微酸次氯酸溶液的杀菌效果评价.pdf

养殖与饲料2 0 2 3 年第9 期微酸次氯酸溶液的杀菌效果评价孙冰清1,张妤1,姜芹1,郭书萌,宋洪友,方雅红1,张文刚1,顾欣1*1.上海市动物疫病预防控制中心，上海2 0 110 3;2.上海宇伯梓生物技术有限公司，上海2 0 17 0 7摘要【目的评价研制的微酸次氯酸溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的杀菌效果，并初步确定该溶液作为消毒剂使用的最佳浓度及时间，为本品的后续研发及申报新兽用消毒剂提供参考依据。方法采用电解法制备微酸性次氯酸溶液，有效氯含量为6 2 5 mg/L,pH6.3。采用中和剂鉴定试验及悬液定量杀菌试验，评价该次氯酸溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌的杀菌效果。结果)中和剂鉴定试验表明,5 g/L硫代硫酸钠对微酸次氯酸溶液具有良好的中和作用,且中和剂及中和产物对试验菌的生长无显著影响。在悬液定量杀菌试验中，10 mg/L次氯酸溶液作用1min时，对悬液内大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的杀灭率可达到100%,对白色念珠菌无明显杀灭作用；5 0 mg/L次氯酸溶液作用3 min对白色念珠菌的杀菌率可达10 0%。结论该微酸次氯酸溶液对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白色念珠菌均有良好的杀灭效果，初步确定溶液作为消毒剂的最低使用质量浓度为5 0 mg/L,作用时间不低于3 min。关键词微酸次氯酸；兽用消毒剂；杀菌效果；大肠埃希菌；金黄色葡萄球菌；白色念珠菌；杀菌时间Evaluation of bactericidal effect of hypochlorous acidSUN Bingqing,ZHANG Yu,JIANG Qin,GUO Shumeng,SONG Hongyou,FANG Yahong,ZHANG Wengang,GU Xinl*1.Shanghai Animal Disease Prevention and Control Center,Shanghai 201103,China;2.Shanghai Uberty Bio-Technology Co.,Ltd.,Shanghai 201706,ChinaAbstract Objectives To evaluate the bactericidal effect of the newly developed hypochlorous acidsolution on Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Candida albicans,and to preliminarily determinethe concentration and time of the solution as a disinfectant.It will provide a basis for the subsequentresearch and development of this product and the application of a new veterinary disinfectant.MethodsThe hypochlorous acid solution was prepared by electrolysis,with an effective chlorine content of 625mg/L and a pH of 6.3.The bactericidal effect of the hypochlorous acid solution on Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Candida albicans was evaluated by neutralizer identification test and suspen-sion quantitative bactericidal test.Results The results of neutralizing agent identification test showedthat 5 g/L sodium thiosulfate had a good neutralizing effect on the hypochlorous acid solution,and theneutralizing agent and the neutralizing product had no significant effect on the growth of bacteria test-收稿日期：2 0 2 3-0 3-2 4基金项目：上海市2 0 2 0 年度“科技创新行动计划（2 0 3 92 0 0 2 6 0 0）作者简介：孙冰清，女，1991年生，硕士，畜牧师。*通信作者：顾欣，男，196 9年生，硕士，研究员。2ed.When 10 mg/L hypochlorous acid solution in the quantitative bactericidal test of suspension wasapplied for 1 min,the killing rate of Escherichia coli and Staphylococcus aureus in suspension reached100%,but there was no obvious killing effect on Candida albicans.The bactericidal rate of Candida al-bicans treated with 50 mg/L hypochlorous acid solution for 3 min reached 100%.Conclusions Thehypochlorous acid solution has a good killing effect on Escherichia coli,Staphylococcus aureus andCandida albicans.It is preliminarily determined that the minimum concentration of the hypochlorousacid solution as a disinfectant is 50 mg/L,and the action time is not less than 3 minutes.Keywords hypochlorous acid;veterinary disinfectant;bactericidal effect;E.coli;Staphylococcus au-reus;Candida albicans;sterilization time养殖与饲料2 0 2 3 年第9 期含氯消毒剂广泛应用于医疗、畜牧、农业、水产和公共卫生等领域，合理使用消毒剂进行畜禽圈舍消毒十分重要。传统的含氯消毒剂主要以次氯酸盐(CIO-)的形式存在,对仪器设备有腐蚀作用,刺激性强。而微酸次氯酸消毒剂作为一种新型的含氯消毒剂，具有杀菌力强、效果可靠、使用安全且对环境友好等特点 ,在较低浓度条件下仍具有良好的杀菌活性3 。次氯酸水溶液有效氯的主要存在形式是次氯酸(HCIO),在相同的处理条件下,HCIO对大肠埃希菌的杀菌效果是等效浓度C1O-的8 0 倍以上 4-6,且急性吸入毒性试验及皮肤刺激性试验均无异常,证明了次氯酸水溶液的安全性 7-8。本试验以一种新研发的微酸次氯酸溶液为研究对象，参照抗菌和抑菌效果评价方法消毒剂实验室杀菌效果检验方法 9-10 ，设计了中和剂鉴定试验及悬液定量杀菌试验，对研制的微酸次氯酸溶液的杀菌效果进行测试，初步确定该溶液作为消毒剂使用的推荐浓度及作用时间，为本产品的后续研发及申报新兽用消毒剂提供依据。1材料与方法1.1 试验材料试验采用电化学技术制备，对氯化钠溶液进行电解,生成微酸次氯酸电解水,经测定,有效氯含量为6 2 5 mg/L,pH值为6.3，批号为2 0 2 1112 0。试验菌株为金黄色葡萄球菌（CMCC26003）、白色念珠菌(CMCC 98001)和大肠埃希菌（CMCC 44102),购自中国医学细菌保藏管理中心。营养琼脂培养基、沙氏琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司，氯化钠、硫代硫酸钠购自国药集团。1.2试验仪器微酸次氯酸发生器购自丹麦DCW公司;Den-siCHEKPlus比浊仪购自生物梅里埃公司，细菌培养箱购自普和希PHCbi，恒温水浴锅购自德国WIGGENS,pH计购自 METTLER TOLEDO。1.3试验方法1)菌悬液制备。将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌接种于营养琼脂培养基,置于3 5 培养;将白色念珠菌接种于沙氏琼脂培养基,置于2 5 培养,取24h新鲜培养物用生理盐水洗下，使用比浊仪调整菌液浓度。2)中和剂鉴定试验。将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌悬液稀释至5.0 10 4.510cfu/mL,次氯酸消毒剂稀释到10 0 mg/L进行试验。选择5 g/L硫代硫酸钠作为中和剂，按照WS/T6502019抗菌和抑菌效果评价方法中和剂鉴定试验进行，试验分4 组进行操作（表1)。试验重复3 次，每次试验均符合以下要求：以第1、2、3组有相似量试验菌生长，第4 组无菌生长，组间菌落数误差率不超过15%。3悬液定量杀菌试验。试验组。分别以金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌为试验菌，制备菌悬液使其浓度为1104510cfu/mL。使用无菌水将样品的质量浓表1中和剂鉴定试验分组组别操作第1组5.0mL中和剂+0.1mL菌悬液一培养第2 组(0.5mL消毒剂+4.5 mL中和剂)+0.1mL菌悬液一培养第3 组5.0mL稀释液+0.1mL菌悬液培养第4 组稀释液+中和剂+培养基一培养养殖与饲料2 0 2 3 年第9期度分别稀释至2 0 0、10 0、5 0、10 mg/L，取无菌试管，先加入5.0 mL样品稀释液，置（2 0 1）水浴锅中5min后加入0.1mL试验用菌悬液,迅速混匀并立即计时使试验菌与样品相互作用，设置4 个时间梯度（1、3、5、10 min）,作用至预定时间后，分别吸取0.5mL混合液加人4.5 mL中和剂中，混匀得到中和产物,分别吸取1.0 mL中和产物,按照平皿法进行活菌计数，每组中和产物做2 个平行。对照组。使用无菌水代替消毒液进行平行试验,作为阳性对照。取同批次中和剂、培养基作阴性对照。所有试验样本及对照样本均置于3 6 培养，金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌培养2 4 h观察结果，白色念珠菌培养7 2 h观察结果。1.4杀菌率计算重复进行3 次悬液定量杀菌试验，以3 次结果的平均值计算杀菌率。杀菌率=（阳性对照组回收菌量一试验组回收菌量）/阳性对照组回收菌量10 0%。2结果与分析2.1中和剂鉴定试验分别使用3 种试验菌进行中和剂鉴定试验，由作用时样品质量间/min浓度/(mg/L)2001001501020010035010200100550102001001050103表2 可知,第1组、第2 组和第3 组试验菌生长情况一致，第4 组均无菌生长，组间误差在2.9%7.9%,均小于15%。3 次重复试验表明，硫代硫酸钠(5g/L)作为中和剂可以有效中和微酸次氯酸溶液，且中和剂、中和产物对菌悬液均无显著影响。表2 中和剂鉴定试验结果平均回收菌落数/cfu组别大肠埃希菌金黄色葡萄球菌第1组21 800第2 组22.000第3 组22.700第4 组02.2悬液定量杀菌试验结果悬液定量杀菌试验结果表明，当微酸次氯酸溶液中有效氯含量为10 mg/L时，室温作用1min对大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的杀灭菌可达10 0%,对白色念珠菌无明显杀灭作用；作用10 min对白色念珠菌的杀菌为98.6%，未达到较强抗菌作用；当微酸次氯酸溶液中有效氯含量为5 0 mg/L时,作用3 min后对白色念珠菌的杀菌率可达10 0%；当微酸次氯酸溶液中有效氯含量超过10 0 mg/L时，作用1min即可实现对白色念珠菌10 0%的杀灭率（表3、表4)。表3 微酸次氯酸溶液对细菌及真菌杀菌效果细菌测试菌测试后菌落浓度/(cfu/mL)总数/(cfu/mL)00310600003x106000031060000310600白色念珠菌21 20048 90022 60047 60021 40048 10000真菌杀菌测试菌率/%浓度/(cfu/mL)100100100100100100100100100100100100100100100100测试后菌落总数/(cfu/mL)001x104463多不可计001x104052000110403500011040138杀菌率/%100.0100.095.4一100.0100.0100.094.8100.0100.0100.096.5100.0100.0100.098.64表4 微酸次氯酸溶液对细菌及真菌的最短作用时间min有效氯质量浓度/（mg/L）大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌2001005010据此初步确定次氯酸溶液作为消毒剂的最低使用质量浓度为5 0 mg/L，作用时间不低于3 min。3 讨 论次氯酸与微生物及有机物作用后还原成水,在反应过程中不产生氢氧化物，不会对皮肤产生刺激、损害,也不会对环境造成污染!,因此,次氯酸水溶液可作为一种新型的消毒剂，广泛应用于各领域。本试验采用电化学技术，使用无隔离膜的电解室电解氯化钠水溶液制备微酸性次氯酸水，制备的次氯酸溶液为无色透明非黏性液体，主要成分为次氯酸,有效氯含量为6 2 5 mg/L,pH值为6.3。略呈氯臭，具有微酸性、无腐蚀性的特点，可用于养殖场的环境、设施、人员、车辆等的消毒，对环境具有一定的除臭效果,生产原料仅为水和氯化钠,生产成本仅为常规化学消毒剂的1/3,具有良好的市场前景。为了评价次氯酸溶液对微生物的杀灭作用,本研究设计了中和剂鉴定试验及悬液定量杀菌试验。中和剂鉴定试验表明,硫代硫酸钠可有效中和次氯酸溶液,且中和剂、中和产物对菌悬液均无显著影响。因此,5 g/L的硫代硫酸钠可应用于悬液定量杀菌试验。悬液定量杀菌试验表明，当次氯酸溶液的有效氯浓度达到10 mg/L时，可有效杀灭大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌；当次氯酸溶液的有效氯浓度达到5 0mg/L且作用3 min以上时,可有效杀灭白色念珠菌。说明该次氯酸溶液具有良好的杀菌能力,并初步确定该溶液作为消毒剂使用的最低浓度为5 0 mg/L,作用时间不低于3 min。O k a n d a 等3 也证实了3 0 mg/L次氯酸水溶液作用10 min可以有效去除生物膜和杀灭铜绿假单胞菌,效果优于传统消毒剂,且当次氯酸水溶液的质量浓度只有10 mg/L时,消毒杀菌效果也是可观的。有研究表明,对畜禽舍内次空气、仪器设备、动物表面、通道等地方进行消毒时，发现次氯酸水溶液的消毒效果优于聚维酮碘,对动物的影响更小 2-13。消毒种蛋时,15 0 mg/L次氯酸水和1 0 0 0 mg/L的养殖与饲料2 0 2 3 年第9 期苯扎嗅按溶液作用18 0 s的消毒效果相同,对种蛋没有显著性影响 4。本研究制备的次氯酸水溶液可用于畜禽养殖过程中的环境、设备、人员等消毒，下一步将11111111333一继续深人开展次氯酸水溶液对畜禽环境消毒效果的评价,以综合评估本消毒剂的杀菌能力。参考文献1张向阳,张靖菊,陈晨,等.一种新型次氯酸消毒剂的杀菌效力评价.中国兽医杂志,2 0 2 2,5 8(8):5 9-6 3,6 8.2王莉,吴政文,丁小明.次氯酸杀菌技术及其在农业生产中的应用前景 J.农业工程技术(温室园艺),2 0 10(11):3 4-3 6.3OKANDA T,TAKAHASHI R,EHARA T,et al.Slightly acidicelectrolyzed water disrupts biofilms and effectively disinfectsPseudomonas 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