家计量、科研及临床研究机构及部分生产企业等相继开展临床检验标准物质研制工作，并取得了诸多成果，有效推动了国内临床检验结果的一致化和标准化。2004年国家有证标准物质资源信息共享的国家标准物质资源共享平台（）建立，在线可查询、购买近万种国家有证标准物质。根据该平台数据显示，截至到2022年10月，我国临床化学分析标准物质累计435种，其中一级标准物质150种，二级标准物质285种。目前我国临床检验标准物质主要存在以下问题：（1）覆盖面窄且种类单一。纯物质和溶液形式的标准物质居多，复杂基体类标准物质种类少。已有的特性量大多是无机元素，缺乏有良好互换性的全血和血清基体标准物质；（2）生物大分子类标准物质种类较少。近几年为应对突发传染病等公共卫生事件，核酸、质粒类等标准物质种类有所增多，但蛋白、脂类、多肽及维生素类标准物质仍较为缺乏；（3）溯源性未完全解决。目前主要是代谢物、电解质、甲状腺激素等化学定义明确的化合物能溯源到SI单位，蛋白等生物大分子因未能解决原料、表征等问题，溯源性尚需进一步研究解决。受制于精准表征及准确定值等共性技术，许多蛋白类标志物标准物质研制存在瓶颈。2 临床检验蛋白类标志物标准物质研制的共性技术难题与各种小分子物质相比，血清蛋白存在形式多样、结构复杂，特别是对于低丰度蛋白更是难以准确定量，因而蛋白类标志物标准物质的研制更为困难，这类标准物质的特殊性在于其生物学特性易受环境影响，故其理化性质及生物学性质都需要进行表征，需要解决制备、定值及精准表征等共性技术难题。2.1 蛋白质制备准确性、均匀性和稳定性是标准物质量值的特性和基本要求，为满足这些条件，其制作原料要遵循适用性、代表性以及易复制的原则，同时为满足供应需要，每批原料还应有足够的数量。制备蛋白质标准物质，首先蛋白质纯化所采用的亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期7方法应是常规、简单和公认的方法。纯化蛋白质的一般步骤包括蛋白质的粗提取，对目标蛋白质进行分离、浓缩和稳定化，去杂质及后期纯化。理想的蛋白质分离纯化方法，需要在保持蛋白质生物活性的前提下，达到蛋白质标准物质的纯度要求14-16。我国目前在蛋白类标志物标准物质制备方面存在原料来源有限、依赖进口、不易获得、价格高、不稳定，且保存条件苛刻的问题，常导致原料缺乏从而严重影响这类临床急需的蛋白类标志物标准物质的研制与应用。2.2 高准确度蛋白定值为使临床检验标准物质的定值结果溯源到SI单位，需要采用正确的技术方法确定其特性值并评定测量不确定度17，即根据标准物质的等级选择相应的测量方法和具体的测量方案如参考国际推荐赋值方案，通过深入研究建立包括试剂配制、样本制备、仪器校准、测试次数、测量方法和数据分析等一整套优化的定值方法。蛋白质是生物大分子物质，其分子量大，结构复杂，存在形式多样，以及低丰度蛋白质的纯化富集效率，水解或酶解程度等因素影响，都会增加准确定值难度。同时，一些蛋白类存在个体差异明显的翻译后修饰，也会影响测定的准确性。对于纯蛋白质，常规的蛋白定值方法主要包括氨基酸分析、凯氏定氮法、纯度扣除法等，但这些方法的准确度难以满足计量要求。目前对于蛋白类标志物标准物质的定值方法包括同位素稀释质谱法、质量平衡法、定量核磁法、国际标准物质比对定值法等15，但需要通过大量调研和实验筛选确定测试系统，或者建立协作实验室网络采用权威方法定值。2.3 蛋白质精准表征蛋白质是非常复杂的生物大分子，可用来表征的特征参数很多，如分子量（质量检定）、一级/二级结构、N-末端/C-末端及糖蛋白分型（结构鉴定）、生物活性（生物学功能鉴定）、抗原抗体反应（免疫学鉴定）等。蛋白质鉴定的第一步往往是测定其分子量，分子量的正确与否预示着该多肽或蛋白质一级结构是否正确。质谱技术为快速准确获得蛋白质一级结构信息提供了快速准确的检测手段。圆二色（circular dichroism，CD）光谱可以定量估计蛋白质在溶液状态下的各种二级结构（如-螺旋、-折叠和无规卷曲等）。X光散射技术和核磁共振则可提供蛋白质的三维结构信息，这可能有助于理解蛋白质的生物学功能。当前，蛋白质活性计量的突破主要集中在酶催化活性浓度计量技术及免疫亲和活性浓度计量技术，其测量结果可以溯源到SI单位16。此外，可采用小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）阻断、免疫荧光共定位法、蛋白酶消化、蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western blot（WB）18、分子排阻色谱(size exclusion chromatography，SEC)19等对蛋白质进行表征，但siRNA阻断技术难度较高，且得到的结果不够直观；免疫荧光共定位法容易出现假阳性结果；蛋白酶消化容易操作，但缺乏选择性，只能作为辅助手段使用；分析选择性蛋白质则可以使用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和WB技术，但是这些技术一般仅限于分析少数单个蛋白质，且无法确定蛋白质的表达水平。近些年来，质谱技术的发展极大地推进了蛋白质表征20-22，电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、同位素稀释液相色谱-串联质谱（Isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-ID-MS/MS）等能够直接表征蛋白质，但糖蛋白的鉴定和综合表征通常需要多种互补的质谱方法，包括完整的蛋白质分析、自上而下的分析以及与专业液相色谱结合使用的自下而上的方法23。另外，蛋白质氨基酸的测序主要依赖Edman降解法等部分短序列测定技术，效率低，成本高，加之蛋白质翻译后修饰的肽段丰度低，酶解产生过长或过短的肽段因质谱无法鉴定识别导致这类肽段序列测定覆盖度及效率低下，从而限制了对蛋白质的全长测序。亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期83 蛋白类标志物标准物质研制方案标准物质研制流程通常包括可行性研究、方案设计、原料采集和制备、定值和数据处理等方面，需要确定原材料来源、制备方式和制备单位、检验项目和标准、协作标定的方案和参与实验室、数据统计和申报等相关内容2。国际物质量咨询委员会（Consultative Committee on the Quantity of Material，CCQM）于2001年确定的蛋白质计量研究内容包括蛋白质定量、相对分子质量、蛋白质功能、生物学活性，以及蛋白质的高级结构等16。针对国内临床检验蛋白类标志物标准物质原料获取困难，进口依赖度大，国产创新能力不足的现状，可考虑从下述两方面入手加以解决：一方面从组织直接提取，这是目前获取蛋白质的主要来源之一；另一方面，可从来源简单、经济成本低的酵母入手。研究发现，真核细胞系统目标蛋白折叠以及翻译后修饰更为完善，蛋白表达更为稳定，而酵母是表达重组真核蛋白的绝佳系统，内源和异源蛋白质都可以在酵母中表达24。Blanchet等用纯化的酵母成分组装了一个体外翻译系统，来重现蛋白质合成的起始和延伸阶段，该系统利用非结构化模型mRNA，克服了对mRNA封盖和辅助帽结合蛋白的要求25。鉴于以上研究，可综合考察适用于人源蛋白表达的酵母系统，昆虫细胞以及哺乳动物细胞表达体系的培养周期、表达含量、蛋白活性、杂质干扰和经济成本等因素，基于现有的研究基础尝试构建酵母培养蛋白体外精准表达系统，诱导表达大量有功能活性的蛋白，以满足标准物质研制的种类和性能要求，解决标准物质制备的原料问题。此外，在实际制备标准物质时，也可选择某些特定的或人工合成的材料，以消除测量时因标准物质基体差异而产生的影响。近十年来，同位素稀释质谱法已广泛应用于蛋白类标志物标准物质准确定值研究，如使用同位素稀释质谱法测定C肽和使用液相色谱-串联质谱（Liquid chromatoqraphy）进行血浆淀粉样蛋白定量26。根据我国计量法和一级标准物质研制技术规范与相关技术文件要求，对于蛋白类一级纯度标准物质，通常采用质量平衡法和差示扫描量热法两种不同原理方法进行联合定值；对于部分热稳定性较差的蛋白质一级标准物质定值，用定量核磁方法替代差示扫描量热法，从而实现SI单位溯源，并完成不确定度评估。目前使用的各种方法中，基于酸水解的定值方法被认为是最直接的方法之一，可广泛应用于能溯源到SI单位的蛋白质定值27。至于酶切效率影响蛋白质含量测定准确度的问题，可使用同位素标记蛋白质作内标，由于标记蛋白与天然蛋白的结构一致，故也认为酶切效率相同。上述方法已成功应用于牛血清白蛋白（7%溶液）、人血管紧张素、人心脏肌钙蛋白复合物、C反应蛋白溶液和肌钙蛋白等蛋白类标志物标准物质研制时的蛋白准确定值。在糖蛋白分型研究中，质谱方法最为常用。应用于自下而上的糖肽研究时，质谱方法通常只能提供组成水平上的糖基化信息，但也可以通过揭示氨基酸序列和糖基附着位点提供位点特异性糖基化信息21。因此，尽管使用去糖基化肽阻碍了对聚糖本身的表征，高通量质谱筛选方法仍被用于识别和确认人血浆中的许多糖基化位点。其中LC-MS/MS与外糖苷酶消化和/或凝集素捕获是深入研究糖基化的一种特别成功的方法组合，已被用于很多蛋白质的研究中。目前，对糖基化结构以及位点的鉴定使用的是超高分辨率的质谱，例如傅里叶变换功能的轨道阱质谱仪。北京蛋白质组研究中心的Lumos轨道阱串联质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos）具备非常高的灵敏性和分辨率，给糖基化修饰及蛋白质特异性糖基化分析提供了新的技术平台，必将推动我国在糖蛋白分型方面的深入研究。不同的表征方法，在可靠性、准确性、使用性、直观性等方面各有优缺点，要根据实际情况进行选择，综合各种常用的蛋白质表征方法，才亮点文章生命科学仪器 2023 第21卷/1期9能得到准确的结论。研究证明，核磁共振对提供聚糖的结构特征是决定性的，但其受到检测条件和所需材料数量的限制，还无法表征复杂样品中存在的多种物种28。针对氨基酸测序问题，可通过从头测序技术，利用高活性耐自消化蛋白质组学专用乙酰化胰蛋白酶和乙酰化赖氨酸精氨酸N端蛋白酶对SDS-PAGE胶内蛋白进行消化，质谱分析后将产生的镜像图谱合并分析碎片离子。基于镜像酶正交切割的互补性，实现碎片离子的全覆盖，完成蛋白的全蛋白测序，以完成蛋白质的精准表征。4 小结与展望自从1960年末国外开始全面推出临床检验标准物质起，在这距今60多年时间里，国内外学者从研制已知化学组成的纯标准物质，到含不同基体的分析标准物质，从研制一般的无机和有机成分的实物标准物质，到化学组成尚未充分认识的具生物活性的酶和蛋白类标准物质及核酸标准物质，在此临床检验领域的不同方向研究取得了长足发展与巨大的进步。但是，目前已有标准物质种类与日常1000多种临床检测项目相比，差距是显而易见的，标准物质缺口太大，远远不能满足市场及监督检验的需求。因此，临床检验标准物质的研制工作任重而道远。攻克临床检验蛋白类标志物标准物质制备、分离纯化、准确定值、精准表征等技术难题，解决原料国产化问题，研制可溯源至SI单位的临床急需的高等级蛋白类标志物（如肿瘤标志物、代谢性疾病标志物、心脏标志物等）标准物质，建立完善的量值溯源体系（含参考实验室网络），打牢我国临床检验结果互认基础，是目前临床检验标准物质研制的重点与难点。此外，我国目前通过CNAS认可的临床检验标准物质研制生产、检验检测的实验室多为医疗机构、科研院所以及企业自建运行的实验室。因工作性质、行业竞争等原因，各实验室间协调意识不强，配合度不高，不能很好地在标准物质研制中发挥协同攻关的作用。国家应在不断加大政府资金投入的基础上，动员社会各级力量，积极推动检验医学、计量学及行业监管等部门联动发展，进一步完善包括参考测量程序、参考物质以及参考实验室在内的参考测量系统，快速有效地缩小我国临床检验领域与国际发达国家先进水平之间的差距。参考文献 1丁敏,孟娇然,夏娃.血清中乳酸标准物质的研制J.中国测试,2022,48(8):60-67.2丁敏.临床检验标准物质现状及研制方法J.上海计量测试,2021,48(6):2-5.3COBBAERT C,SMIT N,GILLERY 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