四种经典中药复方制剂治疗鸡传染性支气管炎的效果对比研究.pdf

202307期 总第400期鸡传染性支气管炎（IB）是由冠状病毒科冠状病毒属的传染性支气管炎病毒（IBV）引起鸡的一种急性、高度接触性传染病1-3，该病能够导致不同日龄鸡感染，尤其是4周龄以下的雏鸡感染后症状较为严重4。本病没有特异性疗法，主要采用西药治疗，但过多地使用西药不仅增加了治疗成本，也增加了药物残留，产生耐药毒株，甚至继发基因突变的风险。相反，中药在治疗IB方面具有极大的优势。本研究选用麻杏石甘汤、荆防败毒颗粒、芪板青颗粒、清肺排毒汤四种经典中药复方制剂，分别对人工感染IBV的鸡进行治疗对比，从而筛选出疗效最好的中药复方制剂，为新兽药研发和IB的临床治疗提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1试验动物和SPF种蛋1日龄非免疫健康三黄雏鸡100只，购自四川某公司，饲养至20日龄供试验用。饲养过程中自由采食及饮水，全程不接种任何疫苗。SPF种蛋100枚，购自北京某公司，于实验室自行孵化至10日龄。1.1.2病毒鸡传染性支气管炎病毒 LZM 株（QX基因型），由四川农业大学动物医学院鸡病研究室提供。1.1.3主要试剂NaPrimeScript RT-PCR Kit反试验研究四种经典中药复方制剂治疗鸡传染性支气管炎的效果对比研究杨齐1，2，黄勇2*，樊顺怡2，李念灵2（1.四川省绵阳农业学校，四川 绵阳 621002；2.四川农业大学，四川 成都 611130）中图分类号：S858.313.23文献标识码：B文章编号：1001-8964（2023）07-0038-04收稿日期：2023-02-11作者简介：杨齐（1980-），男，新疆奇台县人，硕士，讲师，从事动物医学专业中职教学，研究方向：动物疾病防控。*通信作者：黄勇（1970-），男，四川雅安人，博士，教授，博士生导师，四川省学术和技术带头人，从事动物传染病教学与科研工作，研究方向：预防兽医学（禽病学）。E-mail：摘要：本试验用四种中药复方制剂对人工感染鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的鸡进行治疗对比，以筛选出疗效最佳的方剂。将66只20日龄的非免疫三黄雏鸡分为5组，按每只鸡105EID50/0.2 mL的量进行IBV攻毒，设定对照组和试验组，对照组用纯净水代替药剂饲喂，四个试验组分别用四种中药制剂饲喂，统计分析各组的发病情况、病变情况和血液、气管及肾脏的病毒载量。通过对发病率、病理剖检结果、载毒量等综合评判，发现四种中药制剂中芪板青颗粒治疗IB的效果最优。关键词：鸡传染性支气管炎；中药复方制剂；病毒载量；芪板青颗粒38202307期 总第400期转录试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，EcokI，HindIII 限制性内切酶，TAKARA 荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq II，DNA Marker A。1.1.4主要仪器电子天平、砂锅、脱水机、包埋机、切片机、光学显微镜、离心机、PCR仪、实时荧光定量PCR仪、超微量紫外分光光度计、全功能成像仪等。1.1.5四组中药方剂中药组1：麻杏石甘汤一剂（麻黄3g、杏仁3g、炙甘草3g、石膏15g），水煎药液至2.4L5，供试验组14只雏鸡一天代水自由饮用，共需五剂。中药组2：荆防败毒颗粒一剂（荆芥7g、防风5g、羌活4 g、独活4 g、柴胡5 g、前胡4 g、枳壳5 g、茯苓7g、桔梗5g、川芎4g、甘草2g、生姜3g），水煎药液至5 L左右6，供试验组14只雏鸡一天代水自由饮用，共需五剂。中药组3：芪板青颗粒一剂（黄芪5g、板蓝根5g、金银花5g、蒲公英10g、大青叶5g、甘草3g），水煎药液至5L7，供试验组14只雏鸡一天代水自由饮用，共需五剂。中药组4：清肺排毒汤一剂（麻黄9g、炙甘草6 g、杏仁9 g、生石膏1530 g、桂枝9 g、泽泻9 g、猪苓9g、白术9g、茯苓15g、柴胡16g、黄芩6g、姜半夏9 g、生姜9 g、紫菀9 g、冬花9 g、射干9 g、细辛6g、山药12g、枳实6g、陈皮6g、藿香9g），水煎药液至5L8，供试验组14只雏鸡一天代水自由饮用，共需五剂。以上中药材均购于成都中医药大学药房。1.2方法1.2.1IBV病毒EID50的测定取70枚培养至10日龄全部存活的SPF鸡胚，分为7组，每组10枚。将含有复壮LZM-QX毒株的种毒液用生理盐水以10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8六个不同浓度进行稀释。将每个浓度的种毒液于尿囊腔接种10枚鸡胚，每胚接种0.2 mL，另取10枚鸡胚接种PBS作为空白对照组。将接种后的鸡胚置于37 培养，每日观察存亡情况。弃去 24 h 内死亡的鸡胚，24 h后死亡的鸡胚放入-18 冰箱冷冻。观察 148 h，详细记录鸡胚的死亡数与存活数，用Reed-Muench 法计算 EID509。通过计算，得到EID50为10-5.67/0.2mL。1.2.2四种中药复方制剂对鸡传染性支气管炎的治疗试验（1）将20日龄雏鸡66只，分为5组，对照组10只，其余每组14只。第1组为攻毒对照组，攻毒感染，但不给药。第25组先人工感染IBV，再于攻毒后3d分别用熬制好的四种中药复方制剂治疗。在投药治疗期间，给各组试验鸡正常投喂相同的饲料。除对照组正常提供纯净水外，其余各中药组不提供饮水，以中药代替饮水，每日早晨投放药剂，供试验鸡自由饮用。对于患重病不饮水的鸡，须每次灌服 58 mL 药液，每日23次。（2）于用药3d后，统计各组鸡只的发病率和死亡率。（3）分别在用药3、6、10d后于各组鸡中随机选择36只解剖，观察病变。同时取喉头、气管及肾脏，存放于液氮中，用于后续病毒载量的测定。（4）取待检鸡的气管和肾脏组织，先固定，再用石蜡包埋，然后切片，用苏木精-伊红染色，于光学显微镜下进行组织病理学观察。（5）应用荧光定量PCR法检测经3、6、10 d治疗后试验鸡的血液、气管、肾脏组织中攻毒毒株的载量。2结果与分析2.1临床发病情况用药治疗3d后各组的发病情况详见表1。用药治疗3d后的发病情况组别对照组麻杏石甘汤组荆防败毒颗粒组芪板青颗粒组清肺排毒汤组鸡只数量1014141414发病数量105634死亡数量00000发病率/%10035.742.921.428.6表1对照组于攻毒6 d后全部发病，说明IB疫情在全群发生。用药3 d后4个中药投喂组的发病率要明显低于对照组，其中，芪板青颗粒组的发病率最低（21.4%）。可见4种中药复方制剂对鸡传染性支气管炎均有疗效，可大大降低鸡传染性支气管炎的发病率，且芪板青颗粒的疗效最佳。试验研究39202307期 总第400期2.2病理剖检结果分别于用药 3 d、6 d、10 d后，每组随机选择36只鸡进行安乐死，并作病理解剖，观察发现QX毒株能引起鸡只气管出血和黏液渗出，肾脏肿大，甚至是“花斑肾”，肺脏出血、有黏液，盲肠、扁桃体和胸腺出血。但中药投喂组的病变程度均低于对照组，表明四种中药复方制剂对该病毒QX株均有一定的抑制作用，且能够降低鸡群组织的病变程度。尤其以芪板青颗粒组病变器官的数量最少，病变程度最低，说明疗效最佳。2.3病理切片分析通过显微镜观察发现，病变气管组织有不同量的炎性细胞、纤维素和红细胞渗出，黏膜上皮细胞有不同程度的坏死脱落，见图1。病变肾脏组织的肾小球结构模糊、界限不清，肾小管腔内有多量渗出物，间质血管充血等，见图2。2.4组织器官载毒量从血液中的病毒载量来看（表2），在用药后第3d，清肺排毒汤治疗组、芪板青颗粒治疗组和荆防败毒颗粒治疗组与对照组有显著性差异，麻杏石甘汤治疗组与对照组无明显差异；用药后第6d，清肺排毒汤治疗组、麻杏石甘汤治疗组和芪板青颗粒治疗组与对照组有显著性差异，荆防败毒颗粒治疗组与对照组无显著差异；用药后第10d，除清肺排毒汤治疗组和芪板青颗粒治疗组与对照组有显著性差异外，其余治疗组与对照组无明显差异。从肾脏中的病毒载量来看（表3），用中药治疗后第3 d，清肺排毒汤治疗组与对照组有显著性差异，其余治疗组与对照组无明显差异；治疗6d后，清肺排毒汤治疗组、芪板青颗粒治疗组和荆防败毒颗粒治疗组与对照组有显著性差异，且清肺排毒汤治疗组与其他治疗组差异显著，说明其效果较好，麻杏石甘汤治疗组与对照组无明显差异；用药治疗10 d后，各治疗组与对照组都有显著性差异。从气管中的病毒载量来看（表4），用药治疗后第3 d，麻杏石甘汤治疗组与荆防败毒颗粒治疗组相较于对照组有显著性差异；用药后第6 d，所有中药治疗组相较于对照组都有显著性差异；用药后第10 d，仅芪板青颗粒治A：正常气管；B：一级气管病变；C：二级气管病变；D：三级气管病变图1不同病变程度鸡气管病理切片（HE染色，200）试验研究E：正常肾脏；F：一级肾脏病变；G：二级肾脏病变；H：三级肾脏病变图2不同病变程度鸡肾脏病理切片（HE染色，200）血液样品中的载毒量清肺排毒汤组麻杏石甘汤组芪板青颗粒组荆防败毒颗粒组对照组治疗3d（4.906.47）106B（0.761.18）107A（1.141.97）106B（2.123.67）106B（1.942.01）107A治疗6d（2.342.51）106B（1.611.6）106B（1.511.34）106B（1.611.35）107A（1.761.23）107A治疗10d（6.857.13）106B（4.952.47）107A（2.922.25）106B（1.192.18）107A（5.926.03）107A注：同列比较，肩标不同大写字母表示差异显著（P0.05），肩标相同字母表示差异不显著，下同表2肾脏样品中的载毒量清肺排毒汤组麻杏石甘汤组芪板青颗粒组荆防败毒颗粒组对照组治疗3d（4.333.88）106B（1.672.83）108A（1.722.98）108A（1.171.71）108A（3.935.80）108A治疗6d（3.214.54）106C（1.292.57）108A（3.554.84）107B（1.651.73）107B（1.662.88）108A治疗10d（2.754.60）106B（2.052.80）106B（3.733.49）106B（1.102.70）106B（4.939.86）107A表340202307期 总第400期疗组、荆防败毒颗粒治疗组与对照组有显著性差异，而麻杏石甘汤治疗组与对照组无明显差异，说明麻杏石甘汤在前期的治疗效果更显著。3讨论考虑到太小的鸡只可能存在母源抗体干扰，太大的鸡只抗病力较强，因此我们选择20日龄的雏鸡开展本试验，并以模拟自然发病环境为试验基础。根据文献记载，芪板青颗粒由黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶、甘草制备而成，但文献配方中没有明确各单方中药的具体含量，只能查到各单方数量比例为：黄芪 板蓝根 金银花 蒲公英 大青叶 甘草5 5 5 10 5 3。由说明书推断14羽雏鸡500 mL加1 g成品药即可，每1 g相当于原生药1.65 g。本试验小组14羽雏鸡按照“黄芪5 g、板蓝根5 g、金银花5 g、蒲公英10 g、大青叶5 g、甘草3 g”的比例熬制5 L为1剂，供雏鸡代水自由饮用。芪板青颗粒是由黄芪、板蓝根、金银花、蒲公英、大青叶、甘草等组成的复方制剂，具有扶正固本、益气固表的功效。黄芪具有增强病毒诱生干扰素的能力；板蓝根能够凉血利咽，抑制组织的炎性肿胀；金银花具有清热解毒、解毒消肿的作用；蒲公英可清热解毒，消肿散结；甘草能补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓解止痛，调和诸药；大青叶具有凉血消斑和退热的作用。通过研究发现，芪板青颗粒可以通过增强鸡只的免疫力而达到治疗IB的作用。黄芪能增强网状内皮系统的吞噬功能，使血液中白细胞及多核白细胞数量显著增加，使巨噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数显著上升，对体液免疫、细胞免疫均有促进作用。4结论4.1几种中药的疗效对比芪板青颗粒、清肺排毒汤、麻杏石甘汤、荆防败毒颗粒四种中药复方制剂对IB均有一定的治疗作用，治疗效果依次为：芪板青颗粒清肺排毒汤麻杏石甘汤荆防败毒颗粒。4.2病毒载量对比中药组均可降低IBV在各组织器官中的载量，且不同药物降低不同组织中病毒载量的效果存在差异。在投药后第3、6d，芪板青颗粒降低血液中病毒载量的效果最明显，且与对照组差异显著（P0.05）；清肺排毒汤降低肾脏中病毒载量的效果最明显，且与对照组差异显著（P0.05）；麻杏石甘汤降低气管中病毒载量的效果最明显，且与对照组差异显著（P0.05）。治疗后期各组之间的差异不显著，病毒载量总体持续下降。综合对比临床发病情况、病变情况、组织病毒载量等试验数据，四种中药复方制剂中以芪板青颗粒的治疗效果最好。参考文献：1 Cavanagh Dave.Coronavirus avian infectious bronchitis virus J.Vet Res，2007，38：281-297.2 Saif Y M.禽病学 M.苏敬良，高福，索勋，译.11版.北京：中国农业出版社，2005：108-130.3 沈元朝.鸡传染性支气管炎人工模型及病症观察D.扬州：扬州大学，2019.4 Lin Shuyi，Chen Huiwen.Infectious bronchitis virus variants：Molecular analysis and 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