免疫组化和荧光步骤修改版.doc

免疫荧光染色（全程避光）
（1） 切片晾干后用0.01mol/LPBS（PH值7.2－7.4）漂洗10min×3次；
（2） 0. 3％Trion-100溶液37℃25min；0.01mol/LPBS漂洗10min×3次；
（3） 滴加5％BSA37℃封闭抗原25min，甩去多余液体，不洗；
（4） 滴加用1％封闭血清稀释的一抗50ul/张，置4℃冰箱40－48hr。PBS洗10min×3次；
（5） 滴加1％封闭血清稀释的荧光二抗羊抗兔，室温下2h；PBS洗5min×2次；晾干，60％甘油封片。

荧光双标步骤同上，仅在滴加一抗和二抗时分别将两种一抗和二抗一起加入。但两种一抗需种属来源不同。
1. 用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min
2. 3 mL/L Triton X-100漂洗10 min。
3. 正常羊血清封闭30 min。
4. 一标一抗兔抗GFAP (北京中杉)孵育液,稀释度为1∶50，37℃孵育1 h,室温过夜（室温24~48 h）。
5. 用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min，
6. 加入FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉)荧光二抗,稀释度为1：50,37℃孵育1 h， 0.01 mol/LPBS洗10×3 min。
7. 捞片, 阴干,甘油封片。

冰冻切片免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)
1. 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
2. 用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3. PBS洗，5分钟×2。
4. 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，5分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7. PBS冲洗，5分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
9. PBS冲洗，5分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，封片。
另外是否做冰冻或者石蜡是有你所要检测的蛋白来决定的，买一抗的时候有要求。如果能做石蜡的话，虽然复杂点，但做出来的组织结构比冰冻的清晰，更好看。
SP法：
1.PBS浸泡5分钟×2，3％甲醇－H2O2 （1份30％H2O2 加9份甲醇）封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟。
2.PBS浸泡5分钟×3，5%正常山羊血清室温封闭10分钟。
3.倾去血清，加入适当比例稀释的一抗，湿盒内4℃冰箱过夜。
4.PBS浸泡，5分钟×3，滴加二抗，37℃孵育，45分钟。
5.PBS浸泡，5分钟×3，滴加SP复合物，37℃孵育，30分钟。
6.DAB显色，使用DAB显色试剂盒，A、B、C液各一滴加入0.85ml蒸馏水中，充分混匀后加至玻片，室温显色10分钟。
7.自来水冲洗，苏木素复染15-30秒，1%盐酸酒精分化，饱和碳酸锂蓝化。
8.常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、DPX封片。

注意：一抗如为浓缩液，需摸索最佳稀释度。每步都重要。冰冻切片不能太厚，10μm以下。能做石蜡切片的最好不做冰冻切片，石蜡切片组织结构好一些。如果还没买试剂盒，建议买中山公司的PV－9000两步法免疫组化试剂盒，按说明书操作，效果很好。

免疫组织化学染色方法（漂染法，以CD11b分子为例）（大脑）
1.冰冻切片0.01M PBS（PH7.4）放置室温下30min ，蒸馏水洗5min ×3 次；
2.3 %过氧化氢液（0.01M PBS）室温孵育30 min ，以清除内源性过氧化物酶，然后用0.01M磷酸盐缓冲液（PBS）液洗10min ×3 次；
3.0.3%的Triton-X100(0.01M PBS， PH7.4)室温孵育30min，0.01MPBS 液洗10min ×3 次；
4.10％小牛血清（0.01M PBS， PH7.4）封闭3h，不洗；
5.加入第一抗体（纯化的大鼠抗小鼠CD11b单克隆抗体1∶75) 4℃孵育过夜；
6.0. 01M PBS 液震荡漂洗10min ×3 次；
7.加入第二抗体（生物素标记的抗大鼠IgG/Bio 1:400），室温震荡孵育3h；
8. 0.01MPBS 液洗10min ×3次；
9.加链酶亲和素－生物素－过氧化物酶复合物(AB复合物1：400)室温下3h；
10.0. 01M PBS液洗10min ×3 次；
11.用底物液为0.05%二氨基联苯胺和0.03％ H2O2（0.01M PBS, PH7.4）混和液，避光显色1～10min，边观察边反应，适时用0.01M PBS快速终止反应。
12.明胶裱片、晾干。
13.上行梯度酒精脱水（70%、85%、95%、100%、100%）各5分钟；
14.二甲苯透明，中性树胶封片、晾干，光学显微镜下观察。
阴性对照以0.01M PBS代替一抗，余同。