感受态的制备方法.doc

感受态制备方法
二、实验过程：
1.感受态溶液的制备（过滤除菌）（500ml体积）
Tfb1： KAC 30mol/l 98.14 1.4721g
Kcl 100mol/l 74.55 3.7275g
CaCl2 10mol/l 110.99 0.55495g
Mncl2 50mol/l 197.91 4.94775g
甘油 15% 75ml
PH：5.8
Tfb2： Tris-cl（Base） 10mol/l 121.14 0.6057g
CaCl2 10mol/l 110.99 0.55495g
Kcl 10mol/l 74.55 0.37275g
甘油 15% 75ml
PH：6.5
2.培养基的制备（高压灭菌）
SOB培养基（1L）
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
Nacl 1mol/l 0.5g
Kcl 1mol/l 2.5ml需单独配置成溶液在加入培养集中
高压灭菌后，每100ml中加入1ml灭过菌的1mol/l的Mgcl2（203.3）溶液
三、制备感受态的操作步骤
1. 实验前准备：冰水，冰盒，10ml移液管，1.5ml灭菌的EP管，100ml量程的移液器，50ml无菌离心管，将所有要用的东西放入-20℃内遇冷。
2. 实验步骤：
1. 将甘油保存的菌种（E,coli DH5α）用接种环在无抗性LB平皿上划线，37℃培养过夜
2. 挑取单菌落接至5mlLB无抗性培养基内，37℃培养过夜
3. 以1:20的比例转接菌液至37℃以预热的SOB培养基内，至OD=1（OD值根据不同的感受态情况而定）左右结束培养
4. 将培养后的菌液置于冰水中遇冷5min，分装配平于50ml离心管中，4000g 4℃ 10min
5. 弃上清，用40ml的以遇冷的Tfb1溶液重新悬浮细胞，并置于冰水中5min 4000g 4℃ 10min
6. 弃上清，用4ml 以遇冷的Tfb2溶液重选细胞，并置于冰水中5min：以每管100ml的量分装于1.5ml灭过菌的EP管中，于-80℃内保存
7. 取制备好的感受态2支，一支为空白对照检测是否有污染，另一只转化质粒检测感受态效率