神经调节蛋白4对2型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响.pdf

作者简介：苏静华，本科学历，医师。作者单位：北京，解放军总医院第三医学中心：体检中心，肾内科；北京，火箭军特色医学中心口腔科；保定，河北大学附属医院肿瘤科通讯作者：苏静克，：神经调节蛋白 对 型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响苏静华，吴方丽，焦 婷，韩 宁，苏静克，张海松 【摘要】目的 探讨神经调节蛋白（）对 型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法将 大鼠分为对照组（）、糖尿病组（）和 干预糖尿病组（）。实验结束后，取各组大鼠心肌细胞，流式细胞术检测心肌细胞凋亡率，检测 及 的转录表达，检测凋亡相关蛋白、及 的表达。结果 与 组相比，组心肌细胞凋亡率明显升高（）（）；，促凋亡蛋白 与凋亡执行蛋白 表达明显增多，抗凋亡蛋白 表达明显减少，差异有统计学意义（）；而 干预显著抑制糖尿病大鼠心肌细胞凋亡（）（）；，降低 与 的表达并促进 表达（）。结论 干预能缓解 型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。【关键词】神经调节蛋白；型糖尿病；心肌细胞；细胞凋亡 【中国图书分类号】，；，；，【】（），（）（），（）（）；，（）（）（）；，（）【】（）；糖尿病已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题，而心血管并发症是糖尿病患者致死致残的主要原因，糖尿病心肌病变是其中一种常见且严重的心血管并发症。糖尿病心肌病变以左室功能障碍、心肌细胞凋亡及间质纤维化等结构和功能异常为特征，。因此，抑制心肌细胞凋亡可能是防治糖尿病心肌病变的有效靶点。神经调节蛋白（，）是新近被发现的一种在棕色脂肪组织中高表达的细胞因子，隶属于表皮生长因子家族。既往的动物实验表明，能调节糖脂代谢紊乱，促进物质氧化，改善全身代谢；对抗饮食诱导的胰岛素抵抗等，。临床研究也表明，血浆中 浓度降低与糖尿病发展密切相关。但是，能否对抗糖尿病诱导的心肌细胞凋亡尚不清楚。本研究以 型糖尿病大鼠为研究模型，探讨 对心肌细胞凋亡的影响。材料与方法 材料与仪器 周龄雄性 大鼠 只（维通利华）；重组蛋白（联迈生物）；血糖试纸（英国）；糖化血红蛋白（，；）；试剂盒（伊莱瑞特生物）；（，博迈德）；双染法细胞凋亡检测试剂盒（美国）；游离脂肪酸（，）试剂盒（南京建成）；预制胶电泳液（索莱宝）；（膜，美国）；（，美国 ）、武警医学 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，DOI:10.14010/ki.wjyx.2023.07.014 抗体（，美国 ）、抗体（，英国）；小鼠 肌动蛋白（）抗体（，美国 ）。血糖仪（美国强生），酶标仪（，美国 ）；流式细胞仪（，美国 ）；型电泳仪（北京六一仪器）；凝胶成像分析仪（，美国）。型糖尿病大鼠造模实验动物均单笼饲养，自由进食、进水，级屏障环境中饲养，光照时间 。适应性喂养 周，然后将动物随机分成两组：对照组（，）和 型糖尿病组（，）。组大鼠仍采用维持饲料喂养，注射等体积的枸橼酸钠缓冲液（）；组大鼠给予高脂饲料（脂肪）喂养 周，禁食 后，按照 的剂量腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素，连续注射 ，周后检测血糖，空腹血糖 作为造模成功的标准。共成功造模 只。实验分组 再将 组大鼠随机分成两组：糖尿病组（组，）与 干预组（组，）。组大鼠按 的剂量腹腔注射 重组蛋白，每周 次，；组和 组大鼠注射等量的 缓冲液，干预 周。实验结束后，所有实验动物禁食 后按照 的剂量腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉后取材。血液学指标检测实验结束时采集各组大鼠的血清样本（）。血糖仪测定空腹血糖（，），试剂盒测定，全自动生化仪检测血清中三酰甘油（，）与总胆固醇（，）。的检测按照操 作 指 南 进 行。检 测 试 剂 充 分 混 匀 ，离心 ，吸弃上层蓝色液体及蛋白凝块，取下层抽提液 进行显色。取 抽提液与 显色剂混匀，室温下放置，试剂一调零，在 、光径处进行比色，计算血清中 的浓度。细胞凋亡 取各组大鼠新鲜的心脏组织，漂洗后将组织块尽量剪碎。加入 倍组织体积的胰蛋白酶液消化，恒温箱中孵育，每隔 振荡一次。待消化完毕后，加入等体积的含 胎牛血清的 培养液中止消化。滤网（目）过滤消化液，离心 ，弃上清，完全培养液重悬细胞。收集各组细胞的单细胞悬液，加入 和 ，分别混匀，于室温下避光孵育 后上机检测。采用 软件对实验结果进行分析：左上象限（）为细胞死亡百分比，右上象限（）为晚期凋亡百分比，右下象限（）为早期凋亡百分比，左下象限（）为活细胞百分比，细胞凋亡率。检测相关基因 常规 法提取心肌组织总，两步法反转录为 并进行扩增，扩增条件为 预变性，退火，延伸，扩增 个循环，最后 延伸。基因引物由上海申工合成（表）。表 基因引物序列基因引物序列（）：注：，正向；，反向。实验取出冻存的心脏组织，称取约 组织，加入 裂解液裂（含）于匀浆器中进行充分匀浆。待组织充分裂解后，用移液器将裂解液吸至 管（预冷）中。然后在 ，的条件下离心 ，吸取上清液迅速转移至新的 管（预冷）中，此即为总蛋白提取物。取 总蛋白上样后电泳。然后在 的条件下转膜 ，再室温封闭 ，分别滴加特异性一抗封闭过夜，再以辣根过氧化物酶标记的二抗封闭 。最后，用化学发光剂染色、显影并采用 软件分析胶片灰度。所有实验至少重复 次。统计学处理 使用 软件进行数据处理，计量资料以?表示。采用单因素方差分析，方差齐性检验采用 检验，检验水准 ，如果方差齐，则采用 法进行进一步比较；如果方差不齐，则采用 法进行进一步比较。为差异有统计学意义。结 果 干预对糖脂代谢的影响与 组相比，组大鼠的、和 显著升高（），而 干预能明显降低、武警医学 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，、和，与 组相比差异有统计学意义（，表）。干预对心肌组织细胞凋亡的影响与 组相比，组心肌细胞的凋亡比例显著增高（）（）；，而 干预能明显降低糖尿病大鼠心肌细胞的凋亡比例（）（），差异有统计学意义（，图）。干预对心肌组织凋亡相关蛋白转录表达的影响 与 组相比，组促凋亡蛋白 的基因转录表达显著升高，而 干预能降低 基因转录表达水平（，表）。与之相反，表 干预对糖尿病大鼠糖脂代谢的影响（?；）项目 组 组 组体重 （）（）（）（）注：组 对照组；组 糖尿病组；组神经调节蛋白 干预组；空腹血糖；糖化血红蛋白；总胆固醇；三酰甘油；游离脂肪酸；与 组比较，；与 组比较，。图 干预对糖尿病大鼠心肌组织细胞凋亡的影响注：组 对照组；组 糖尿病组；组 神经调节蛋白 干预组。组抗凋亡蛋白 基因的转录表达水平明显降低，而 干预能提高 基因转录表达水平（）。表 干预对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关蛋白转录表达的影响（?；）分组 组 组 组注：组 对照组；组糖尿病组；组神经调节蛋白 干预组。与 组比较，；与 组比较，。干预对心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响 与 组相比，组促凋亡蛋白 与参与凋亡的执行蛋白 表达显著升高，而 干预能降低 与 蛋白表达水平（；图，表）。与之相反，组抗凋亡蛋白 的蛋白表达水平明显降低，而 干预能提高 的蛋白表达水平（）。图 干预对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响 注：组对照组；组糖尿病组；组神经调节蛋白 干预组。表 干预对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达量化表（?；）分组 组 组 组注：组对照组；组糖尿病组；组神经调节蛋白 干预组。与 组比较，；与 组比较，。武警医学 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，讨 论 自糖尿病心肌病变于 世纪 年代被提出以来，现已证实糖尿病心肌病变是糖尿病的微血管并发症，其中细胞凋亡是其特征性病变之一。细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，无论哪种途径，细胞凋亡时，线粒体均发生一系列显著变化。线粒体在细胞凋亡过程中起很重要的作用，家族即以线粒体为靶标调控细胞凋亡。家族包括促凋亡蛋白 和抗凋亡蛋白 等成员，与 是目前研究较成熟的两个凋亡相关基因。当 与 基因表达发生变化时，线粒体膜渗透性增加，释放细胞色素，诱发 级联反应和细胞凋亡，其中 是参与凋亡执行的重要蛋白。本研究从基因转录和翻译两个层面证实，干预能降低促凋亡蛋白 与凋亡的执行蛋白 的表达并提高抗凋亡蛋白 的表达，进而抑制糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。隶属于表皮生长因子家族成员，在棕色脂肪组织中高表达。脂源性细胞因子 在调节机体能量代谢方面发挥重要作用，与肥胖相关疾病，包括糖尿病与非酒精性脂肪肝病的发生、发展密切相关。既往研究发现，能改善代谢紊乱、胰岛素抵抗、肝非酒精性脂肪变性和肾小管间质纤维化。本研究发现，干预能缓解 型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡。文献与本研究结果相一致，在自发性高血压大鼠体内上调 基因表达也能减少心肌细胞凋亡，逆转心肌纤维化。尽管 改善多种糖脂代谢紊乱相关靶器官损伤的作用已得到初步证实，但是对于 的干预机制尚不十分清楚。既往研究发现，能通过 依赖的自噬途径缓解老龄鼠肝脏非酒精性脂肪变性，而自噬在 缓解糖尿病大鼠心肌细胞凋亡中的作用值得进一步探讨。总之，本研究结果发现 可抑制 型糖尿病大鼠心肌细胞凋亡，可能是治疗糖尿病心肌损害的一种有效干预措施。【参考文献】，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，？，（）：，：，（）：，（）：苏静华，焦 婷，韩 宁，等 大麻二酚对高糖诱导小鼠肾脏足细胞系 细胞凋亡的保护作用 武警医学，（）：杨文朋，吴方丽，田萧羽，等 生长分化因子 对炎症微环境中兔 成骨分化的影响 北京口腔医学，（）：苏静克，苏静华，韩 宁，等 精脒对老龄小鼠股骨微结构的影响 武警医学，（）：李晓晨 维格列汀通过 途径提高自噬预防糖尿病心肌病变天津：天津医科大学，游 艳，田萧羽，曾浪，等 生长分化因子 对高 武警医学 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，糖环境中人甲状腺乳头状癌 细胞凋亡的影响 武警医学，（）：，：，（）：，？，（）：，（）：“”（），（）：，（）：，：，：，（）（）：，（）：，（）：，（），（）：（收稿 修回）（责任编辑 李云霞）（上接 页）握较差的、个短板弱项，比如止血中的绞棒止血法，包扎中的急性创伤绷带等，下一步应针对这些短板弱项加大培训的力度，或可达到事半功倍的效果。此外应加大考核的力度，以考促学，以考促训，在考核中发现问题，提高技能。总之，本研究表明，特战队员战救技能短板弱项明显，战救技能掌握水平有待进一步提升，战救技能自评情况能够在一定程度上反映其真实水平。另外，针对特战队员专业分工明确的实际，可结合专业差异，针对性地设计特战队员战救课程。【参考文献】国 文，王启栋，李浩庭，等 特战队员军事训练伤 例监测报告数据分析 武警医学，（）：黄燕琳，刘钰瑞，雷 静，等 特战队员心理应激水平及其影响因素的研究 西南国防医药，（）：康 健，罗正学，任 杰某部作战卫生人员战救能力培训需求分析 华南国防医学杂志，（）：王冠杰，王 锐，陆 洲，等 国内外军队战（现）场急救技术培训发展现状 人民军医，（）：徐志鑫，王 超，石 齐，等 武警部队“魔鬼周”极限训练伤病调查与分析 武警后勤学院学报（医学版），（）：刘晶晶，桂 莉，黄 燕，等 某军医院校毕业学员战救技能掌握现状研究 华南国防医学杂志，（）：刘晶晶，桂 莉，黄 燕，等 差异化教学在军校毕业学员卫勤演习中的应用及效果评价 华南国防医学杂志，（）：张 幔，龚春晨，农颜宁，等 军医视角下驱护舰艇卫生专业士兵战救能力及培训要求的质性研究华南国防医学杂志，（）：，（）：邓 磊，欧阳甘霖，郑世贤 提高卫生连（排）一线战救能力的思考 白求恩医学杂志，（）：，（）：，（）：孙 芳，秦知安，胡德胜，等 我军卫生士官分级培训存在的主要问题及改革对策 白求恩医学杂志，（）：（收稿 修回）（责任编辑 尤伟杰）武警医学 年 月 第 卷 第 期 ，.，.，