疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究.pdf

特产研究DOl:10.16720/ki.tcyj.2023.123Special Wild Economic Animal and Plant Research103疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究龙小妹1,李蓉1,夏宗霄1,郭爽1，古建兴1,刘海鹏2,范源1.3（1.云南中医药大学，云南昆明6 50 50 0;2.云南中医药大学第二附属医院，云南昆明6 50 2 16;3.云南中医药大学第一附属医院，云南昆明6 50 0 2 1)摘要：优化疏调气机汤最佳水提取工艺及对桥本甲状腺炎大鼠的治疗作用。以5种成分的总溶出量为指标，通过单因素试验和正交试验法，优选加水量、浸泡时间、煎煮时间等工艺参数；建立桥本甲状腺炎大鼠模型，ELISA法检测大鼠血清中TSH、F T 3、Ig G 4、IF N-TG-Ab、T P O-A b 和TGF-1水平,HE染色观察大鼠甲状腺病理学形态变化。最佳水提取工艺为加2 0 倍量水，浸泡2 0 min，煎煮10min；与模型组比较，疏调气机汤工艺提取物可明显减轻桥本甲状腺炎大鼠的炎性细胞与改善甲状腺滤泡形态，降低血清TSH、IgG4、IF N-、T G-A b、T P O-A b、T G F-1和升高FT3水平差异有统计学意义（(P0.05)。优选的疏调气机汤水提取工艺合理、稳定可行，对桥本甲状腺炎大鼠有一定的治疗作用。关键词：疏调气机汤；正交实验；水提工艺；桥本甲状腺炎；大鼠模型中图分类号：R285.5Optimization of Extraction Technology for Shutiaoqiji Decoction with Or-thogonal Test and Study of the Therapeutic Effect on Rats with Hashimoto文献标识码：AThyroiditis文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 4-0 10 3-0 9LONG Xiaomeil,LI Rongl,XIA Zongxiaol,GUO Shuangl,GU Jianxingl,LIU Haipeng2,FAN Yuanl.3(1.Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500,China;2.Second Affiliated Hospital of Yunnan University ofChinese Medicine,Kunming 650216,China;3.The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650021,China)Abstract:To optimize the optimal aqueous extraction process of Shutiaoqiji Decoction and to study the therapeutic effect on rats with Has-himoto thyroiditis.Optimize the process parameters,such as water addition,soaking time and decoction time by single-factor test and or-thogonal test method through to the total dissolved amount of 5 compounds as indexes.Detection of TSH,FT3,IgG4,IFN-,TG-Ab,TPO-Ab and TGF-1 levels in rat serum by ELISA and observation of morphological changes in rat thyroid pathology by HE staining.The bestextraction process of Shutiaoqiji Decoction was to add 20 times of water,soak for 20 min,and decoct for 10 min.Compared with the modelgroup,the process extract of Shutiaoqji Decoction could significantly reduced inflammatory cells and improve thyroid fllicular morphol-ogy in rats with Hashimoto thyroiditis and reduce the level of serum TSH,IgG4,IFN-,TG-Ab,TPO-Ab,TGF-1 and increase the level ofFT3 with statistical significance(P 0.05).The preferred extraction process of Shutiaoqiji Decoction was reasonable,stable and feasible,and has a certain therapeutic effecton rats with Hashimotos thyroiditis.Key words:Shutiaoqiji decoction;orthogonal test;aqueous extraction technology;hashimoto thyroiditis;rat model收稿日期：2 0 2 3-0 2-2 3基金项目：云南省高校中西医结合防治甲状腺病重点实验室项目（3117 0 10 18 0 3)；云南省科技厅科技计划项目-应用基础研究计划项目（2 0 2 10 1AZ070001-015)；云南省万人计划“名医”专项项目；云南省中医重点专科项目作者简介：龙小妹（19 9 6-)，女，苗族，贵州铜仁人，在读硕士研究生，从事中药药理应用与研究。通讯作者：范源（19 6 6-)），男，博士，教授，从事中药药理应用与研究。下罗恩品牌；猪甲状腺球蛋白（pTg）、弗氏完全佐剂104桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎或自身免疫性甲状腺炎（Auto-immune thyroiditis，A IT)，是一种甲状腺的慢性炎症。HT属于中医学“瘘病”范畴，传统医学认为本病发病主要与情志内伤、饮食失调等因素关系密切 1,好发病于女性,近年来,HT的发病率持续升高 2 。疏调气机汤是由国医大师张震研究员创立的疏调人体气机的基础方剂，以疏调为本，一体两翼作为制方理念，即主体是疏肝，一翼是健脾，一翼是补肾 3。该方由柴胡、香附、郁金、白术、仙灵脾、丹参、川芎、积壳、白芍、茯苓、薄荷、甘草和山药13味药组成，诸药合用具有疏肝解郁、调畅气机、补益肝脾之功，疗效甚佳 4。张芳等 5 从临床的角度观察疏调气机汤对肝郁脾虚型甲状腺功能减退合并桥本氏甲状腺炎的疗效，发现该方可以治疗HT病人的同时还可以改善其症状、降低中医症候积分。现代中药复方制剂工艺研究多以含量或提取率为评价指标，再结合现代数据分析方法来优选工艺参数 6-8 ,导致在制剂工艺研究过程中缺乏相应的药效学试验验证。参考疏调气机汤的临床应用方式，以芍药苷、淫羊藿苷等5个成分的总溶出量为指标，采用正交试验优化疏调气机汤的水提工艺参数，并以甲状腺组织病理切片和HT治疗因子考察结果为指标，初步考察按最优处方所制疏调气机汤水提物对HT大鼠的保护作用。HOHOHOHOHOHoHO1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖图1化合物结构式Fig.1 Chemical structures of compounds1材料与方法1.1仪器HC-800Y摇摆式高速多功能粉碎机，武义海纳电器有限公司；Agilent1200系列高效液相色谱仪（VWD紫外检测器），美国安捷伦公司；FA1004N电子天平，上海菁海仪器有限公司；SQP十万分之一分析天平，QUINTIX35-1CN，赛多利斯科学仪器（北京）有限公特产研究司；D2KW-D电热恒温水浴锅，上海量壹科学仪器有限公司；EYEL4型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；D5-040S东森牌超声波清洗机，深圳市品凰科技有效公司；SHZ-D(III)循环水式多用真空泵，上海秋佐科学仪器有限公司。TG16W微量高速离心机；TGL16M台式高速冷冻离心机;Rayto,RT-6100酶标仪；8 1-2 恒温磁力搅拌器，均购自上海酶联生物科技有限公司。Tianshi,988洗板机；电热恒温培养箱，武汉一恒苏净科学仪器有限公司。1.2试验动物及试剂SPF级雌性Wistar大鼠6 0 只，体质量(18 0 2 2 0)g,购自云南致力科技有限公司，许可证号为SCXK（京）2019一0 0 10。所有动物研究均经云南中医药大学动物伦理委员会批准（批准号：R-062021012）。疏调气机汤中13味药材均由昆明益生药业有限责任公司提供，产地信息见表1；对照品没食子酸（批号：wkq16081904）、淫羊藿苷（批号：wkq20042802）均购于四川省维克奇生物科技有限公司、咖啡酸（批号：W16010B100366），均购自上海源叶生物科技有限公司；芍药苷（批号：No.930K021），购自北京索莱宝科技有限公司；1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖（批号：PRF21060701），购自成都普瑞法科技开发有限公司。乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯;大鼠促甲状腺激素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3）、免疫球蛋白G4（Ig G 4)、干扰素（IFN-)、抗甲COOH状腺球蛋白抗体（TG-Ab）、甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)）、转化生长因子1(TGF-1)ELISA试剂盒，OHHOHOHO没食子酸OH2023年第45卷第4期批号均为2 0 2 2 0 2 2 8 A，均购自上海酶联生物科技有限OH公司。碘化钠(NaI)购自上海易恩化学技术有限公司旗HO咖啡酸HOHO芍药苷OH淫羊藿苷(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)均购自美国Sigma公司。表1疏调气机汤13味药材产地信息Table 1 Information on the origins of the 13 herbs used inShutiaoqiji decoction药材Medicinal herbs柴胡香附郁金丹参川芎积壳白术白药仙灵脾山药茯苓薄荷甘草产地信息Place of origin information甘肃广东广西安徽甘肃四川浙江浙江贵州河南云南河北新疆第4期2方法2.11色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 m m 250mm,5m);流动相：乙腈(C)-0.1%磷酸(D)梯度洗脱（见表2）；流速：1mL/min；检测波长：2 30 nm；柱温：2 5；进样量：10 L。色谱图，见图2。表2 梯度洗脱程序Table 2Gradient elution procedure时间/min乙腈C/%TimeAcetonitrileC0468101525152620353045404646042.2溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备分别精密称取对照品没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖、淫羊藿苷,置10 mL容量瓶中,用甲醇溶解定容,配制成浓度分别为0.1mg/mL、0.342 mg/mL、1.314mg/mL、0.59mg/mL、0.30 8 m g/m L 的对照品储备液，再分别取咖啡酸5mL，1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖5.5mL，淫羊藿苷6 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释成为0.171mg/mL、0.32 4m g/m L、0.18 5m g/m L 的对照品溶水平Level1232.5HT大鼠模型的建立及疏调气机汤治疗作用2.5.1造模药物的配制高碘水溶液：称0.6 4g碘化钠晶体，用1L蒸馏水溶解混合，得到浓度为0.6 4g/L的高碘水溶液。抗原溶液：将 pTg（2 mg/mL)溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中。免疫乳化剂：将CFA或IFA和抗原溶液以1:1体龙小妹，等：疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究0.1%磷酸D/%0.1%phosphoric acid water D969285858070609696表3水提L9(33)正交因素-水平设计Table 3 Lg(33)Orthogonal factors-levels design of water extractionA加水量/倍A amount of water added101520105液，低温避光保存备用。2.2.2疏调气机汤散的制备附、郁金、丹参、川芎、积壳和白术各10 g，白芍12 g，茯苓、仙灵脾各15g，薄荷、甘草各6 g，山药2 0 g，经高速万能粉碎机打粉，过40 目筛，即得疏调气机汤散，密封保存备用。2.2.3疏调气机汤供试品溶液的制备精密称定疏调气机汤散14.4g，进行水煎煮提取，设置不同料液比、浸泡时间及煎煮时间（从沸腾起始点开始计时），过滤，于6 0 减压回收水至干，加甲醇溶解转移至锥形瓶中，超声30 min，过滤，滤液转移至2 5mL容量瓶中，甲醇定容，即得疏调气机汤供试品溶液，低温保存备用。2.2.4阴性对照品溶液的制备对照品与样品溶液定容所用溶剂均为甲醇，故取甲醇溶液过0.45m微孔滤膜，即得阴性对照溶液。2.3单因素试验采用水煎煮法提取疏调气机汤中没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷。按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，考察加水量、浸泡时间及煎煮时间对指标成分溶出量的影响。2.4水提正交试验选取加水量、浸泡时间、煎煮时间正交设计试验，考察各因素对疏调气机汤中没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊苷溶出量的影响,因素水平，见表4。B浸泡时间/minC煎煮时间/minB soaking timeC decocting time01010202030积比分别吸入2 个注射器中，2 个注射器之间以1个细胶管相连，交替推动针管，直至形成黏稠的乳化剂为止,现配现用。2.5.2试验分组与给药雌性Wistar大鼠6 0 只，随机分为6 组，即正常组、模型组、阳性药组、疏调气机汤低浓度组（SQD低剂量组）、疏调气机汤中浓度组（S Q D 中剂量组）和疏调气机汤高浓度组（SQD高剂备分别称取药材柴胡、香D空白Dblank106量组)，普通水与常用饲料适应性喂养1周后，空白对照组大鼠饮用纯净水，其余组大鼠饮用高碘水；第3周的第1天和第4天，造模组大鼠于双后足皮下注射CFA免疫乳化剂，每只给予0.2 mL，进行初次免疫，正常组大鼠注射同等剂量PBS；第4 7 周，造模组大鼠后背及颈部皮下多点注射IFA免疫乳化剂,每次0.2 mL，每周1次，进行加强免疫，正常组大鼠注射同等剂量PBS。在第8 周将正常组和其余各组大鼠血清中甲状组别Groups正常组模型组阳性药组SQD低剂量组SQD中剂量组SQD高剂量组2.5.3样本采集与指标测定大鼠在药物干预6 周后，禁食不禁水12 h,称重，麻醉，腹主动脉取血，30 0 0 r/min离心15min分离血清。酶联免疫法(ELISA)检测血清中 TSH、F T 3、Ig G 4、IF N-、T G-a b、T P O-a b 和 TGF-1水平；剥离甲状腺组织，用10%中性福尔马林固定，供HE染色。2.6统计学处理试验数据采用SPSS软件分析数据，采用t检验、t检验、方差分析，P0.05为差异显著，该数据分析有统计学意义。3结果与分析3.1线性关系考察取2.2.1项下的对照品溶液，经0.45m微孔滤膜滤过,依次精密吸取2 L、4L、6 L、8 L、10 L和12L,按2.1项下色谱条件进样。以对照品进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。没食子酸回归方程为y=1609.4x+16.453(R2=1)，线性范围为0.2 1.2 g；咖啡酸回归方程为y=1609.4x+16.453(R2=0.9998)，线性范围为0.342 2.0 52 g；芍药苷回归方程为y=1090.1x+383.24(R2=0.9996),线性范围为2.6 2 8 15.7 6 8 g;1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖回归方程为y=1713.5x2 7 4.34（R 2=0.9 9 9 7），线性特产研究腺自身 TG-Ab 和 TPO-Ab 水平进行对比，与正常组比较，其余各组大鼠TG-Ab和TPO-Ab水平高于正常组均值2 倍及以上视为造模成功。第9 周开始药物治疗，每日给药1次，共计6 周，按体表面积换算法换算出各大鼠等效剂量，疏调气机汤等效剂量定为中剂量（相当于成人剂量5倍，成人体质量按7 0 kg计），低剂量为中剂量1/2 倍，高剂量为中剂量2 倍；阳性药等效剂量灌胃，具体见表4。表4各组大鼠给药情况Table 4Administration of the drug to each group of rats药物Drugs蒸馏水蒸馏水雷公藤多苷疏调气机汤水煎液疏调气机汤水煎液疏调气机汤水煎液2023年第45卷第4期剂量给药方式DosageDrug administration manner1 mL/(100 g.d)1 mL/(100 g.d)0.625 mg/(100 g.d)0.515 g/(100 g.d)0.103 g/(100 g.d)0.206 g/(100 g.d)范围为0.6 48 3.8 8 8 g；淫羊藿苷回归方程为y=1 713.5x-274.34(R2=0.996),线性范围为0.37 2.2 2 g。3.2精密度考察精密吸取同一供试品溶液10 L，连续进样6 次，结果没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,46-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷的峰面积RSD分别为0.8 5%、1.26%、1.8 6%、0.2 6%和1.2 2%表明仪器精密度良好。3.3稳定性试验吸取同一份供试品溶液，于0 h、2 h、4h、6 h、8 h、10 h、12 h、14h、和16 h时注入色谱仪进行测定，计算得到没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷峰面积RSD分别为0.7 3%、0.8 5%、4.12%、0.8 0%和1.0 5%，表明供试品溶液在16 h内稳定。3.4重复性试验取同一批样品6 份，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，进样体积为10 L，结果没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷峰面积RSD分别为1.56%、2.0 2%、1.46%、2.14%和1.32%，表明该方法重复性良好。3.5加样回收率试验精密称定同一批疏调气机汤散样品6 份，每份7.2 g，加入等量的对照品溶液，按2.2.3项下方法制备供试灌胃灌胃灌胃灌胃灌胃灌胃第4期品溶液，进样测定并分析，计算平均回收率及RSD值。结果表明，疏调气机汤中没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖、淫羊藿苷的平均回收率分别为10 0.2 8%、9 8.9 0%、9 9.14%、9 7.44%及97.74%，R S D 值分别为3.12%、3.6 4%、2.7 9%、2.58%及2.46%，表明方法的准确度良好。A200(nvu)/率15010050寸00B800(nv)/率来60040020000C2501(nvu)/率2001501005000注：A.对照品图谱；B.样品图谱；C.阴性对照图谱；1.没食子酸；2.咖啡酸；3.芍药苷；4.1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖；5.淫羊藿苷。Note:A.Control chart;B.Sample chart;C.Negative control chart;1.Gallicacid;2.Caffeic acid;3.Paeoniflorin;4.1,2,3,4,6-0-pentagalloylglucose;5.Icarin.3.6单因素试验结果随着加水量的增加，疏调气机汤中5个化合物均有明显增加，在加水量为2 0 倍后溶出量未见明显增加趋势，甚至有下降现象（图3A），可能原因是溶剂体积过小，化合物无法彻底溶解，但溶剂体积过大，更易溶出其他的杂质达到饱和 9 ，从而导致继续增大料液比不会增加溶出率。因此，考虑到水煎液太多导致患者依从性差、生产成本及化合物溶出量等综合因素，选择加水量为2 0 倍；随着浸泡时间的延长，疏调气机汤中5种化合物溶出量并无明显变化，甚至在未浸泡直接龙小妹，等：疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究321101010图2 高效液相色谱图谱Fig.2Chromatogram of HPLC107提取时某些化合物的溶出量比浸泡时高（图3B），其原因是本试验所用药材已经过打粉处理，可能导致在浸泡时药材粉末未能很好地被水浸泡；也可能因温度不够高，导致化合物未能溶出，而直接提取时温度够高，化合物溶出速度快、提取量大。因此，为了节约时间，选择不浸泡直接提取；随着煎煮时间增加，除了芍药苷及1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖在2 0 min时达到最高点，其余化合物的含量不增反减（图3C)，可能原因是542030时间/minTime320时间/minTime20时间/minTime煎煮时间短，导致成分溶出不完全，煎煮时间过长，导致过多溶出的化合物发生水解或挥发。故选择煎煮时间为 2 0 min。40A2.0(3/）/语甲款1.51.050.540.00B2.030403040一没食子酸咖啡酸药药苷+1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖淫羊藿苷1020加水量/倍Amuntofwateradded(3/u）/唐甲款1.51.00.50.0C2.0F(3/u)/喜甲惑1.51.0H0.5F0.00注：A.加水量；B.浸泡时间；C.煎煮时间。Note:A.amount of water added;B.soaking time;C.decocting time.图3加水量、浸泡时间、煎煮时间对疏调气机汤中没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖、淫羊藿苷提Fig.3 Effect of material-liquid ratio,soaking time and de-coction time on the extraction effects of gallic acid,caffeicacid,paeoniflorin,1,2,3,4,6-O-galloyl-D-glucose,and3.7正交试验结果由表5可知，以D项为误差项进行方差分析，结果表明,加水量对没食子酸、咖啡酸、芍药苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷的总溶出量有显著性差异(P0.05)（见表6)。且3个因素对提取效果的影响为ACB。结果表明,当疏调气机汤的水提工艺试验号ATest number123456789K1K2K3R因素FactorABC误差注：A、B、C分别代表加水量、浸泡时间、煎煮时间。Note:A.BC reperesent amount of water added,soaking time,decocting time respectively.3.8验证试验按优选的最佳工艺A3B3C1进行提取验证，结果显示各化合物溶出量平均值均接近正交试验中最佳提序号没食子酸Serial numberGallic acid10.252 120.254.530.25423.9各组大鼠激素水平变化检测各组大鼠血清中TSH、F T 3、Ig G 4、IF N-、T G-特表5正交实验结果Table 5 The results of orthogonal experiment没食子酸咖啡酸BC1112132122233132331.8902.3972.4892.2082.8652.6390.9750.431偏差平方和Deviation sum of squares1.4510.2790.3900.07产D/(mg/g)Gallic acid1122332331123213212.7082.3812.2902.5312.2462.3320.4620.199Table 7 Validation results of water extraction process咖啡酸Caffeic acid0.377 90.376 80.377 4研为A3B3C1，即加2 0 倍量水浸泡2 0 min，煎煮10 min条件最佳。1,2,3,4,6-0-五没食子芍药苷酰葡萄糖(mg/g)/(mg/g)/(mg/g)Caffeic acidPaeoniflorin0.099 40.13990.083 80.121 00.093 40.113 20.106 60.187 20.105 90.149 00.146 10.271 80.137 60.273 40.133 20.286 70.133 40.291 3表6 方差分析Table 6Analysis of variance自由度F比Degree offreedomF-ratio222.32324.29226.0002取工艺，表明正交试验优选的工艺条件提取工艺合理、可靠且稳定。表7 水提工艺验证结果药苷1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖Paeoniflorin1,2,3,4,6-O-galloyl-D-glucose1.89901.901 21.913 2究1,2,3,4,6-0-galloyl-D-glucose1.368 90.369 71.070 60.275 51.218 10.304 61.368 40.410 81.302.40.34921.889 10.559 61.632 30.505 11.6570.545 81.646 70.543 8F临界值Fcritical value19.00019.00019.000淫羊藿苷Icarin0.598 00.316 60.593 30.31990.592.30.318 8Ab、T P O-A b 和TGF-1的水平。结果显示，与正常组比较，模型组血清中 TSH、Ig G 4、IF N-、T G-A b、T P O-2023年第45卷第4期总溶出量淫羊藿苷/(mg/g)/(mg/g)Total dissolvedIcarinamount0.153 42.131 30.124 41.675 30.134 11.863 40.190 72.263 70.173 82.08030.255 93.122.50.247 22.795 60.247 12.86980.315 22.930 4显著性SignificanceP 0.05P0.05单位：mg/g总溶出量Total dissolvedamount3.443 63.44573.455 9第4期Ab 和TGF-1水平显著升高(P0.05),FT3水平显著下降（P0.0001)，疏调气机汤各给药组大鼠中TSH、T G-A b、T P O-A b 与模型组比较均显著下降(P0.01)，疏调气机汤高浓度组大鼠中IgG4、I F N-、T G F-*龙小妹，等：疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究A*1091与模型组比较，均有显著性下降（P0.05），F T 3与模型组比较显著上升(P0.05),结果表明疏调气机汤水提物对HT大鼠具有较好的治疗作用，见图4。B50F/D/40H302010*工阳性药组SQD低剂量组SQD高剂量组SQD低剂量组C(T/由20m15*D8*E*(Tu/)/月要*800元*600*10400200王常组模型组SQD中剂量纸SQD高剂量组F2000F1500(qu/ad)x4*1000G80(/60*4050020SQD中剂量SQb中剂量维注：与模型组比较，*P0.05，*P 0.0 1，*P 0.0 0 0 1。Note:Compared with the control group,*P 0.05,*P 0.01,*P 0.000 1.图4大鼠血清中不同激素水平的变化Fig.4Changes in serum levels of different hormone in rats3.10甲状腺组织病理学改变对各组大鼠甲状腺组织进行HE染色，结果显示，正常组大鼠甲状腺结构完整，可见大小不一、形状不同的滤泡，泡腔内充满染色成淡红色的透明胶质，未见炎细胞浸润；模型组与正常组比较，大鼠甲状腺的形态结构异常，其滤泡细胞被破坏，排列杂乱，泡腔内胶质生成减少，周围存在炎性细胞浸润；阳性药组与模型组比较，大鼠甲状腺结构更完整，但仍存在滤泡腔内胶质含量较少及炎性细胞浸润的现象；SQD低剂量组与模型组比较，大鼠甲状腺结构有所改善，但滤泡腔内胶质含量少，滤泡细胞破坏现象仍未改善，周围存在炎细胞浸润；SQD中剂量组与模型组比较，大鼠甲状腺组织更110完整，滤泡腔内胶质含量明显增加，滤泡细胞被破坏较少，甲状腺结构基本完整；SQD高剂量组大鼠甲状腺结构大部分较完整，滤泡形态基本规则，大小较一致，特产研究滤泡腔内胶质含量高；甲状腺组织HE染色结果表明，疏调气机汤能够改善甲状腺炎细胞浸润程度和甲状腺形态结构,对自身免疫性甲状腺炎模型有较好的治疗作用。2023年第45卷第4期ABCD注A.正常组；B.模型组；C.阳性药组；D.SQD低剂量组；E.SQD中剂量组;F.SQD高剂量组。Note:A.Control group;B.Model group;C.Positive drug group;D.Low dose of SQD group;E.Middle dose of SQD group;F.High dose of SQD group.Fig.5Histopathological sections of the thyroid gland of each group of rats(HE staining,200)4讨论桥本甲状腺炎是一种器官特异性自身免疫性疾病，而被誉为免疫调节剂的多酚类化合物是新兴的用于治疗各种自身免疫性疾病的药物工具 10 。疏调气机汤组方中的药材白芍，富含大量以没食子酸为基础的多酚类化合物 11,其水提物具有抗炎和免疫调节等作用 12 。咖啡酸存在于多种药材中，现代药理学研究表明，咖啡酸具有抗炎、抗氧化、抗癌等多种作用 13。淫羊藿苷是淫羊藿的重要组成成分，明华丽等 14 以淫羊藿苷为研究对象，探讨其对试验性自身免疫性甲状腺炎大鼠 TG-Ab、T P O-A b、细胞因子水平及甲状腺组织病理和免疫组化等的影响，结果表明淫羊藿苷不仅可以显著降低 HT 大鼠的 TG-Ab、T P O-A b 及 TGF-水平，且明显改善甲状腺病理损伤。故将没食子酸、咖啡酸、药苷、1,2,3,4,6-0-五没食子酰葡萄糖和淫羊藿苷设定为优化水提工艺的评价指标，筛选出最佳的水提工艺，使该方在治疗HT过程中发挥最大的疗效，可为疏调气机汤剂型研究奠定理论基础，同时为工业化生E图5各组大鼠甲状腺组织病理切片（HE染色,2 0 0）产提供科学依据。目前，常用免疫诱导建立自身免疫性甲状腺疾病试验动物模型，建模成功的大鼠甲状腺滤泡被破坏，出现大量浆细胞和淋巴细胞浸润，血清TG-Ab、T P O-A b抗体水平显著升高 15，本试验结果表明，自身免疫性甲状腺炎大鼠模型建立成功。通过给药干预后，与模型组比较，疏调气机汤高浓度给药组和阳性药组对比，改善甲状腺功能、甲状腺组织病理损伤更明显，提示疏调气机汤对HT大鼠的疗效确切。TPO-Ab 和 TG-Ab 是HT标志性抗体,两者均以IgG型抗体为主。Prummel等 16 发现TPO-Ab抗体水平与TSH水平和甲状腺组织中淋巴细胞浸润密切相关。本研究结果显示，采用疏调气机汤治疗后，能够降低HT大鼠模型升高的TG-Ab、T P O-A b、Ig G 4 及TSH水平，升高TSH水平。试验证明疏调气机汤可以显著降低大鼠自身抗体的水平及改变甲状腺激素，使其逐渐恢复接近正常组水平，缓解大鼠的病理状态。IFN-与 TGF-1 是 HT 发病过程中主要的 2 条路径,辅助F第4期性 T细胞 1/辅助性 T细胞 2(Th1/Th2)及辅助性 T细胞17/调节性 T 细胞（Th17/Treg）平衡。Th1/Th2、Th17/Treg细胞失衡则会导致免疫功能失调，从而引起自身免疫性疾病的发生 17 ,IFN-为Th1 细胞因子,可增强甲状腺上皮细胞HLA-II类抗原的表达 15;TGF-1 是促进 Th17 和 Treg 分化的重要生长因子，有研究报道阻断TGF-1信号传导可抑制Th17分化并改善Th17/Treg平衡 18 。本研究结果显示，与模型组比较，疏调气机汤高浓度组可以显著降低IFN-和TGF-1水平,因此推断疏调气机汤可能通过Th1/Th2与 Th17/Treg 平衡对HT大鼠产生治疗效果。由于本试验只研究疏调气机汤对HT大鼠的基本治疗作用，未深入了解其机制，具有一定的局限性，将在后期试验中继续深入研究。参考文献1李叙颖，张兰，王琳，等.软坚消瘘颗粒对肝郁脾虚型桥本甲状腺炎模型大鼠Treg和Th17细胞因子表达的影响 J.吉林大学学报（医学版),2 0 19,45(3)：558-56 5.2孙颖,张薪泞,罗微.血清IgG4对桥本甲状腺炎亚型鉴别的诊断价值 J.实用医学杂志，2 0 19,35(13):2 148-2 151.3郭利华，张超一，卢佳岑，等.疏调气机学说在肿瘤防治中的运用 J.云南中医中药杂志，2 0 19,40(2)：9 5-9 6.4何思锦，陈奇刚，刘朵，等.疏调气机汤治疗中风后并发症验案举隅 .湖南中医杂志，2 0 2 2,38(6)：7 4-7 6.5张芳.疏调气机汤对肝郁脾虚型甲减合并桥本氏甲状腺炎的临床观察 D.昆明：云南中医药大学，2 0 2 0.6袁强华，呼梅，谈静。化扁方标准汤剂制备工艺 .中成药,2019,41(7):1672-1675.7魏娟，骆霞，祝宇，等.多指标层次分析法结合Box-Behnken（上接第10 2 页）7俞晓玲，姜文倩，游晨，等.金线莲多糖的药理作用及其机制研究进展 J.药物评价研究，2 0 2 1,44(5)：1117-112 1.8 YE S,SHAO Q,ZHANG A.Anoectochilus roxburghii:a re-view of its phytochemistry,pharmacology and clinical applic-ationsJ.Journal of Ethnopharmacology,2017,209:184-202.9张付远,李丹丹,宋墩福.金线莲人工促进天然更新关键技术 .中国科技信息，2 0 2 1(2)：10 7-10 8.10陈莹,王文义,谌赛男,等.不同品系及生长期金线莲的金线莲苷含量变化研究 .中国现代中药,2 0 2 1,2 3(8)：142 3-142 9.11陈莹，张巧云，任丽，等.金线莲总黄酮提取工艺优化及不同月龄、品系金线莲黄酮含量比较 J.食品工业科技，2 0 19,40(8):184-189.12薛梅花,卢石孔，翁文，等.不同种植方式对金线莲黄酮类化合物含量的影响 J.福建分析测试,2 0 2 1,30(1)：33-36.龙小妹，等：疏调气机汤水提取工艺正交优化及其对桥本甲状腺炎大鼠治疗作用的研究Endocrinol Metab,2005,19:1-15.17 LI Q,WANG B,MU K,et al.Th