山桐子优良雌株组培快繁技术研究.pdf

收稿日期:基金项目:湖北省林业科技支撑重点项目()第一作者简介:洪聪慧()女硕士研究生主要从事林木遗传育种的研究共同第一作者通信作者:杜克兵()男博士副教授主要从事林木遗传育种的研究文章编号:():././.山桐子优良雌株组培快繁技术研究洪聪慧余 晴 冷 英刘 同邹 涛蔡 月杜克兵(.华中农业大学 园艺林学学院武汉.襄阳市林业科学研究所湖北 襄阳.襄阳市林业调查规划设计院湖北 襄阳)摘要:建立高效的山桐子组培快繁技术体系为山桐子种苗生产提供参考 以山桐子优良雌株的幼嫩带芽茎段为外植体筛选最佳外植体消毒方法、初代培养基、增殖培养基、生根培养基、组培苗移栽基质 结果表明将茎段外植体用/放线菌酮溶液浸泡(抽真空)然后用/多菌灵./链霉素的混合溶液浸泡 随后用 乙醇浸泡 再用.浸泡.灭菌效果最佳存活率达.最适宜的初代培养基为.琼脂蔗糖./././后腋芽萌芽率达.最适宜的增殖培养基为在.琼脂蔗糖././././培养基上培养 后再转移到.琼脂蔗糖培养基上继续培养 增殖系数可达.最适生根培养基为.琼脂蔗糖././生根率达 最适的移栽基质为 蛭石 珍珠岩 泥炭 的混合基质移栽成活率可达.该研究为山桐子工厂化育苗奠定了基础关键词:山桐子组织培养激素增殖培养生根快速繁殖中图分类号:.文献标志码:(.):./()/././././././././././.:第 卷第 期 湖北民族大学学报(自然科学版).年 月 ().山桐子(.)为大风子科()山桐子属落叶乔木分布于亚热带与暖温带在中国、韩国、日本均有分布是东亚特有的树种在我国主要分布于四川、云南、贵州、陕西、河南等地区 山桐子生长速度快干形良好耐寒、抗旱适应性强且树体高大花色黄绿入秋后红果累累是优良的速生用材树种和观赏树种 其果实含油率高达.能制成半干性油可代替桐油也可作为保健食用油、生物柴油、油漆和涂料的原料具有很高的经济价值和社会价值应用前景广阔 山桐子为雌雄异株植株由于扦插成活率低无性繁殖比较困难生产中主要采用播种方式繁殖 在作为油料树种栽培时往往需要栽培雌株但实生苗难以在幼年期鉴定植株性别给山桐子油料生产带来极大不便 筛选山桐子优良雌株进行组织培养可在短时间内获得大量优良的雌性苗木且成本低因此建立雌性优株的高效组培快繁体系具有重要的现实意义李绪友等以种子萌发 的无菌苗幼根为外植体采用改良的()培养基添加不同浓度激素的组合对愈伤组织诱导、芽分化、增殖、壮苗与生根培养进行了探索建立了组织培养体系 杨恩让等将种子与叶片作为外植体研究不同植物生长调节剂对山桐子离体培养的影响发现以种子为外植体诱导愈伤组织效果更佳在././蔗糖.琼脂的培养基上愈伤诱导率可达.刘晓敏同样以山桐子种子和叶片为外植体研究了外植体种类、植物激素等因素对山桐子组织培养不同阶段的影响 关于山桐子的组织培养其他学者已做了相关研究但多以种子、叶片与幼根等为外植体以雌株茎段为外植体的报道很少 因此论文以山桐子优良雌株的幼嫩带芽茎段为外植体进行组培快繁技术研究通过筛选最佳外植体消毒方法、初代培养基、增殖培养基、生根培养基、组培苗移栽基质等建立了高效的山桐子组培快繁技术体系以期为山桐子工厂化育苗奠定基础 材料与方法.试验材料选用襄阳市林业科学研究所筛选保存的本地野生山桐子(.)优良雌株树高.胸径.树龄约 年()、等基本培养基配方如表、所示表 基本培养基配方.成分来源含量/(/)大量元素钙盐().微量元素.铁盐.肌醇甘氨酸有机物硫胺素()盐酸吡哆醇().烟酸().表 基本培养基配方.成分来源含量/(/)大量元素.微量元素.铁盐.肌醇烟酸().有机物盐酸吡哆醇().硫胺素().甘氨酸.试验方法.外植体消毒与基本培养基筛选 年 月 日于晴天采集树冠中上部的幼嫩带芽茎段为外植体取样之前连续 向枝条上喷洒 多菌灵可湿性粉剂 倍液 取样后去掉叶片与叶柄用稀洗衣 湖北民族大学学报(自然科学版)第 卷粉液浸泡 刷去表面灰尘再在流水下冲洗 沥干水分后用 /放线菌酮溶液浸泡茎段并将装有茎段的玻璃瓶放入连接有抽气泵的真空干燥箱中抽气至没有气体逸出静置 左右 抽气结束用蒸馏水清洗干净后转入超净工作台用/多菌灵./链霉素的混合溶液浸泡 然后用无菌水冲洗干净转入无菌空瓶 用 乙醇处理 无菌水冲洗 次再用.消毒(设置 、.、.个水平)消毒时不断摇晃无菌瓶使药剂与材料充分接触 消毒结束用无菌水冲洗 次最后用无菌滤纸吸干外植体表面水分切成 的带芽茎段接种到 基本培养基中 接种 后观察灭菌效果统计污染率()、褐化率()和存活率()筛选合适的消毒时间 污染率公式如下:(/)()式()中 为污染率为污染的外植体数单位为个 为接种外植体数单位为个 褐化率公式如下:(/)()式()中 为褐化率为褐化的外植体数单位为个 存活率公式如下:(/)()式()中 为存活率为未污染未褐化的外植体数单位为个随后筛选山桐子初代培养适宜的基本培养基设置、/、个水平(不添加任何激素)种培养基中均添加.琼脂蔗糖调节 值为.接种 后统计腋芽萌发率()公式如下:(/)()式()中 为腋芽萌发率为萌发外植体数单位为个.培养条件 培养基在、下高压灭菌 冷却后使用 接种时每个处理 次重复每个重复 瓶每瓶接种 个外植体 培养室温度为()空气湿度为 光照强度为光照时间为/.初代培养 以幼嫩带芽茎段为试材经外植体消毒(.浸泡.)后接种于初代培养基中以筛选出的 为基本培养基添加.琼脂蔗糖激素种类与质量浓度设置为(.、./)、(.、.、./)和(、.、./)不添加激素的培养基 设为对照共 种培养基()接种 后统计腋芽萌发率()和幼芽生长状态筛选合适的初代培养基.增殖培养 以初代培养中萌发的幼芽为试材幼芽高 时接种于增殖培养基中 以 为基本培养基添加.琼脂蔗糖激素种类与质量浓度设置为(.、.、./)、(.、.、./)、(.、.、./)和(.、.、./)不添加激素的培养基 设为对照共 种培养基()通过预试验发现在含有激素的培养基中培养 后外植体叶片开始发黄萎蔫植株逐渐衰弱 因此设置了 组处理即在含有激素的增殖培养基()中培养 后处理 为转移到原培养基中保持激素种类和质量浓度不变()处理 为转移到不含激素的基本培养基中()即.琼脂蔗糖 接种 后统计增殖系数()以筛选适宜的增殖培养基和培养方式 公式如下:/()式()中 为增殖系数为接种 时的有效芽数高于.的芽记为有效芽单位为个为接种芽数单位为个.生根培养以增殖培养获得的高度为.以上的健壮无菌苗为试材接种于生根培养基 以 为基本培养基添加.琼脂蔗糖激素种类与质量浓度设置为(.、.、./)和(.、.、./)不添加激素的培养基 设为对照共 种培养基()接种 后统计生根率()、根系数量和根长以筛选适宜的生根培养基 生根率公式如下:(/)()式()中 为生根率为生根苗数单位为个为总苗数单位为个.组培苗移栽 将高 的生根试管苗移栽于蛭石珍珠岩泥炭的混合基质中三者的体积比分别设置为 、和 移栽后覆盖透明塑料杯保湿 后移除塑料杯再培养 后统计移栽成活率()公式如下:(/)()第 期 洪聪慧等:山桐子优良雌株组培快繁技术研究 式()中 为移栽成活率为成活苗数单位为个为移栽苗数单位为个.数据分析 采用 和 .进行数据整理和分析百分数经过反正弦转换后再进行方差分析和多重比较()表 茎段消毒试验结果.消毒时间/褐化率/污染率/存活率/.注:同一列中不同字母表示差异显著(.)表 初代培养的腋芽萌发率.培养基编号激素质量浓度/(/)腋芽萌发率/.注:同一列中不同字母表示差异显著(.)结果与分析.外植体消毒与基本培养基筛选山桐子茎段极易污染以真菌污染为主一般接种 后就有污染现象出现 时污染与褐化现象基本稳定茎段消毒试验结果如表 所示 由表 可知消毒时间对茎段的褐化率和污染率均产生了显著影响(.)其中消毒 时的平均褐化率和污染率分别为.和.消毒.时分别为.和.消毒 时分别为.和.因此.浸泡.比较适合山桐子的茎段消毒存活率最高达.如图()所示茎段消毒(.浸泡.)后接种于、/、种基本培养基中(不添加任何激素)后腋芽萌发率分别为.、.和.的腋芽萌发率显著低于/与 从萌发幼芽的生长状态而言 上的幼芽生长健壮、均一叶片颜色鲜绿/上的幼芽生长相对弱小部分叶片发黄出现一定数量的畸形苗 因此综合比较 更适合作为山桐子的基本培养基.初代培养初代培养的腋芽萌发率如表 所示 由表 可知与对照()相比添加外源激素(、)显著提高了山桐子外植体的腋芽萌发率且不同质量浓度组合对腋芽萌发的影响存在显著差异(.)种初代培养基中 和 的腋芽萌发率显著高于其他 种培养基分别为.和.是对照()的.和.倍 因此可选择 作为山桐子的初代培养基即.琼脂蔗糖./././其萌发的幼芽生长健壮如图()所示 ()()()()()()()蛭石珍珠岩泥炭 ()蛭石珍珠岩泥炭 图 山桐子的组织培养.湖北民族大学学报(自然科学版)第 卷.增殖培养增殖培养的增殖系数如表 所示 由表 可知不同处理与激素组合下山桐子的增殖效果差异显著()对于处理 幼芽接种 后更换 次培养基第 时与对照()相比外源激素(、与)显著提高了山桐子的增殖效果 其中 的增殖系数最大显著高于其他培养基达 为 的.倍但幼芽生长状态略差稍细弱且有部分玻璃化如图()所示 对于处理 幼芽接种 后转移到不添加激素的培养基中培养 第 时相较于对照()外源激素显著提高了山桐子的增殖系数 种培养基中 的增殖系数显著高于其他培养基达.为 的.倍且芽苗生长整齐、健壮如图()所示表 增殖培养的增殖系数.激素质量浓度/(/)处理 培养基编号增殖系数处理 培养基编号增殖系数.注:同一列中不同字母表示差异显著(.)表 生根培养结果.培养基编号激素质量浓度/(/)生根率/生根数量/条根长/.注:同一列中不同字母表示差异显著(.)两种处理之间处理 的增殖效果明显优于处理 处理 的平均增殖系数为.是处理 的.倍 处理 中 的 增 殖 系 数 最 大 为 处理 中增殖效果最佳的是增殖系数达.是处理 中最大增殖系数的.倍 此外处理 的芽苗生长状况较差叶片发黄存在玻璃化现象而处理 的芽苗生长整齐、健壮整体状况良好 因此增殖培养最佳方法是先在.琼脂蔗糖./././培养基上培养 再转移到.琼脂蔗糖培养基继续培养 .生根培养生根培养结果如表 所示 由表 可知与不添加激素的对照()相比外源激素(、)显著促进了山桐子生根的数量与根长(.)接种 时 的生根率为 如图()所示根系数量少、长度短、生长状况较差 在 中(除 外)生根情况均优于 其中、的根系数量最多平均分别达到.和.条显著多于 分别为 的.和.倍 的平均根长达.显著大于 为 的.倍 因此 最适宜山桐子的生根培养基即组成为.琼脂蔗糖././生长状况如图()所示生根苗的移栽试验表明在相同条件下基质对移栽成活率有明显影响 基质中 蛭石 珍珠岩 泥炭为 、时试管苗的移栽成活率分别为.、.和.以 的体积比为最高 体积比为 和 的试管苗生长状况如图()()所示 讨论目前有关山桐子茎段组培快繁技术的报道较少难以有效地满足山桐子雌性优株快速繁殖的需求 本试验以山桐子优良雌株的幼嫩带芽茎段为外植体建立了一套简易快速的繁殖体系以期为山桐子优质种苗工厂化生产提供技术支撑第 期 洪聪慧等:山桐子优良雌株组培快繁技术研究 茎段是植物组培快繁最常用的外植体之一其消毒方法是离体培养成功与否的关键之一不仅要保持材料的活性又要将材料表面的菌类完全杀死 本研究所采用的山桐子幼嫩茎段被黄色长毛覆盖消毒工作比较困难污染率很高以真菌污染为主 王红梅等以圆锥绣球()茎段为材料发现采用/多菌灵./链霉素浸泡 然后用 乙醇浸泡 .浸泡 的灭菌效果最佳污染率与褐化率最低分别为.和.本试验以此为参考发现将茎段外植体先用 /放线菌酮溶液浸泡(抽真空)然后用/多菌灵./链霉素的混合溶液浸泡 最后用 酒精浸泡.浸泡.灭菌效果最好接种 时存活率可达.但整体而言污染率和褐化率仍然较高有待进一步降低后期或可尝试采用套袋、室内栽培、枝条水培等预处理方式来减少外植体的污染不同基本培养基所含营养成分不同培养效果也不同 目前山桐子已报道的基本培养基主要包括/、改良、和 本研究比较了山桐子在/、种培养基中的差异发现 的腋芽萌发率相对较低/与 差异不大但从萌发幼芽的生长状态而言 上的幼芽生长健壮、均一/上的幼芽生长相对弱小因此认为 为山桐子的最佳基本培养基从已报道的山桐子初代培养来看用带芽茎段作为外植体建立无菌体系的很少 杨恩让等以种子为外植体诱导形成愈伤组织然后在./././诱导芽分化诱导率达.以上 沈洋城以山桐子茎段为外植体研究了不同浓度 对不定芽诱导的影响发现 浓度过低时丛生芽生长较弱叶片发黄浓度过高时出现畸形苗的概率增大 研究发现./././()为最适合山桐子茎段的初代培养基接种 后腋芽萌发率达 这与杨恩让等的研究结果相似增殖培养是组织培养的关键步骤其增殖系数是衡量种苗繁殖效率的标准受多种激素浓度的影响蒋泽平等报道 与 浓度对山桐子芽苗增殖具有显著影响其茎段诱导出的幼芽在改良./././上增殖效果最佳培养 时增殖系数可达.研究设置了 种激素(、)的 种浓度组合发现培养 后幼苗开始黄化萎蔫甚至玻璃化随后将其转移到不含激素的培养基中幼苗逐渐恢复生长腋芽增殖数量增多 在增殖培养基.琼脂蔗糖././././()上培养 随后转移到 不含激素的基本培养基上继续培养 时增殖效果最佳增殖系数可达.该现象可能与植物体内的激素平衡有关过多的细胞分裂素刺激打破了原有的动态平衡组培苗分裂过于旺盛导致新发的幼苗异化生长 这一现象与杨恩让等的研究结果相似 质量浓度为./时增殖的芽苗生长状况较差易发黄死亡其调控机理还有待进一步探索生根培养是建立高效组培快繁体系的重要环节添加一定浓度的 与 能诱导不定根促进根系生长两者协同作用远大于单独使用的效果 王海洋认为山桐子在/././的培养基中生根效果最佳生根率可达 平均根数为 条平均根长为 研究发现././()是最适合山桐子的生根培养基生根率达 平均根数为.条平均根长为.与王海洋的结果基本一致 结论将幼嫩带芽茎段外植体用/放线菌酮液体浸泡(抽真空)再用/多菌灵./链霉素的混合溶液浸泡 随后用 乙醇浸泡 .浸泡.灭菌效果最佳存活率达 最适初代培养基为.琼脂蔗糖./././后腋芽萌芽率达.在增殖培养基.琼脂蔗糖././././上培养 随后转移到.琼脂蔗糖的培养基上继续培养 增殖效果最佳增殖系数可达.最适生根培养基为.琼脂蔗糖././培养 时生根率达 平均生根数为.条平均根长为.最适的移栽基质为 蛭石 珍珠岩 泥炭 的混合基质移栽成活率达.(下转第 页)湖北民族大学学报(自然科学版)第 卷 .():.陈建福陈健旋林媛等.芥菜总黄酮超声辅助提取工艺优化及其脂质抗氧化研究.食品研究与开发():.():.:.():.():.().:.:.:.廖建庆王涵虞贵财.超声波辅助花生壳中提取黄酮工艺的研究.中国粮油学报():.季青霞陈伟毕艳红等.超声波辅助提取水芹中黄酮类化合物的工艺研究.包装与食品机械():.:.:.任倩倩高朋马致静等.响应面法优化超声辅助提取北柴胡黄酮工艺及抗氧化活性.北方园艺():.责任编辑:郑玥雷(上接第 页)参考文献:方晓璞李欣鲁海龙等.山桐子产业在我国的开发利用情况.油料资源():.中国油脂编委会.中国油脂植物.北京:科学出版社:.张小平邓东周鄢武先等.山桐子作为木本油料资源的开发潜力.四川林业科技():.戴国富谢世友万腾等.山桐子特性、利用价值及苗木培育技术.湖北农业科学():.陈耀兵罗凯李美东等.“鄂选 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