生鲜乳中优势嗜冷菌对UHT乳蛋白浓度的影响.pdf

新疆农业科学():./.生鲜乳中优势嗜冷菌对 乳蛋白浓度的影响王 辉邵 伟张少颖王富兰王 帅武亚婷范 雪赵艳坤(新疆农业大学动物科学学院/新疆肉乳用草食动物营养实验室乌鲁木齐.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/新疆农产品质量安全实验室乌鲁木齐)摘 要:【目的】研究 乳在接入不同数量级的嗜冷菌时不同储存温度下 乳中蛋白浓度的变化【方法】()采用混培法将原料乳从原液稀释至 稀释梯度每个梯度做 个平行 培养 分离纯化保留单个菌落()运用嗜冷菌基因组 提取与 反应鉴定筛选出优势嗜冷菌()选用乳平板可视鉴定法筛选出产蛋白酶能力最强的菌株()采用 蛋白浓度测定法将 乳稀释 倍、倍、倍、倍、倍在磷酸盐缓冲液中测定不同稀释倍数的 乳在蛋白浓度测定试验中线性关系最好的稀释倍数()乳同时接入、/的优势嗜冷菌 组试验组分别在、和 环境下储存培养 每 蛋白浓度测定法检测一次蛋白浓度【结果】()在 份生鲜乳样品中共筛选出 株嗜冷菌()假单胞菌为生鲜乳中优势嗜冷菌分离率为 ()号菌株假单胞菌产蛋白酶能力最强透明圈带直径为 ()乳在 倍稀释浓度下的蛋白定量线性系数为 线性关系最好()条件下时假单胞菌添加量为、和/个试验组的蛋白浓度变化均不显著()时 组接菌量的蛋白浓度较对照组均表现差异显著()条件下除了/试验组蛋白浓度下降差异显著()和/个试验组蛋白浓度下降极显著(代表鉴定结果准确 代表同源性较强 脱脂乳平板法鉴定假单胞菌的产蛋白酶能力 脱脂高蛋白奶粉 嗜冷菌平板计数琼脂 蒸馏水搅拌均匀高压灭菌 冷却至 倒入培养皿静置冷却制成含 脱脂高蛋白脱脂奶粉的乳平板 在乳平板中心做一圆孔圆孔中注入 活化好的菌液将乳平板 培养 观察是否形成蛋白水解圈 蛋白浓度测定标准曲线的制作通过 蛋白试剂盒测定不同嗜冷菌添加量、储存温度、时间点的乳蛋白含量在碱性条件下蛋白将 还原为 与 试剂形成紫蓝色的络合物测定其在 处的吸收值根据标准曲线计算消化产物蛋白的浓度 工作液的配置:将试剂 与试剂 按照体积比 比例混合配成 工作液 如:试剂 与 试剂 混合配制成 工作液表 标准曲线制作 编号标准溶液()溶液()总体积()()将总体积为 的待测样品注入到 新新疆疆农农业业科科学学第 卷孔酶标板中每样 份 向微孔板中加入 工作液混匀放置 ()测定 处的吸光值并记录读数以不含标准溶液的样品吸光值作为空白对照()以 吸光值为纵坐标样品含量作为横坐标绘制标准曲线 表 不同稀释倍数的 乳在蛋白浓度测定试验中的线性关系设计 乳稀释 磷酸缓冲液中的稀释倍数为、倍制作线性关系图 乳中蛋白浓度变化与嗜冷菌添加量和储存温度的关系选择同一批次的 乳为基础液态奶将产蛋白酶能力最强菌株的磁珠复活在嗜冷菌平板计数琼脂上 恒温培养 用 缓冲液冲洗培养皿上的菌落将菌液转至空无菌玻璃管中将菌液调至酶标仪 波长下吸光值为 将菌量调整为、/取 乳加入无菌锥形瓶共计 瓶共分为 组每组 瓶每组分别接入、/的菌液 放入不同温度下、及 培养 ()每隔 取样测定 次测定样品中蛋白浓度 假单胞菌胞外蛋白酶对 乳中蛋白质的影响取 乳于无菌瓶中共 份每份添加 /的菌液后密封置于 的恒温箱中培养 后除去上层乳样留沉淀部分 结果与分析 嗜冷菌筛选及鉴定结果研究表明经过培养、纯化在 份生鲜乳样品中筛选出 株嗜冷菌其中 株菌所占比例较大确定为优势嗜冷菌 图 假单胞菌产蛋白酶能力脱脂乳平板法鉴定研究表明透明圈的大小反应了菌株分泌胞外蛋白酶的能力 其中 号菌的产蛋白能力最强其次是 号菌和 号菌最后为 号菌产蛋白酶的能力最弱其余菌株产蛋白酶能力极弱选择产酶能力最强的 号菌株做为原料乳中具有的代表性的优势嗜冷菌进行后续试验 测序后所得到的基因序列通过 数据库比对并建系统发育树 号菌株与假单胞菌同源性达到确定 号菌株为假单胞菌 图 图 表 图 嗜冷菌 鉴定的凝胶电泳图谱 图 乳平板鉴定结果 表 乳平板鉴定结果 菌株编号 测定结果()号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 号 第 期王 辉等:生鲜乳中优势嗜冷菌对 乳蛋白浓度的影响图 进化树构建结果 蛋白浓度测定标准曲线结果研究表明标准曲线线性关系良好相关系数达到 图 图 蛋白浓度测定标准曲线 乳不同稀释倍数对蛋白浓度测定影响研究表明 乳在 倍稀释浓度下相关系数 达到了 线性关系最好后续蛋白浓度测定试验均采用经过稀释 倍的 乳 图 图 倍稀释浓度标准曲线 图 倍稀释浓度标准曲线 图 倍稀释浓度标准曲线 图 倍稀释浓度标准曲线 图 倍稀释浓度标准曲线 新新疆疆农农业业科科学学第 卷图 倍稀释浓度标准曲线 蛋白浓度与储存温度和接菌量的关系研究表明细菌添加量为/的试验组在第 时 条件下蛋白浓度 /度显著()当样品乳添加菌量为/时 蛋白浓度在第 出现显著()下降蛋白浓度为 /在第 为最低值 /时蛋白浓度在第 开始显著()下降在第 时蛋白总浓度极显著()下降并在第 达到最低值 /当样品乳菌液浓度为/在条件下储存第 时蛋白浓度在所有试验组中达到最低值 /蛋白浓度极显著()添菌量在/时 试验组的蛋白浓变化差异度极显著()在添菌量在/时和 试验组的蛋白浓度变化差异显著()在添菌量在/时 试验组蛋白浓度变化差异极显著()假单胞菌胞外蛋白酶导致的 乳中蛋白质沉淀研究表明假单胞菌蛋白酶水解了酪蛋白胶粒外层的 后蛋白胶粒的稳定性遭到破坏造成牛奶在贮存过程中出现沉淀、凝胶、蛋白水解等缩短牛奶的货架期 添加 含/假单胞菌菌液的 乳在 的恒温箱中培养 后 乳出现了明显蛋白沉淀图 注:按蛋白浓度由高到低、()大写字母为极显著()下同:、()()图 /接菌量下 乳蛋白浓度变化 /图 /接菌量下 乳蛋白浓度变化 /第 期王 辉等:生鲜乳中优势嗜冷菌对 乳蛋白浓度的影响图 /接菌量下 乳蛋白浓度变化 /图 胞外蛋白酶导致的乳蛋白沉淀变化 讨 论 生鲜乳作为嗜冷的优良培养基在低温下得益于生鲜乳的营养成分可迅速繁殖其代谢产生的耐热蛋白酶破坏乳中营养成分改变蛋白质结构使结构发生变性结合 序列同源性分析鉴定出嗜冷菌 株其中 株假单胞菌为优势嗜冷菌此前报道的假单胞菌是对乳制品品质影响最主要的因素 与试验结果一致嗜冷菌菌株之间产蛋白酶能力有所不同为保证试验的可靠性与准确性试验采用乳平板可视鉴定法鉴定出产蛋白酶能力最强的菌株为 号菌株假单胞菌其产生的耐热蛋白酶可分解培养基中的蛋白质出现明显的水解圈魏超等研究结果与试验结果相符储存温度升高时乳样品内的蛋白浓度相应的降低 试验中添加菌量为、和/的试验组均在储存温度为 时达到蛋白总量最低值与相关文献 报道相一致 试验添加嗜冷菌模拟被污染的生鲜乳随着添菌量的加大和时间的延长添加菌量为/试验组在第 时最低蛋白浓度为 /极显著()蛋白浓度变化平稳 而在 储存条件下 组试验组的蛋白浓度都有显著和极显著的变化 在 下贮藏和运输的生鲜乳生产的 乳要比在 下贮藏运输的生鲜乳生产的 乳的保质期要长应尽量将生鲜乳避免光线下保存以及在 以下贮藏为最佳与洪青等所阐述的生鲜乳进入贮存罐迅速冷却到是抑制乳中嗜冷菌生产蛋白酶从而达到预防乳制品蛋白降解应避免乳制品在生产环节中受到细菌的污染生鲜乳采集过程中奶牛乳房和挤奶设备的清洗和消毒是必不可少的更要避免运输和加工过程的二次污染 尽快运输到工厂防止嗜冷菌大量的繁殖代谢使原料乳中嗜冷菌含量保持在最低水平减少蛋白酶的产生从而延长 乳的货架期 结 论在 份生鲜乳样品中共筛选出 株嗜冷菌 假单胞菌为生鲜乳中优势嗜冷菌分离率为 号菌株假单胞菌产蛋白酶能力最强在 乳样品接菌量相同的情况下储存温度高的试验组蛋白浓度明显低于低温储存的试验组 乳低温储存的重要性 在储存温度相同时新新疆疆农农业业科科学学第 卷乳样品接菌量越大相同时间内的蛋白浓度越低参考文献()():楠丁呼思勤 母智深 陈芳 等 影响牛奶品质耐热酶的研究进展 食品工业科技():():():唐兵 唐晓峰 彭珍荣 嗜冷菌研究进展 微生物学杂志():():夏涵 府伟灵 快速提取细菌 方法的研究 现代预防医学 ():():辛亮 原料乳中嗜冷菌多样性研究及 快速检测方法的构建 哈尔滨:哈尔滨工业大学 :纪振杰 郭德军 王欣 原料乳中嗜冷菌数的检测方法的比较 乳品科学与技术 ():():尤超 赵大球 梁乘榜 等 引物设计方法综述 现代农业科技 ():():林少华 罗红霞 贾红亮 等 高通量测序技术结合传统方法筛选及鉴定奶酒中曲菌 中国奶牛 ():():李德葆 周雪平 基因工程操作技术 上海:上海科学技术出版社:分子克隆试验指南 黄培堂译 版 北京:科学出版社:():叶慧 谢海华 黄俊 等 基于 序列分析和 快速鉴定方法鉴定杭州地区原料乳中嗜冷菌 发酵科技通讯 ():():薛艳蓉 王呈 梁茂文 等 新疆乌鲁木齐传统酸奶中乳酸菌的多样性分析 中国奶牛():():吴序栎 朱倩倩 成小娟 等 牛乳 乳球蛋白热稳定与免疫原性关系的光谱学研究 光谱学与光谱分析 ():():韩荣伟 王加启 郑楠 热处理对牛乳成分的变化影响及热损标识物的选择 中国食物与营养 ():():魏超 周虹 郭灵安 等 鸡蛋溶血巴斯德菌药敏试验及氨基酸代谢研究 西南农业学报 ():():():岳喜庆 王玥 李鹏 等 原料乳中嗜冷菌低温蛋白酶的酶第 期王 辉等:生鲜乳中优势嗜冷菌对 乳蛋白浓度的影响学性质研究 食品工业科技():():张云峰 罗玉明 王新风 嗜热蛋白酶的研究与应用淮阴师范学院学报(自然科学版)():()():王娇 原料乳中嗜冷菌的变化和控制研究 哈尔滨:黑龙江东方学院 :():():王辉 吕加平 刘鹭等 耐热蛋白酶对 乳蛋白的水解作用 食品科学():():韩秋红 李琴 李凯锋 嗜冷菌对乳制品加工及贮存的影响和控制措施 现代食品 ():():():洪青 李楠 刘振民 原料乳中嗜冷菌快速检测与控制技术研究进展 乳业科学与技术 ():():刘欣欣 李发弟 乐祥鹏 羊奶成分和奶中主要蛋白的研究进展 中国畜牧杂志 ():():遇晓杰 万丽葵 原料奶中嗜冷菌和耐热芽孢菌的来源追溯研究 肉品卫生 ():():.新新疆疆农农业业科科学学第 卷 (././):【】【】()()()()()/【】()()()()()/()()/()/()【】:()()()():():.:().