四氯双酚A对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究.pdf

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 18 卷 第 3 期 2023 年 6 月Vol.18,No.3 Jun.2023 基金项目:国家自然科学基金资助项目(42107467,42007341);广州市科技计划项目(202102021014);中央级公益性科研院所基本科研业务专项(PM-zx703-202204-124)第一作者:申泽宇(1996),男,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:#共同通信作者(Co-corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221211002申泽宇,李红艳,韩雅静,等.四氯双酚 A 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究J.生态毒理学报,2023,18(3):357-365Shen Z Y,Li H Y,Han Y J,et al.Effects of tetrachlorobisphenol A(TCBPA)on locomotion behavior of zebrafish larvae and its neurotoxic mechanismJ.Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):357-365(in Chinese)四氯双酚 A 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究申泽宇1,2,李红艳2,韩雅静2,陈晓雯2,唐斌2,党垚2,向明灯2,胡国成2,李廷真1,#,于云江2,*1.重庆三峡学院环境与化学工程学院,重庆 4040002.生态环境部华南环境科学研究所国家环境保护环境污染健康风险评价重点实验室,广州 510655收稿日期:2022-12-11 录用日期:2023-02-25摘要:四氯双酚 A(tetrachlorobisphenol A,TCBPA)作为四溴双酚 A 的替代品被广泛使用导致其在环境中被高频检出,但是目前其对于鱼类的毒性效应及机制还研究较少。本研究以斑马鱼胚胎为研究对象,将其暴露于不同浓度的 TCBPA(0、2、20 和200 g L-1)中 120 h。通过测定斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率、畸形率以及光暗刺激下的运动行为评估 TCBPA 对斑马鱼幼鱼发育的影响;通过检测幼鱼吖啶橙(AO)染色情况、氧化产物丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)含量、抗氧化酶超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase,SOD)活力、神经递质多巴胺(dopamine,DA)含量以及 DA 合成关键基因的转录等方面阐明 TCBPA 对斑马鱼幼鱼的潜在毒性机制。结果发现,TCBPA 在最高剂量组可以增加幼鱼畸形率、降低幼鱼游泳速度,并且伴随着头部发生细胞凋亡、体内DA 含量降低。基因表达结果表明细胞凋亡相关基因p53和bax表达量升高而多巴胺合成相关基因(bdnf,th,dat,drd1和drd2)表达量降低。本研究表明 TCBPA 可能通过诱导细胞凋亡、降低 DA 含量以及影响相关基因的表达从而影响斑马?鱼幼鱼的运动行为,相关结果可以为识别 TCBPA 的生态风险提供直接依据。关键词:四氯双酚 A;斑马鱼;运动行为;细胞凋亡;多巴胺文章编号:1673-5897(2023)3-357-09 中图分类号:X171.5 文献标识码:AEffects of Tetrachlorobisphenol A(TCBPA)on Locomotion Behavior ofZebrafish Larvae and Its Neurotoxic MechanismShen Zeyu1,2,Li Hongyan2,Han Yajing2,Chen Xiaowen2,Tang Bin2,Dang Yao2,Xiang Mingdeng2,Hu Guocheng2,Li Tingzhen1,#,Yu Yunjiang2,*1.School of Environmental and Chemical Engineering,Chongqing Three Gorges University,Chongqing 404000,China2.Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Pollution Health Risk Assessment,South China Institute of Environmen-tal Sciences,Ministry of Ecology and Environment,Guangzhou 510655,ChinaReceived 11 December 2022 accepted 25 February 2023Abstract:Tetrachlorobisphenol A(TCBPA)is widely used as an alternative to tetrabromobisphenol A and has358 生态毒理学报第 18 卷been highly detected in the environment.However,its toxic effects and mechanisms are less studied in fish.In thisstudy,using zebrafish as a study model,embryos were exposed to TCBPA at different concentrations(0,2,20 and200 g L-1)for 120 hours post fertilization(hpf)and the developmental endpoints and locomotion behavior of lar-vae were measured.To explore the potential mechanisms of TCBPA,the acridine orange(OA)staining,the con-tents of malonic dialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD),dopamine(DA)and expression of genes relatedto the cell apoptosis and dopamine signaling pathway were analysed.The results showed that TCBPA significantlydecreased the swimming speed at the maximum exposure concentration,accompanied by a decrease in zebrafishlarvae dopamine content and significant cell apoptosis in brain.Furthermore,the expression of genes related to cellapoptosis(p53andbax)and dopamine signaling pathway(bdnf,th,dat,drd1anddrd2)were significantly changed.Our results demonstrate TCBPA exposure can induce cell apoptosis and decrease the DA content,and subsequentlyaffect the locomotion behavior of zebrafish larvae.Our study can provide direct scientific evidence for identifyingTCBPA risk assessment.Keywords:tetrachlorobisphenol A;zebrafish;locomotion behavior;dopamine;cell apoptosis 四氯双酚 A(tetrachlorobisphenol A,TCBPA)作为四溴双酚 A(tetrabromobisphenol A,TBBPA)的替代品近年来被广泛使用,全球年产量高达 10 000 t1。TCBPA 主要是添加到建材、涂料、合成纤维纺织品、塑料制品、电路板和电子设备中用作阻燃剂,在相关产品的生产和使用过程中释放到环境中,而且由于TCBPA 在环境介质中可以持久存在并且具有很强的疏水性,所以其在环境中被频繁检出,对环境中各种生物体包括人类产生极大的影响2-3。有研究报道在加拿大某工厂的废水处理污泥中发现 TCBPA浓度为 0.14 0.54 ngg-1;日本静冈县造纸工厂的废水中检测到 TCBPA 的浓度可达 2 gL-1 4。在我国北京某电子垃圾处理设施附近河流中也检测到TCBPA 的存在,其中沉积物和水体中检测到 TCB-PA 的浓度为分别为 542.6 ngg-1和 224 ngL-1 5。由于在自来水氯消毒过程中双酚 A 会转化成 TCB-PA,来自全国 31 个城市的自来水样品检测结果显示,TCBPA 的平均浓度为 4.9 ngL-1 6。上述的环境监测数据表明,随着 TCBPA 使用量的增加,其环境污染状况日益严峻。TCBPA 的分子结构与甲状腺激素相似,其进入生物体后会干扰甲状腺内分泌系统的稳态7。研究发现 0 1 000 nmol L-1的 TCBPA 会引起非洲爪蛙中甲状腺激素相关基因和蛋白表达的显著改变8。斑马鱼在分子信号传导过程、遗传成分、组织器官结构以及神经发育方面与其他高阶脊椎动物具有同源性9。有研究发现,基于斑马鱼胚胎/幼鱼的半致死浓度 TCBPA 的毒性高于 TBBPA,并且1.0 mgL-1的 TCBPA 暴露会造成发育毒性,降低胚胎孵化率并且会引起幼鱼卵黄囊和心包囊水肿10。对于鱼类而言,运动行为被认为是一个涉及多器官协调的综合终点,所以游泳速度可作为反映幼鱼发育缺陷和生存能力的敏感指标11-12。但是目前针对 TCBPA对斑马鱼运动行为的影响及机制的研究还十分有限,尤其是对早期发育阶段的鱼类。在鱼类的生命周期中,发育中的胚胎和幼鱼通常被认为是最易感的阶段,对水生环境中的污染物尤其敏感。当受到环境污染胁迫时运动行为发生改变,运动行为的影响被认为是污染物暴露后诱发的发育神经毒性一个重要的生物学标志13-14。因此本研究以斑马鱼胚胎为暴露模型,通过暴露于 0、2、20和 200 gL-1的 TCBPA 中,测定斑马鱼幼鱼死亡率、孵化率、畸形率以及光暗刺激下的运动行为,评估 TCBPA 对于斑马鱼幼鱼发育的影响;通过分析幼鱼吖啶橙(AO)染色情况、氧化产物丙二醛(malon-ic dialdehyde,MDA)、抗氧化酶超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase,SOD)、神经递质多巴胺(dopa-mine,DA)含量以及 DA 合成关键基因的转录等探究 TCBPA 对于斑马鱼幼鱼神经发育毒性的分子机制,识别 TCBPA 的危害特征,为评估 TCBPA 潜在环境危害和健康风险提供基础数据。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 仪器和试剂主要仪器:体式显微镜(SZ680,重庆奥特光学仪器有限责任公司,中国),Zebrabox 行为测试(ViewPoint Life Science,法国),荧光定量 PCR 仪(QuantS-tuadio7 Flex,Thermo Fisher Scientific),体式荧光显微镜(SMZ25,Nikon,日本),恒温光照培养箱(上海一第 3 期申泽宇等:四氯双酚 A 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究359 恒科学仪器有限公司,上海,中国)。主要试剂:TCBPA 标准品(纯度98%,东京 TCI公司,日本),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;99%;上海安普实验科技有限公司,中国),超氧化物歧化酶、丙二醛试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,中国)、多巴胺 ELISA 试剂盒(武汉伊艾博科技股份有限公司,中国)。1.2 斑马鱼的饲养及胚胎毒性试验产卵所 用 的 4 月 龄 野 生 型 AB 系 斑 马 鱼(Brachydanio rerio)购自中国科学院武汉水生生物研?究所,养殖在(280.5)下的标准循环水系统中,循环水的 pH 为 7.2 7.6,养殖房光暗周期为 14 h 10h。用盐水孵化的丰年虫,每天投喂斑马鱼 3 次。实验前一天晚上挑选健康的性成熟斑马鱼雌鱼和雄鱼(雌雄比为 32)置于产卵盒中用中间隔板将雄雌分开,置于恒温室的环境中过夜。第 2 天早上开灯光照刺激后将中间隔板取出,雄鱼开始追逐雌鱼,在此过程雌鱼开始产卵,待交配结束后收集所产胚胎。在显微镜下选取发育正常并达到囊胚期的受精卵,用 E3 胚胎培养液15(0.2 mmol L-1CaCl2、0.13 mmol L-1MgSO4、19.3 mmolL-1NaCl、0.23 mmolL-1KCl 和 0.003 mmol L-1亚甲基蓝)冲洗 3 次后,用做后续 TCBPA 染毒暴露实验。先前有研究报道斑马鱼胚胎暴露于 TCBPA120 h 半致死浓度(LC50)为 0.628 mg L-1 16,在本实验中选择 TCBPA 的暴露浓度根据实际环境中存在的 TCBPA 浓度(2 g L-1)4以及 TCBPA 120 h LC50的1/30 和1/3 将暴露浓度设置为0、2、20 和200 g L-1。将 TCBPA 固体粉末溶于 DMSO 中配制成母液,梯度稀释后加入到 E3 胚胎培养液中,配制成 0、2、20 和200 g L-1TCBPA 暴露液(暴露液中 DMSO的浓度为0.01%)。每个组设置3 个平行培养皿,每个培养皿中加入250 mL 的暴露液和300 颗胚。培养皿置于恒温培养箱中,培养温度和光暗周期的设置与养殖房一致。在暴露过程中每天更换暴露液,每天观察并及时将死卵/幼鱼挑出,统计胚胎/幼鱼的死亡数量、成功孵化幼鱼数量、幼鱼畸形数量。暴露 120 h 后计算每个组的死亡率、孵化率、畸形率且收集幼鱼样品,通过液氮速冻后保存于-80 的冰箱,用 MDA、DA含量的测定、SOD 活性以及基因表达分析。在本研究中,所有涉及斑马鱼的实验规范均参考经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南 TG 212鱼类胚胎-卵黄囊吸收阶段的短期毒性试验17。1.3 斑马鱼幼鱼运动行为分析为评价 TCBPA 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响,参考先前报道的方法15,利用 ZebraLab 视频跟踪系统监测 120 hpf 幼鱼的游泳速度。每个组随机挑选 24 条发育正常的幼鱼转移到 24 孔板中进行行为测试,幼鱼测试前在黑暗环境中适应 0.5 h。为了减少昼夜节律对幼鱼运动行为监测的干扰,本研究幼鱼的行为监测选择的时间为下午(13:0017:00),在光照和黑暗光周期刺激(10 min 光照/10 min 黑暗/10 min 光照)下监测其运动行为,通过运动距离计算获得幼鱼的幼鱼速度。1.4 细胞凋亡检测(AO 染色)暴露 120 h 后,从每个浓度组中随机选取 12 条幼鱼,用 E3 胚胎培养液清洗2 3 次,每次5 min,然后用 5 g mL-1AO 溶液在室温避光的条件下染色30 min,染色完用 E3 胚胎培养液清洗 3 次,每次 5min。最后使用 0.03%MS-222 将幼鱼麻醉,用体式荧光显微镜观察幼鱼头部荧光情况,对细胞凋亡状况进行评估,绿色荧光的定量使用 ImageJ。1.5 MDA 含量和 SOD 活性测定每个暴露组 3 个平行培养皿,每个培养皿取 50条鱼混合作为一个样品处理,每个组包含 3 个平行样品。每个平行培养皿取约 50 条幼鱼于 1.5 mL 离心管中,麻醉后吸干水分称量。按照19(质量体积)比例加入预冷的生理盐水进行匀浆,随后低温冷冻离心10 min(5 000g,4)。取上清液,参照 SOD 活性?检测试剂盒和 MDA 测定试剂盒说明书进行检测。1.6 DA 含量的检测每个暴露组 3 个平行培养皿,每个培养皿取100 条鱼混合作为一个样品处理,每个组包含 3 个平行样品。每个平行培养皿取约 100 条幼鱼于 1.5mL 离心管中,按照 19(质量体积)加入预冷的生理盐水和 1 mmol L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)进行匀浆,随后冷冻离心 10 min(5 000g,4)。取上清液,按?照多巴胺 ELISA 试剂盒的说明书进行检测。1.7 基因表达分析每个暴露组有 3 个平行培养皿,每个培养皿取30 条鱼混合作为一个样品处理,每个组有 3 个平行样品。暴露 120 h 后,每个平行培养皿取 30 条幼鱼用做基因表达分析。总 RNA 的提取、反转录 cDNA的合成和 qRT-PCR 参照我们之前的方法15。内参基因的选择是根据 TCBPA 暴露后的幼鱼样品对-actin和GAPDH这 2 个内参基因进行预实验后发现360 生态毒理学报第 18 卷-actin的表达更加稳定,因此选择-actin作为内参?基因。所研究基因的引物序列如表 1 所示。1.8 数据分析实验数据采用 IBM SPSS18.0 软件进行处理。以 Kolmogorov-Smirnow 方法进行正态性检验,然后以 Levenes 方法进行方差齐性检验。满足假设后采用单因素方差(ANOVA)中 Tukey 分析暴露组和溶剂对照组之间的显著性差异。数据结果表示为平均值标准差。P0.05 代表具有显著性差异。2 结果(Results)2.1 TCBPA 暴露对幼鱼的发育毒性TCBPA 暴露对斑马鱼胚胎的孵化率、存活率和畸形率的影响如表 2 所示,与对照组相比较,在 200g L-1暴露组幼鱼的畸形率显著增加(P0.05),幼?鱼畸形的类型包含心包囊水肿、躯干弯曲,如图 1 所示,但是对斑马鱼的胚胎孵化率和幼鱼的死亡率没有显著的影响。2.2 TCBPA 对幼鱼运动行为的影响暴露 120 h 后,最高浓度组不管是在光照还是黑暗条件下幼鱼的游泳速度均低于对照组(图 2),200 g L-1TCBPA 浓度组中斑马鱼幼鱼的游泳速度和对照组相比显著性降低(P0.05)。2.3 TCBPA 暴露对幼鱼脑细胞调亡的影响与对照组相比较,斑马鱼幼鱼头部的荧光强度表 1 本研究中目标基因和引物序列Table 1 Genes and primers used in this study基因名称Name引物序列Sequences of primers片段大小/bpSize/bp基因编号Gene No.thForward:GACGGAAGATGATCGGAGACAReverse:CCGCCATGTTCCGATTTCT95NM_131149.1datForward:AGACATCTGGGAAGGTGGTGReverse:ACCTGAGCATCATACAGGCG105NM_131755.1manfForward:ACCATGTGCCAGTGGAAAAGAReverse:TCGACGGAGCTCAAGTCAAC110NM_001076629.1bdnfForward:GGCGAAGAGCGGACGAATATCReverse:AAGGAGACCATTCAGCAGGACAG90NM_131595.2drd1Forward:ACGCTGTCCATCCTTATCTCReverse:TGTCCGATTAAGGCTGGAG135NM_001135976.2drd2Forward:TGGTACTCCGGAAAAGACGReverse:ATCGGGATGGGTGCATTTC101NM_183068.1drd3Forward:ATCAGTATCGACAGGTATACAGCReverse:CCAAACAGTAGAGGGCAGG137NM_183067.1comtaForward:CTATCACGACCACAGCGCATCReverse:CGCTGTGTCTGCAATAGTGG103NM_001030157.2maoForward:GTCTGGCCAACTGTGAACTTAReverse:CAGAGAGGCACGATTCACTAAC103NM_212827.3-actinForward:CGAGCAGGAGATGGGAACCReverse:CAACGGAAACGCTCATTGC102NM_131031.2p53Forward:GCAGCGATGAGGAGATCTTTReverse:GGGCTCAGATGATTCACGAT176NM_001328587.1casp-3Forward:AAAGGATCCCAGTGGAGGCAGATTReverse:TGGTCATGATCTGCAAGAGCTCCA159NM_131877.3casp-9Forward:CCAGGCCAAGACGTGACAGTReverse:GTCGATGTTGGAGCCCTTGC102NM_001007404.2bcl-2Forward:TCACTCGTTCAGACCCTCReverse:ACGCTTTCCACGCACAT235NM_001030253.2baxForward:GGCTATTTCAACCAGGGTTCCReverse:TGCGAATCACCAATGCTGT125AF231015第 3 期申泽宇等:四氯双酚 A 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究361 表 2 四氯双酚 A(TCBPA)对斑马鱼幼鱼发育终点指标(死亡率、孵化率和畸形率)的影响Table 2 Effects of tetrachlorobisphenol A(TCBPA)on developmental endpoints indicators(mortality rate,hatching rate and malformation)of zebrafish larvaeTCBPA 暴露浓度/(g L-1)Exposure concentration of TCBPA/(g L-1)0220200死亡率/%Mortality rate/%3.560.513.670.885.001.466.893.00孵化率/%Hatching rate/%96.220.4096.111.0795.331.3492.893.36畸形率/%Malformation rate/%3.000.673.340.583.671.218.440.51*注:每个浓度组包含 3 个平行;*P0.05 表示对照组和暴露组有显著性差异。Note:Each concentration was tested using three replicates;significant differences between the exposed larvae and the control group,*P0.05.图 1 斑马鱼幼鱼暴露于 TCBPA 的形态学特征(心包囊水肿、躯干弯曲)Fig.1 Morphology of zebrafish larvae exposed to TCBPA(pericardial sac edema,abnormal body axes)图 2 斑马鱼幼鱼暴露于 TCBPA 120 hpf 的游泳速度注:(a)表示每 10 min 平均速度,(b)表示每分钟运动速度;每个暴露组检测 24 条幼鱼;*P0.05 表示对照组和暴露组有显著性差异。Fig.2 The swimming speed of zebrafish larvae exposed to TCBPA for 120 hpfNote:(a)Average swimming speed during every 10 minutes and(b)the speed of movement in every minute;each exposure group was detectedusing 24 larvae;significant differences between the exposed zebrafish larvae and the control group*P0.05.362 生态毒理学报第 18 卷在 200 gL-1TCBPA 组显著性增加,表明 TCBPA诱导幼鱼脑细胞的凋亡(图 3)。2.4 TCBPA 对 MDA 含量以及 SOD 活力的影响与对照组相比较,200 g L-1TCBPA 浓度组中幼鱼的 MDA 含量和 SOD 活性没有显著性改变(图4)。2.5 TCBPA 暴露对多巴胺含量的影响与对照相比较,200 g L-1TCBPA 浓度组中斑马鱼幼鱼的多巴胺含量显著性降低(P0.05)(图 5)。2.6 TCBPA 暴露对多巴胺相关基因的影响与对照组相比较,TCBPA 暴露引起脑神经元营养因子(bdnf)、酪氨酸羟化酶(th)、多巴胺转运体?(dat)、儿茶酚-O-甲基转移酶(comta)和多巴胺受体?(drd1和drd2)显著降低(P0.05)。然而,TCBPA 暴露?引起中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(manf)显?著升高(P0.05)(图 6(a)和 6(b)。与对照组相比较,?细胞凋亡相关的基因p53和bax显著增高(图 6(c)。3 讨论(Discussion)TCBPA 被报道在环境和生物介质中高频检出,但 TCBPA 对鱼类运动行为影响的研究甚少,并且对于如何引起相关毒性的作用机制较少涉及。在本研究中,统计了暴露于0、2、20 和200 g L-1TCBPA图 3 TCBPA 暴露诱导斑马鱼幼鱼头部细胞的调亡注:(a)表示头部绿色荧光强度,(b)表示量化后的绿色荧光;每个暴露组包含 12 个平行;*P0.05 表示对照组和暴露组有显著性差异。Fig.3 TCBPA-induced cell apoptosis in zebrafish larvae brainNote:(a)Green fluorescence in zebrafish larvae brain and(b)statistic of fluorescence;each exposure group was tested using 12 larvae;significant differences between the exposed larvae and the control group*P0.05.图 4 TCBPA 暴露对斑马鱼幼鱼 MDA(a)含量和 SOD(b)活性的影响注:每个浓度组包含 3 个生物学重复。Fig.4 Effects of TCBPA exposure on MDA(a)content and SOD(b)activity in larvae zebrafishNote:Each exposure group was performed using three replicates.第 3 期申泽宇等:四氯双酚 A 对斑马鱼幼鱼运动行为的影响及神经毒性机制研究363 后 120 h 斑马鱼幼鱼的发育终点指标。实验结果表明,暴露于200 g L-1TCBPA 没有显著影响幼鱼的死亡率和孵化率,但幼鱼的畸形率显著升高。同时通过监测幼鱼运动行为,发现在最高浓度暴露可以显著降低幼鱼的游泳速度。运动行为是一个涉及多器官协调的综合发育终点指标,可以反映幼鱼的发育缺陷和生存能力12。类似的对斑马鱼幼鱼运动行为的影响在四溴双酚 A 和四溴双酚 S 上也被报道过18-19。因此,我们的研究发现 TCBPA 可以增加畸形率并且影响鱼类的运动行为,证实其对鱼类的生态危害。氧化产物 MDA 是细胞膜中不饱和脂肪酸与自由基之间反应的产物,是评价生物体脂质过氧化的重要指标20,其过量产生是由于脂质产生过量的氧化应激产物与机体抗氧化能力失衡导致的。在正常的生理状态下,MDA 可以被抗氧化防御系统有效清除,污染物暴露可以导致机体产生 MDA,引起氧化应激。抗氧化酶 SOD 是超氧化物歧化酶,可以将超氧自由基转化为过氧化氢,是抗氧化系统中的第一道防御屏障。本研究中幼鱼体内 MDA 和 SOD均没有发生显著性改变。图 5 TCBPA 暴露对斑马鱼幼鱼多巴胺(DA)含量的影响注:每个浓度组包含 3 个生物学重复;*P0.05 表示对照组和暴露组有显著性差异。Fig.5 Effect of TCBPA exposure on dopamine(DA)content in larvae zebrafishNote:Each exposure group was performed using threereplicates;significant differences between theexposed larvae and the control group*P0.05.图 6 TCBPA 暴露对多巴胺相关基因(a)、(b)和细胞凋亡(c)相关基因表达的影响注:每个浓度组包含 3 个生物学重复;*P0.05、*P0.01 表示对照组和暴露组有显著性差异。Fig.6 Expression of genes involved in the dopamine system(a),(b)and cell apoptosis(c)in zebrafish larvae exposed to TCBPANote:Each concentration was tested using 3 replicates;significant differences between the exposed zebrafish larvaeand the control group*P0.05,*P0.01.364 生态毒理学报第 18 卷 细胞凋亡是一种基因编码的细胞程序性死亡,凋亡可以通过有针对性地消除单个细胞而实现组织内稳态,而不会破坏组织的生物功能21。但是环境污染物会导致恶性的细胞凋亡进而损害机体。本研究通过 AO 染色发现,200 g L-1TCBPA 导致斑马鱼幼鱼头部出现细胞凋亡的现象,其可能损害了神经系统,进而影响斑马鱼的运动行为。进一步对细胞凋亡的相关基因进行分析发现,Bax和p53的基?因表达在最高暴露组显著上调。p53是一种肿瘤抑?制基因,在细胞凋亡、DNA 修复和肿瘤抑制途径中作为转录反式激活因子发挥作用,p53-bax-bcl2被?认为是经典的细胞凋亡途径22。p53可以上调bax的表达水平,以及下调bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用,其中bcl-2可阻止凋亡形成因子如细胞色素 c 等从线粒体释放出来,具有抗凋亡作用,而bax可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作?用,介导细胞色素 c 的释放,具有凋亡作用23。因此推测 TCBPA 的暴露上调了幼鱼体内p53和bax的?基因表达,促进了幼鱼头部细胞的凋亡,损伤了神经系统进而导致幼鱼速度降低。运动行为本身是神经元信号传导的结果24,为了进一步揭示 TCBPA 诱导神经行为的分子机制,分析了幼鱼体内多巴胺含量的变化。多巴胺是有机体控制运动的一种必需儿茶酚胺神经递质,在控制运动、认知以及动机上起到关键作用,尤其是发育早期的多巴胺在神经元发育等方面起着至关重要的作用25。多巴胺通路主要负责体内多巴胺的合成、转运、代谢等,其受到影响必然会导致神经递质多巴胺在体内发挥功能受到影响。多巴胺的生物合成是由酪氨酸羟化酶(th)转化酪氨酸而来,然后由儿茶酚氧?甲基转移酶(comta)和单胺氧化酶(mao)代谢15。在?本研究中,我们发现 TCBPA 导致斑马鱼幼鱼游泳速度降低并且伴随着体内多巴胺含量显著降低,进一步分析了斑马鱼幼鱼体内多巴胺信号通路相关的基因表达,发现 TCBPA 暴露引起th表达量降低,这?可能是导致幼鱼体内多巴胺含量降低的直接原因。多巴胺含量的降低,直接导致了多巴胺转运体(dat)、?单胺氧化酶(mao)、多巴胺受体drd1和drd2表达量?降低。bdnf是一种神经营养蛋白,调节神经干细胞?向功能性神经元(如多巴胺能神经元)的分化26。在本研究中,TCBPA 暴露引起bdnf表达量降低,可能?导致幼鱼脑内多巴胺能神经元的降低。manf是表?达在神经元中的分泌蛋白,在调节和维持多巴胺能神经元细胞中起重要作用27。在本研究中,TCBPA暴露引起manf表达量升高,可能是由于多巴胺能神经元下降的一种代偿机制。综上所述,斑马鱼早期发育暴露于 TCBPA 会导致幼鱼游泳速度降低,其可能是通过诱导头部细胞凋亡,降低幼鱼体内多巴胺含量并且干扰多巴胺信号通路关键基因转录从而造成的发育神经毒性。本研究的实验结果表明,TCBPA 对斑马鱼胚胎具有明显的发育毒性和神经毒性,因此,应谨慎考虑TCBPA 作为 TBBPA 的替代品。水环境中 TCBPA的存在可能对水生生物具有一定的风险,本研究的相关结果可以增强对 TCBPA 致毒机制的理解,识别 TCBPA 对水生生物的危害,为评估 TCBPA 潜在环境危害和健康风险提供基础数据。通信作者简介:于云江(1964),男,博士,研究员,主要研究方向为环境与健康。共同通信作者简介:李廷真(1978),男,博士,教授,主要研究方向为环境化学与风险评估。参考文献(References):1 Huang Q,Liu W,Peng P A,et al.Reductive dechlorinationof tetrachlorobisphenol A by Pd/Fe bimetallic catalysts J.Journal of Hazardous Materials,2013,262:634-6412 杜琼霞.典型双酚 A 类污染物对黑斑蛙蝌蚪发育及成蛙雄性生殖毒效应机理的研究D.杭州:杭州师范大学,2019:1-6Du Q X.Study of the development ofRana nigromaculatatadpoles and mechanism of reproductive toxicity of male?Rana nigromaculataby bisphenol A pollutants D.Hang-?zhou:Hangzhou Normal University,2019:1-6(in Chinese)3 刘舒巍.SBBR 和人工湿地组合工艺的优化及对含TCBPA 污水的处理研究D.北京:北京化工大学,2017:2-6Liu S W.Removal effect of tetrachlorobisphenol-A in acombined process of SBBR and CW D.Beijing:BeijingUniversity of Chemical Technology,2017:2-6(in Chinese)4 Song S J,Song M Y,Zeng L Z,et al.Occurrence and pro-files of bisphenol analogues in municipal sewage sludge inChina J.Environmental Pollution,2014,186:14-195 Yuan S Y,Chen S J,Chang B V.Anaerobic degradationof tetrachlorobisphenol-A 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