三阴性乳腺癌患者ASH2L、HOXA2表达及其与淋巴转移的关系.pdf

574检验医学 2023 年 6 月第 38 卷第 6 期 Laboratory Medicine，June 2023，Vol.38，No.6三阴性乳腺癌患者 ASH2L、HOXA2 表达及其与淋巴转移的关系陈琛1段奇1陆佳团1翟晓建1王征1张浩1郭满2（1.南阳市中心医院乳腺科一病区，河南 南阳 473000；2.南阳市中心医院甲状腺科，河南 南阳 473000）摘要：目的 探讨三阴性乳腺癌（TNBC）患者ASH2样蛋白（ASH2L）和同源异型盒A2（HOXA2）的表达及其与淋巴转移的关系。方法 选取2016年6月2020年6月南阳市中心医院TNBC患者80例，收集其癌组织样本；另收集60例配对癌旁组织（距肿瘤边缘5 cm）样本作为对照。收集所有患者的临床病理资料，并检测ASH2L、HOXA2 mRNA和蛋白的表达。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA判断TNBC患者淋巴转移的效能。结果 癌组织中ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量和蛋白阳性率均显著高于癌旁组织（P0.05）。有淋巴转移、TNM分期期的TNBC患者癌组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白阳性率分别显著高于无淋巴转移和TNM分期期的患者（P0.05）。有淋巴转移的TNBC患者癌组织中ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量显著高于无淋巴转移的患者（P0.05）。ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA单项检测和联合检测诊断TNBC患者淋巴转移的曲线下面积（AUC）分别为0.706、0.791、0.895。结论 TNBC患者癌组织中ASH2L、HOXA2 mRNA和蛋白均呈高表达，且与TNM分期和淋巴转移有关。关键词：ASH2样蛋白；同源异型盒A2；淋巴转移；三阴性乳腺癌Expressions of ASH2L and HOXA2 in triple-negative breast cancer patients and their relationship with lymph node metastasis CHEN Chen1，DUAN Qi1，LU Jiatuan1，ZHAI Xiaojian1，WANG Zheng1，ZHANG Hao1，GUO Man2.（1.Ward 1，Department of Breast，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，Henan，China；2.Department of Thyroid，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，Henan，China）Abstract：Objective To investigate the expressions of ASH2-like protein（ASH2L）and homeobox A2（HOXA2）in triple-negative breast cancer（TNBC）patients and their relationship with lymph node metastasis.Methods A total of 80 TNBC patients from Nanyang Central Hospital from June 2016 to June 2020 were enrolled，and their cancer tissue samples were collected.Totally，60 paired cancer adjacent tissue samples（5 cm from the edges of the tumors）were collected as controls.The clinical and pathological data were collected，and the expressions of ASH2L，HOXA2 mRNA and proteins were determined.The efficacy of ASH2L mRNA and HOXA2 mRNA in determining lymph node metastasis in TNBC patients was evaluated by receiver operating characteristic（ROC）curve.Results The relative expression levels of ASH2L mRNA，HOXA2 mRNA and protein positive rate were higher in cancer tissues than those in adjacent tissues（P0.05）.The positive rates of ASH2L protein and HOXA2 protein in cancer tissues of TNBC patients with lymph node metastasis and TNM stage-were higher than those of TNBC patients without lymph node metastasis and TNM stage-（P0.05）.The relative expression levels of ASH2L mRNA and HOXA2 mRNA in cancer tissues of TNBC patients with lymph node metastasis were higher than those without lymph node metastasis（PC（NM_006735.4），ID为3199；ASH2L的转录本为ASH2L c.1726AG（p.Ile576Val）（NM_004674.5），ID为9070。反应条件：95 3 min；95 30 s，59 30 s，72 40 s，38个循环；72 5 min。采用2-Ct法计算HOXA2 mRNA、ASH2L mRNA的相对表达量。表1引物序列基因名称正向引物（53）反向引物（53）HOXA2TTCAGCAAAATGCCCTCTCTTAGGCCAGCTCCACAGTTCTASH2LTAGCTGCCACGGAGACGCCGGAGGATTTACAGTCGGGAT-actinAATCCTCCGTGACATTAACGAGACTGTGTTGGCGTACAGCTCTT1.2.2 癌组织和癌旁组织中HOXA2蛋白和ASH2L蛋白表达的检测采用免疫组化法检测HOXA2蛋白和ASH2L蛋白表达。将癌组织和癌旁组织用石蜡包埋，以4 m厚度切片，脱腊，修复抗原，3%H2O2浸泡10 min，使内源性过氧化氢酶失活，加入兔抗人HOXA2、ASH2L多克隆抗体（货号分别为HPA078220、HPA042289，美国Sigma公司），室温下孵育1 h，4 过夜，用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液清洗1次，加入EnVision试剂孵育 576检验医学 2023 年 6 月第 38 卷第 6 期 Laboratory Medicine，June 2023，Vol.38，No.620 min，用苏木素复染，脱水、封片，采用CX23型显微镜（济南泰医生物技术有限公司）观察染色结果。由2位病理科副主任医师进行结果判定。HOXA2蛋白、ASH2L蛋白染色阳性均为细胞核或细胞质出现棕黄色颗粒。随机选取10个高倍镜视野（200），每个视野计数100个细胞，根据染色程度和阳性细胞百分比评估染色结 果7。染色程度：未着色为0分，浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分。阳性细胞百分比5%为0分，6%25%为1分，26%50%为2分，51%75%为3分，75%为4分。最终结果为染色程度评分与阳性细胞百分比评分的乘积，以6分为阳性，4分为阴性。1.3 统计学方法采用SPSS 25.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以xs表示，2个组之间比较采用t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用2检验。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA判断TNBC患者淋巴转移的效能。以P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 癌组织和癌旁组织ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量比较癌组织ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量均显著高于癌旁组织（P0.05）。见表2。（P0.05）。见表4。表2癌组织和癌旁组织ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量比较组别例数ASH2L mRNAHOXA2 mRNA癌组织801.620.431.410.39癌旁组织601.000.241.010.25t值10.050 6.943P值0.0010.001注：空白表示无此项。表3癌组织和癌旁组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白阳性比较组别例数ASH2L蛋白阳性/例（%）HOXA2蛋白阳性/例（%）癌组织8062（77.50）50（62.50）癌旁组织6012（20.00）9（15.00）2值45.49131.726P值0.0010.001注：空白表示无此项。（a）（b）注：（a）癌组织；（b）癌旁组织。图1癌组织和癌旁组织ASH2L蛋白表达比较（200）（a）（b）注：（a）癌组织；（b）癌旁组织。图2癌组织和癌旁组织HOXA2蛋白表达比较（200）2.2 癌组织和癌旁组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白阳性比较癌组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白阳性率显著高于癌旁组织（P0.001）。见表3、图1、图2。2.3 癌组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白表达与TNBC患者临床病理特征的关系有淋巴转移、TNM分期期的TNBC患者癌组织ASH2L蛋白、HOXA2蛋白阳性率分别显著高于无淋巴转移和TNM分期期的患者2.4有无淋巴转移TNBC患者之间癌组织ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量比较有淋巴转移的TNBC患者癌组织中ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量均显著高于无淋巴转移的患者（P0.05）。见表5。2.5 ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA单项和联合检测判断TNBC患者淋巴转移的效能ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA单项和联合检测（以2项指标中任意1项高于最佳临界值为阳性）诊断TNBC患者淋巴转移的曲线下面积（area under curve，AUC）分别为0.706、0.791、0.895。联合检测的AUC高于单项检测（Z值分别为2.701、1.710，P0.05）。见图3、表6。577检验医学 2023 年 6 月第 38 卷第 6 期 Laboratory Medicine，June 2023，Vol.38，No.6表4不同临床病理特征TNBC患者癌组织ASH2L 蛋白、HOXA2蛋白阳性率比较临床病理特征例数ASH2L蛋白阳性/例（%）HOXA2蛋白阳性/例（%）年龄 40岁3932（82.05）24（61.54）40岁4130（73.17）26（63.41）2值0.9040.030 P值0.3420.862肿瘤大小 5 cm3223（71.88）23（71.88）5 cm4839（81.25）27（56.25）2值0.9682.000 P值0.3250.157淋巴转移 无2713（48.15）5（18.52）有5349（92.45）45（84.91）2值20.13633.636 P值0.0010.001TNM分期 期2916（55.17）8（27.59）期5146（90.20）42（82.35）2值13.00523.659 P值0.0010.001绝经状态 未绝经3428（82.35）24（70.59）绝经4634（73.91）26（56.52）2值0.7991.650 P值0.3720.199注：空白表示无此项。表5有无淋巴转移TNBC患者癌组织ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA相对表达量比较淋巴转移情况例数ASH2L mRNAHOXA2 mRNA有531.700.451.490.40无271.470.391.260.36t值2.2572.513P值0.0270.014注：空白表示无此项。表6ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA单项和联合检测判断TNBC患者淋巴转移的效能项目AUC（95%CI）最佳临界值敏感性/%特异性/%Youden指数ASH2L mRNA0.706（0.5880.825）1.6075.2069.100.443HOXA2 mRNA0.791（0.6950.887）1.3880.5071.300.518联合检测0.895（0.8240.966）73.5090.200.637注：CI为可信区间（confidence interval）；空白表示无此项。控10。有研究结果显示，子宫内膜癌11、急性髓系白血病12患者ASH2L表达升高，在肿瘤进展中起重要作用。本研究结果显示，TNBC患者癌组织中ASH2L mRNA相对表达量和蛋白阳性率均高于癌旁组织（P0.05），与孙超等13 的研究结果一致，提示ASH2L过表达可能与TNBC发生有关。进一步的研究结果显示，有淋巴转移、TNM分期期的TNBC患者癌组织ASH2L蛋白阳性率分别显著高于无淋巴转移和TNM分期期的患者（P0.05）。提示ASH2L蛋白可能与TNBC的疾病进展有关。本研究结果还显示，有淋巴转移的TNBC患者癌组织ASH2L mRNA相对表达量显著高于无淋巴转移注：ASH2L mRNA；HOXA2 mRNA；联合检测；参考线。图3ASH2L mRNA、HOXA2 mRNA单项和联合检测判断TNBC患者淋巴转移的ROC曲线敏感性1.00.80.60.40.20.01-特异性0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.03 讨论有研究结果显示，淋巴转移是TNBC最重要的独立预后因子，发生淋巴转移的患者更易发生血行转移，预后较差8。因此，寻找提示TNBC淋巴转移的标志物和开发针对淋巴转移患者有效的靶向治疗策略是改善TNBC患者预后的关键。ASH2L编码一种三胸组蛋白，可通过与性别决定区Y框蛋白2（sex-determining region Y-box protein 2，Sox2）和c-Myc蛋白的直接作用，驱动多能性基因的表达，在机制上参与调节细胞的多能和分化状态间的转换9。ASH2L作为多种转录因子的辅助因子，参与了基因转录的调578检验医学 2023 年 6 月第 38 卷第 6 期 Laboratory Medicine，June 2023，Vol.38，No.6的患者（P0.05），ASH2L mRNA判断TNBC患者淋巴转移的AUC为0.706。因此，ASH2L或可作为TNBC发生、发展的生物标志物，但其与患者预后的关系仍需进一步研究。HOXA2基因是HOX簇基因中的一员，编码一种与DNA特异性结合的转录因子，可调节基因的表达，从而影响细胞的形态和分化14。HOXA2在多种恶性肿瘤，如结直肠癌14、前列腺癌15中表达异常，并能影响细胞增殖活性。HOXA2可促进两面神激酶（Janus kinase，JAK）-信号转导及转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路、黏着斑、细胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAMS）通路、胞质DNA传感通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性的激活16。本研究结果显示，TNBC患者癌组织中HOXA2蛋白阳性率和HOXA2 mRNA相对表达量均显著高于癌旁组织（P0.05），且HOXA2蛋白阳性表达与TNBC患者淋巴转移、TNM分期有关（P0.05），与LIU等16的研究结果一致，提示HOXA2表达可能与TNBC发生有关，或可作为判断TNBC发生淋巴转移和TNM分期的重要分子标志物。进一步研究发现，有淋巴转移的TNBC患者癌组织HOXA2 mRNA相对表达量高于无淋巴转移的患者（P0.05），HOXA2 mRNA诊断TNBC患者淋巴转移的AUC为0.791，提示HOXA2可作为评估TNBC患者是否发生淋巴转移的指标。本研究结果还显示，ASH2L mRNA和HOXA2 mRNA联合检测判断TNBC患者淋巴转移的AUC（0.895）高于单项检测（P0.05），提示同时检测ASH2L、HOXA2可能更有利于评估TNBC患者是否会发生淋巴 转移。综上所述，TNBC患者癌组织中ASH2L、HOXA2 mRNA和蛋白均呈高表达，且与TNM分期和淋巴转移有关，但ASH2L、HOXA2与TNBC患者预后的关系尚需进行更深入的研究。参考文献1 李贺，郑荣寿，张思维，等.2014年中国女性乳腺癌发病与死亡分析J.中华肿瘤杂志，2018，40（3）：166-171.2 张馨月，陈亮，郑宇.血清C肽和胰岛素样生长因子结合蛋白3与乳腺癌患者死亡风险相关性分析J.检验医学，2022，37（1）：36-40.3 张韶彤，王素贞，于清溪，等.乳腺癌术后远期复发转移患者临床特征分析J.中华肿瘤防治杂志，2019，26（6）：406-409.4 张密，董倩.三阴性乳腺癌免疫治疗的研究进展J.中国肿瘤，2020，29（8）：614-620.5 WU Y J，LI L X，LIU L，et al.ASH2L-promoted HOXC8 gene expression plays a role in mixed lineage leukemia-rearranged acute leukemiaJ.Onco Targets Ther，2020，13：381-387.6 LIU Z，SHEN F，WANG H，et al.Abnormally high expression of HOXA2 as an independent factor for poor prognosis in glioma patientsJ.Cell 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