通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性.pdf

基金项目:辽宁省“兴辽英才计划”项目()辽宁省教育厅面上项目()沈阳市科技特派团项目()作者简介:于晓淼 女硕士研究生 研究方向为微生物学:.通讯作者 男教授博士博士生导师 研究方向为微生物学:.收稿日期:通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性于晓淼 赵允章 王锋超 孙 悦 刘宏生(.辽宁大学 生命科学院辽宁 沈阳.辽宁大学 药学院辽宁 沈阳.辽宁省生物大分子计算模拟与信息处理专业技术创新中心辽宁 沈阳.辽宁省药物分子模拟与设计工程实验室辽宁 沈阳.沈阳市生物大分子计算模拟与信息处理重点实验室辽宁 沈阳)摘 要 纳豆激酶()是一种纤溶酶可溶解血栓常用于治疗心血管疾病()然而野生型 往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性针对如何提高 的热稳定性和活性开展研究 使用重叠延伸 法将 中位于 位的 替换为 为验证突变后的热稳定性将野生型 和突变体 均在不同温度下孵育相同时间使用纤维蛋白板法测定二者酶活验证热稳定性 成功构建了 测量酶活结果显示野生型 和突变体 酶活分别达到./和./结果表明突变体 的酶活比野生型 高(.)将野生型 和突变体 在 温度下孵育 后测量酶活野生型 在 时丧失酶活突变体 在 时丧失酶活耐热温度提高 结果表明突变体 的蛋白结构在突变后发生了改变使 提高了耐热温度关键词 纳豆激酶定点诱变纤溶活性热稳定性分子动力学模拟中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)()().()././(.).微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .纳豆激酶(.)()是一种丝氨酸蛋白酶具有单链结构由 个氨基酸组成 催化中心包含三个保守残基:、和 有研究表明 不仅能溶解血栓还具有预防高血压抗凝血和抗血小板聚集的功能 并且 与传统溶栓药物相比其优势在于安全无毒性、成本低、天然生产可以口服 的三维结构于 年通过 射线衍射法分析得到这为进一步研究 的蛋白结构提供了新的思路 传统的突变技术是提高菌株生产性能的重要方法 通过三维结构的构建和分析发现在活性中心和含氧阴离子穴中出现的氢键对蛋白酶水解有着重要作用因此 等将位于活性中心附近的 、和 均突变为 以消除这些氢键的影响结果显示将这四个位点突变后自由能增加催化效率显著降低因此证明氢键的存在主要影响催化效率而不是底物的亲和力 等用 取代位于 号的 发现突变体 的催化效率是野生型的两倍 基于该发现构建了将 位的 改造为 将 位的 改造为 的双突变体 结果表明双突变体比单突变体表现出更强的催化能力抗氧化活性显著提高 刘朔等对 进行了紫外诱变发现当位于 位的 诱变为 后会提高耐热性突变后 的热稳定性最终提高了 酶活性提高了.将紫外射线和 射线结合使用 等成功筛选到比野生型 蛋白产量提高两倍的突变体 刘中美等通过定点突变构建 突变体 和突变体 经检验突变体的热稳定性明显优于野生型 半衰期分别从 增加到 和 基于上述研究本研究 的活性位点分别从第 位到第 位进行了定向诱变 当第、位点突变后发现在第 位定点突变后酶活性和催化活性降低但酶催化效率和热稳定性显著提高第、和位点结果相近 这些结果提示在第 位点至第 位点之间存在着影响 活性和热稳定性的位点 因此本研究预测并构建了 突变体进而评估突变体 的纤维蛋白溶解活性和热稳定性 材料与方法.材料.菌 株 及 载 体 纳 豆 枯 草 芽 胞 杆 菌()保存于辽宁大学生命科学院微生物资源实验室(本实验室)质粒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司大肠埃希菌 和 感受态细胞均在本实验室保藏.培养基 培养基:每 液体培养基称量 粉末(胰蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 )称取 琼脂粉加入 培养基配制固体培养基.主要试剂与仪器设备 连接酶、产物纯化回收试剂盒、质粒 小剂量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司、购自康为生物科技有限公司牛血纤维蛋白原、牛凝血酶和尿激酶购自中国食品药品检定研究院内切酶、购自宝日医生物技术(大连)有限公司 仪(孔赛默飞世尔科技有限公司)定时电泳仪(北京六一仪器厂)紫外成像仪(美国威泰克公司).方法.重组质粒的构建以纳豆枯草芽胞杆菌 的 为模板扩增出 基因将 和扩增的 基因分别双酶切酶切位点为 、连接构建重组质粒 并以此为模板通过重叠延伸 法构建突变质粒()引物列 微 生 物 学 杂 志 卷表见表.重组载体在大肠埃希菌的表达将重组质粒 和 分别转入大肠埃希菌 挑取阳性单菌落接种于 含有卡那霉素(/)的 液体培养基中 /摇床培养 将活化后的菌液作为接种液以体积比 的比例转移到 含有卡那霉素(/)的 液体培养基中 /摇床培养 后在菌液中加入终浓度为./的 诱导表达降低培养温度至 /摇床培养 诱导后菌液 /离心弃上清保留沉淀将菌体沉淀用 润洗后用细胞破碎机进行破碎破碎的菌液 /离心后保留上清和沉淀并用 验证蛋白表达情况表 扩增野生型 和突变体 引物序列 .名称引物序列野生型 .纤维蛋白平板法测量 活性参照 等的方法并稍作改进验证重组 的溶栓活性 称量.琼脂糖和 纤维蛋白原分别加入 /的 缓冲液中混匀放入 水浴锅中保温备用 取./的凝血酶加入琼脂糖 混合液中混匀之后倒入纤维蛋白原 溶液中三者混合后迅速倒入玻璃平板中室温放置 后打孔备用.测量 的热稳定性将野生型 和突变体 样品置于、和 水浴 通过纤维蛋白板法测量酶活性 结果与分析.重组质粒的构建以纳豆枯草芽胞杆菌 为模板扩增得到 片段总长度为 (图)以扩增的 为模板通过重叠延伸 法扩增突变体 的上游片段和突变体 的下游片段(图)法连接突变体 的上游和下游片段扩增出含有突变位点突变体 的基因片段(图 )将扩增的 片段和突变体 片段连接到 中 将重组质粒 和 用 和 双酶切验证分别得到两个基因片段一个为 另一个大小 左右与质粒 相近表明重组质粒构建成功(图、)将构建的两个重组质粒转化进大肠埃希菌 蛋白表达用 验证(图、)结果显示野生型 和突变体 的上清液在进行 诱导后均在 处出现目的蛋白条带.纤维蛋白板法测定野生型 和突变体 酶活性取、和 /的尿激酶标准品各 点入纤维蛋白板中设各个溶栓圈面积对数为横坐标尿激酶标准品浓度对数值为纵坐标绘制标准曲线(图)显示尿激酶相关性的线性方程为 .纤维蛋白板法用于测定野生型 和突变体 的活性各取野生型 和突变体 发酵液 点入纤维蛋白板小孔后 孵育 (图)孔 为突变体 的上清液溶栓圈孔 为野生型 的上清液溶栓圈测量溶栓圈的直径根据尿激酶标准曲线计算活性 野生型 活性为./突变体 的酶活性为./(图)突变体 的酶活性与野生型 相比提高了(.)期 于晓淼等:通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性 图 质粒的构建和蛋白鉴定.:扩增 片段:标准分子量:基因 扩增产物:双酶切验证:标准分子量:双酶切产物:重组蛋白 的 分析:蛋白标准分子量、:未加 重组工程菌破碎上清、:加 重组工程菌 破碎上清:.:.:图 质粒的构建和蛋白鉴定.:扩增突变体 上下游片段:标准分子量:突变体 上游片段:突变体 下游片段:含有突变体 的 片段:重组质粒 双酶切检验:标准分子量:双酶切产物:重组蛋白 的 分析:蛋白分子量:未加 重组工程菌破碎上清:加 重组工程菌 破碎沉淀:加 重组工程菌 破碎上清:.:.:.:微 生 物 学 杂 志 卷.测量野生型 和突变体 的热稳定性将野生型 和突变体 蛋白样品分别置于、和 的水浴中 然后通过纤维蛋白板法测定样品的纤溶活性以纤溶活性保留程度确定蛋白质稳定性在不同温度下处理样品后评估纤维蛋白板的残留活性(图、)代表尿激酶标准品孔 表示不同温度梯度()处理后的野生型 和突变体 的溶栓圈面积计算各个溶栓圈面积后带入尿激酶标准曲线中得到 的纤溶活性结果显示突变体 从 上升到 之后纤溶活性与初始值相比降低了()而野生型 的纤溶活性与初始相比降低了(.)此外野生型 在 处理后完全丧失纤溶活性但突变体 在 处理 后保留纤溶活性因此突变体 的热稳定性优于野生型 最高耐热温度提高 图 纤维蛋白板法测定野生型 和突变体 的活性.:尿激酶标准品绘制线性关系:纤维蛋白板测活性:统计结果显示突变体 和野生型 的酶活代表突变体 与野生型 组相比.:.图 测量野生型 和突变体 的热稳定性.:野生型 在不同温度处理后的残余酶活:突变体 在不同温度处理后的残余酶活:野生型 和 在不同温度下的残余酶活统计(每个样品做三次重复实验):()讨 论在蛋白质的空间结构中影响酶活性的因素有很多二硫键可以起到稳定结构的作用 在蛋白折叠过程中并无二硫键产生因此有研究通过定点突变的方法构建双突变体、预期上述 个双突变体在折叠过程中能引入两个半胱氨酸残基从而 期 于晓淼等:通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性 形成二硫键但结果显示二硫键没有构建成功因此并没有提高 的热稳定性 等通过寻找丝氨酸蛋白酶家族成员找到了与 相似性较高的枯草芽胞杆菌(.)并研究其理化性质确定其突变位点构建了 和 其中 提高了 的耐酸性 不仅提高了耐酸性还提高了热稳定性丝氨酸蛋白酶的蛋白结构受温度影响较大温度的变化会使蛋白质结构发生变性 的不同位点的改变对蛋白的活性和稳定性有不同的作用基于前期研究内容本研究确定了突变位点成功构建了 和 表达载体并在大肠埃希菌 中表达 经检测野生型 酶活性为./突变体 酶 活 性 为./突 变 体 酶活性比野生型 提高(.)突变体 从 升温到 后热稳定性较好酶活性保持在.且经过改造后的突变体 的最高耐热温度也从 升高到 有研究表明蛋白内部结构刚性增强会提高热稳定性因此通过使用 模拟 位的 突变为(图、)从结构图可以发现由于突变致原 携带的单链羟基变成了一个圆环结构蛋白的柔性降低刚性增强因此突变后的 在高温条件下更加稳定 目前 在医药领域的应用越来越广泛但由于其特性导致无法使 的开发价值最大化 本研究通过定点突变法增强蛋白结构的稳定性已经取得了良好的成果未来的研究方向可以专注于提高 的酶活性通过调控信号肽 串联启动子 将密码子进行优化等一系列基因工程手段提高酶活性尽可能发挥 的潜在价值图 野生型 和突变体 位点处的三维结构.:野生型 在氨基酸 位的三维结构:突变体 在氨基酸 位的三维结构:参考文献:.:.():.().():.:.():.():.:.():.():.微 生 物 学 杂 志 卷 .():.():.():.:():.():.():.():.刘朔姜梅陈晓红等.纳豆激酶第 位氨基酸突变对其活性及热稳定性的影响.南京农业大学学报():.():.刘中美何孝天崔文璟等.通过定点突变增强纳豆激酶的热稳定性.现代食品科技():.():.()():.武汉大学自然科学学报:英文版():.():.翁美芝.纳豆激酶结构与功能关系的研究.武汉:武汉大学.():.():.():.():.秦久福高威威李崎等.通过体外分子进化技术提高淀粉液化芽胞杆菌 葡聚糖酶热稳定性.生物工程学报():.马国兴潘峰王庆波等.纳豆激酶分子结构与潜在应用价值分析.食品与生物技术学报():.何孝天刘中美崔文璟等.介导纳豆激酶分泌表达的信号肽比较.现代食品科技():.葛春蕾刘中美崔文璟等.通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽胞杆菌中的高效表达.现代食品科技():.杨雪珍叶亚琼何兰花等.人溶菌酶基因密码子优化及其在小鼠乳腺中的表达.佛山科学技术学院学报(自然科学版)():.期 于晓淼等:通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性