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实验七  叶绿体的分离与荧光观察

叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的, 由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

实 验 目 的

1. 通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。
2. 观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

实 验 原 理

分离细胞器的常用方法是将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min, 以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间, 有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。

实 验 用 品

一、器材
1.主要设备:   普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材: 500ml烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料     新鲜菠菜。
三、试剂     0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

实  验  方  法

一、叶绿体的分离与观察

新鲜的嫩菠菜叶
↓
洗净擦干去除叶梗脉
↓
取30克放入150ml氯化钠溶液
↓
入组织捣碎机匀浆
↓
      低速匀浆（5000r/min）3~5min（破碎细胞）
↓
匀浆液
                    ↓6层纱布过滤，取4ml
                 1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞）
         ↓取上清
3000r/min离心5min
↓保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体）
用氯化钠溶液悬浮
 ↓
光学显微镜下观察

二、菠菜叶手切片观察
新鲜菠菜叶
↓
刀片切出一斜面置于载玻片上
↓
滴加1~2d氯化钠溶液
↓
盖上盖片显微镜下观察

实 验 结 果

一、叶绿体的分离和观察
1. 普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2. 以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。
3. 加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。

二、菠菜叶手切片观察
1. 在普通光镜下可以看到三种细胞  (1)表皮细胞: 为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞: 为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞: 为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2. 在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱, 气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3. 用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光, 气孔仍为绿色。

作    业

1. 根据荧光观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。
2. 概述滤镜系统的选用原则。

思  考  题

1. 叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？
   答：一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
在分离叶绿体时应注意操作要迅速，控制好离心速度和时间。同时弃上清时不要把沉淀荡起，再次加氯化钠溶液时应用胶头滴管吹匀混合液，力气不能过大，以免造成叶绿体破碎。最后一次加氯化钠溶液时应少加，以免所得叶绿体的浓度太小，不易观察到。
2. 普通光学显微镜与荧光显微镜有何异同点？
答：相同点：1）均为光学显微镜；2）均可对生物样品进行定性和定量分析。
不同点：1）二者所用光源不同：普通光学显微镜用的是自然光，而荧光显微镜则多为紫外光；2）荧光显微镜含有一套特殊的滤镜系统；3）荧光显微镜还具有灵敏度高、特异性强等特点；4）荧光显微镜只能使用无荧光载玻片和无荧光油等。

基复合体一般都位于细胞核附近；而高等植物中高尔基体弥散于整个细胞中，不集中。