肾脏VDR表达与衰老密切相关-来自多个数据库的综合分析.pdf

老年医学与保健 2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4肾脏VDR表达与衰老密切相关-来自多个数据库的综合分析吴好打周小兰2,倪挺2,游怀舟2,陈靖“31.复旦大学附属华山医院肾病科，上海200040；2.复旦大学人类表型组研究院，上海200438；3.国家老年疾病临床医学研究 中心(华山)，上海200040摘要目的 维生素D缺乏是老年人常见的健康问题。肾脏是产生活性维生素D的重要器官，也是维生素D受体(Vi-t a min D r ec ept o r,VDR)表达较多的器官之一。作为体内最早发生衰老的器官之一，肾脏VDR缺乏与肾脏衰老的关系既往未见 报道。本研究拟通过人类和小鼠数据库分析，探究肾脏VDR表达随增龄的变化及与肾脏衰老的关系，并在动物中进行验证。方法 首先通过人类和小鼠公共数据库明确肾脏VDR的表达情况;其次对VDR高表达器官分析VDR随增龄的变化趋势，通过免疫组化及免疫印迹方法在6月、15月、21月龄的雄性野生型小鼠肾组织中进行验证;对上述野生型小鼠肾组织进行 P16免疫组化染色，并进行VDR和pl 6的相关性分析;最后，基于基因表达微阵列进行基因富集分析(Gen e Set En r ic h men t An a l y sis,GSEA)，在人类肾脏数据中探索与肾小球VDR相关的生物学途径。结果 人类和小鼠数据库都提示肾脏是VDR 表达最多的器官之一，随着增龄，肾脏VDR的表达呈下降趋势。基于基因表达微阵列的GSEA分析显示低VDR表达组富 集更多的衰老基因。野生型小鼠肾脏免疫组化和免疫印迹结果提示肾脏VDR表达随增龄下降，且与衰老标记物pl 6的表 达呈负相关。结论 肾脏VDR表达随增龄下降,参与衰老相关生物学途径，VDR表达降低与衰老标记物增加密切相关。关键词肾脏潍生素D受体;衰老Renal VDR expression is closely associated with aging:A comprehensive analysis from multiple databasesWu Ha o1,Zh o u Xia o l a n2,Ni Tin g2,3*,You Hu a izh o u1,3*,Ch en Jin g1,31.Department of Nephrology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China；2.Institute of Human Phenotype Group Research,Fudan University,Shanghai,200438,P.R.China；3.National Clinical Medical Research Center for Geriatric Diseasest Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai,200040,P.R.China*Co-c o r r espo n d in g a u t h o r:You Hu a izh o u,E-ma il:h u a izh o u y o u f u d a n.ed Ni Tin g,E-ma il：t in gn if u d a n.ed u.c nABSTRACT Objective Vit a min D deficiency is a c o mmo n h ea l t h pr o bl em in t h e el d er l y.Th e k id n ey is a n impo r t a n t o rga n t h a t pr o d u c es a c t iv e v it a min D a n d is a l so o n e o f t h e o r ga n s w it h h igh ex pr essio n o f v it a min D r ec ept o r(VDR).As o n e o f t h e ea r l iest a gin g o r ga n s in t h e bo d y,t h e r el a t io n sh ip bet w een r en a l VDR d ef ic ien c y a n d r en a l a gin g h a s n o t been r epo r t ed in t h e pa st.Th is st u d y a ims t o in v est iga t e t h e c h a n ges o f r en a l VDR ex pr essio n w it h a gin g a n d it s r el a t io n sh ip w it h r en a l a gin g by a n a l y zin g h u ma n a n d mo u se d a t a ba ses,a n d verify t h em in a n ima l s.Methods Firstly,t h e ex pr essio n of r en a l VDR was d et ermin ed t h r o u gh pu bl ic d a t a ba ses o f h u ma n s a n d mic e.Sec o n d l y,t h e t r en d o f VDR c h a n ges w it h a gin g w a s a n a l y zed f o r o r ga n s w it h h igh ex pr essio n of VDR.Immu n o h ist o c h emic a l a n d West er n bl o t t in g met h o d s were u sed to v a l id a t e t h e c h a n ges in r en a l tissue of ma l e w il d-t y pe mic e a ged 6,15,a n d 21 mo n t h s.Th e r en a l tissues of t h e a bo v e w il d t y pe mic e w er e st a in ed w it h pl6 immu n o h ist o c h emist r y,a n d t h e c o r r el a t io n bet w een VDR a n d pl 6 was a n a l y zed.Fin a l l y,Gen e set en r ic h men t a n a l y sis(GSEA)ba sed o n gen e expression mic r o a r r a y w a s u sed t o explore bio l o gic a l pa t h w a y s r el a t ed t o gl o mer u l a r VDR in h u ma n k id n ey d a t a ba se.Results Bo t h h u ma n a n d mo u se d a t a ba ses su ggest ed t h a t k id n ey w a s o n e o f t h e o r ga n s w it h t h e h igh est expr essio n o f VDR,a n d t h e ex pr essio n o f VDR in k id n ey t en d ed t o d ec l in e w it h a gin g.GSEA a n a l y sis ba sed o n gen e ex pr essio n mic r o a r r a y s sh o w ed t h a t t h e l o w VDR ex pr essio n gr o u p w a s en r ic h ed w it h mo r e a gin g gen es.Ren a l immu n o h ist o c h emist r y a n d West er n bl o t r esu l t s o f w il d-t y pe mic e in d ic a t ed t h a t t h e ex pr essio n o f VDR in t h e k id n ey s d ec r ea sed w it h a gin g a n d w a s n egat iv el y c o r r el a t ed w it h t h e ex pr essio n o f a gin g ma r k er pl 6.Conclusion Th e ex pr essio n o f VDR in t h e k id n ey s d ec r ea ses w it h a gin ga n d it is in v o l v ed in a gin g-r el a t ed bio l o gic a l pa t h w a y s.Th e d ec r ea se o f VDR ex pr essio n is c l o sel y r el a t ed t o t h e in c r ea se o f a gin g ma r k er s.基金项目：国家重点研发计划(2021YFC2500202,2020YFC2005000)；上海市科学技术委员会“科技创新行动计划”(20Y11904500,21ZR1411100)共同通信作者：游怀舟，电子信箱：h u a izh o u y o u f u d a n.ed u.c n倪挺，电子信箱：t in gn if u d a ii.ed u.c n779老年医学与保健2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4KEYWORDS k id n ey；v it a min D r ec ept o r；a gin g人口老龄化已成为世界范围内最为关注的社会问 题,预计到2050年冲国65岁以上人口将达到4亿，80 岁以上人口将达到1.5亿。衰老进程不可避免，但人 类衰老速度具有差异性。多项研究表明衰老发生并非 源于单一过程,而是由多种生物学过程共同驱动，如炎 症、自噬、氧化应激、表观遗传变化、线粒体功能障碍、DNA紊乱等。肾脏是体内最早发生衰老的器官之 一,肾脏衰老使老年人罹患慢性肾脏病(c h r o n ic k id n ey d isea se,CKD)等其他不良预后的风险明显增加，是 全球公共卫生与健康面临的巨大挑战。因此，深入探究 肾脏衰老的危险因素，对延缓肾脏衰老以及研发CKD 防治新策略具有重要的指导意义。肾脏衰老伴随多种结构改变和功能减退,包括肾 小球滤过率降低、肾小管调节酸碱平衡及电解质稳态 的能力下降、肾脏分泌促红细胞生成素及活性维生素 D(l,25(OH)2D3,1,25D)减少等。老年人由于光 照不足、年龄相关肾功能下降等，更容易导致维生素D 缺乏,缺乏率可超过70%5。维生素D缺乏不仅导致 钙磷代谢紊乱、骨质疏松及骨软化等矿物质骨代谢紊 乱,多项临床研究表明低维生素D状态与多种不良预 后相关，包括心血管事件、癌症、糖尿病、呼吸系统疾 病、肾功能衰竭及死亡同。1,25D与经典的核受体-维生素D受体(Vit a min D r ec ept o r,VDR)结合后发挥广泛的生物学作用。VDR广泛分布于体内30多种组织，肾脏、肠道、皮肤 及甲状旁腺等部位表达最丰富，是1,25D发挥生物学 作用的主要场所。维生素D/VDR系统参与多种生物 学过程，包括炎症、氧化应激、免疫调节、线粒体功能、凋亡、自噬等卬，这些生物学过程与衰老进程密切相 关。既往研究显示器官VDR缺乏后动物呈现早衰表 型,包括早期脱毛、生存率低、皮肤增厚、皮脂腺增大 及肌肉、心脏功能障碍同，提示体内器官局部VDR降 低参与衰老进程。人体血循环中1,25D主要由肾脏近端肾小管上皮 细胞合成分泌，肾脏同时也是1,25D作用的靶器官,VDR广泛分布于肾脏大多数细胞中，肾小管上皮细胞 VDR的表达尤为丰富。而作为最早发生衰老的器官之 一,肾脏VDR缺乏与肾脏衰老的关系既往未见报道。因此,本研究从动物和人类数据库的生物信息学 分析，以及自然增龄小鼠验证等方面，探究肾脏VDR 表达和肾脏衰老的关系。1资料和方法1.1 一般资料1.1.1小鼠肾脏数据库 小鼠年龄相关数据集从小 鼠单细胞开源数据库Ta bu l a Mu r is Sen is获得(h t-t ps:/t w c-st a n f o r d.sh in y a pps,io/ma c a/)。共 4 只雄鼠 和2只雌鼠被纳入研究，年龄跨度为1月到27月。该 数据库通过对小鼠17个器官组织(棕色脂肪组织、骨 骼、大脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、骨髓、骨髓脂肪 组织、胰腺、皮下脂肪组织、皮肤、小肠、脾脏、白细 胞)，在 1、3、6、9、12、15、18、21、24 及 27 个月等 10个不同时间节点进行RNA测序和血浆蛋白质组分 析,建立小鼠增龄图谱。1.1.2人类肾脏数据库 人类VDR表达数据集来 源于人类蛋白质图谱网站(h t t ps：/w w w.pr o t ein a tl a s.o r g/)。人类衰老数据集来源于Neph r o seq网站(h t t ps：/w w w.n eph r o seq.o r g/r eso u r c e)，该网站包含 多种临床肾脏数据集的基因表达谱，为全世界肾脏病 学者开展研究提供了便利。其中Ro d w el l Agin g Kidn ey 数据集包含有74例年龄在27岁至92岁之间的患 者,标本来源为肾切除术中切除的正常组织中获取的 肾脏样本，分为皮质(72例)和髓质(62例)。1.1.3动物研究 实验动物为C57BL/6小鼠，购自 集萃药康(8周，雄性4只，雌性4只)，进行繁殖和饲 养,不限制饮食和饮水。1.2研究方法1.2.1 小鼠肾脏数据库 从Ta bu l a Mu r is Sen is获取 小鼠在不同时间节点不同器官VDR的mRNA表达信 息，绘制条形图分析各器官VDR表达情况。选取 VDR高表达器官描述其增龄趋势。1.2.2人类肾脏数据库人类蛋白质图谱网站通过 输入目标基因VDR即可自动生成不同器官VDR表达 条形图。从Neph r o seq网站获取该数据集受试者肾脏 VDR表达及相关临床相关信息(包括年龄、性别、血 压、基础疾病、血液生化指标等)，排除血肌軒异常和 其他共病(如糖尿病和高血压)的受试者。将年龄按 照65岁作为二分类变量,或将年龄作为连续性变量,分析其与肾脏VDR表达的相关性。为进一步研究与 VDR相关的生物学途径,基于基因表达微阵列，使用 来自Neph r o seq专家共识的肾脏衰老相关基因集(Ro d w el l _Agin g_Kid n ey _u p)，对来自 Ju CKD Gl o m 研 究的肾小球转录组数据进行基因富集分析(Gen e Set 780 老年医学与保健 2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4En r ic h men t An a l y sis,GSEA)。1.2.3动物研究饲养雄性野生型小鼠，在6月龄、15月龄、21月龄时对饲养小鼠进行安乐死并留取肾 脏标本，各月龄小鼠=6。免疫组化:肾脏切片脱蜡，再水化,随后在EDTA微 波中进行抗原提取，并用5%牛血清白蛋白阻断。然后 将这些切片与 r a bbit a n t i-VDR(12550,c el l sign a l in g t ec h n o l o gy,1:100),r a bbit a n t i-CDKN2A/pl 6INK4a(a bl 08349,a bc o m,1：50)在4乜过夜，将载玻片与二 抗 FTTC 标记的 go a t a n t i-r a bbit 多克隆抗体(65-6120,In v it r o gen,1：200)孵育ho 最后使用 Ima ge-Pr o Pl u s 软件(Med ia Cy ber n et ic s)进行分析o免疫印迹实验(West emBl o t):用含有1%PMSF(ST506,Bey o t ime)和 1%蛋白酶抑制剂(HY-K0010,Med Ch emEx pr ess)的 RIPA 缓冲液(P0013B,Bey o-t ime)裂解肾脏组织的总蛋白。使用抗体如下：抗 VDR(12550,Cel l Sign d in g Tec h n o l o gy,1：5 000),ir L GAPDH(AC002,Abc l o n e,1:5 000)和抗 卩-a c t in(AF0003,Bey o t ime,1：5 000)o 使用 Od y ssey Fc 成像 系统(LI-COR Bio sc ien c e)对免疫印迹进行成像，用 Ima ge J软件对条带强度进行量化。1.3统计学分析 对正态分布且方差齐的数据采用r 检验或方差分析，否则采用秩和检验，双变量相关分析用 来分析两个因素之间的相关性。Ima ge J软件和Ima ge-Pr o Pl u s软件用来计算所有组化图片的阳性面积比。2结果2.1人类蛋白数据库显示肾脏是VDR表达最多的 器官之一人类蛋白数据库是基于蛋白组学、转录组学 以及系统生物学的数据，含有全部24 000种编码人类蛋 白质的基因的44个正常组织、18种肿瘤组织、69个细 胞系和18种血液细胞的mRNA和蛋白质表达信息，是 一个免费开放的人类编码蛋白信息的公共数据库。本研究通过该数据库观察各个器官VDR的mRNA 表达情况，发现VDR表达最多的器官是肠道和皮 肤，其次为肾脏、肾上腺、食道等(表1和图1)。2.2小鼠单细胞开源数据库显示肾脏是VDR表达 最多的器官之一，且随增龄表达呈下降趋势用小鼠 单细胞开源数据库分别对4只雄性小鼠(年龄跨度1、3、6、9、12、15、18、21、24及27个月)及2只雌性小 鼠(年龄跨度1、3、6、9、12、15、18及21个月)进行 器官VDRmRNA表达分析,共分析棕色脂肪组织、骨 骼、大脑、心脏、肾脏、肌肉、肝脏、肺脏、骨髓、骨髓脂肪表1人类数据库中各器官VDRmKNA表达情況器官VDR表达(n TPM)器官VDR表达(n TPM)1小肠23.915脂肪组织282皮肤22.116脾脏263结肠21.717胃224肾上腺13.718甲状腺235食道13.619胰腺2 26肾脏12.320前列腺217垂体11.121子宫内膜198阴道7.622输卵管129肺脏6.823心肌1210唾液腺6.124睾丸0 711乳房5.325肝脏0612子宫颈526卵巢0513膀胱3.127视网膜0214骨骼肌2.8组织、胰腺、皮下脂肪组织、皮肤、小肠、脾脏、白细胞等 17个器官。结果显示无论雌性或雄性小鼠，骨骼、肾 脏、皮肤和小肠均是VDR表达较多的器官(图2A-B)。对这四个器官VDR的表达单独提取并绘制条形 图，结果显示无论雄性还是雌性小鼠，肾脏VDR随月 龄增长表达均呈现先增长再降低的趋势;其中雄性小 鼠在6月龄肾脏VDR表达最高,之后逐渐降低，雌性 在9月表达最高,之后逐渐降低(图3 A-B)。2.3动物实验验证VDR随增龄表达变化 上一部 分研究提示雄性小鼠6月龄时VDR表达最多，于是本 研究选取6月龄(=6)、15月龄(=6)、21月龄(n=6)雄性小鼠验证以上数据库研究结果。小鼠肾 组织免疫组化染色和West er n Bl o t结果显示，肾脏 VDR的蛋白表达随增龄减少，P0.05(图4A-D)。2.4动物随增龄肾组织p16的表达及与VDR表达的关 系 肾组织P16免疫组化染色显示,pl 6的蛋白表达随增 龄增加，P 0.05(图5A-B)。肾组织pl 6的表达与 VDR 表达呈负相关(r=-0.811,P0.0001)(图6)。2.5肾脏VDR表达与衰老基因的GSEA分析 基 于基因表达微阵列分析，使用来自Neph r o seq专家共 识的肾脏衰老相关基因集(Ro d w el l _ Agin g _ Kid n ey _ u p)，对来自Ju _Gl o m_CKD研究的肾小球转录组数据 进行GSEA分析，探索VDR相关的生物学途径。Ro dw el l 数据集研究共发现44 928个基因，985个基因随 年龄变化(P BD 1.0VDRGAPDH.8.6.4.2.0o.o.o.o.e*C注：A：VDR 免疫组化染色（x l O）；B：A 半定量分析；C：VDR West er n Bl o t；D：C 的半定量分析。*P0.05；*P0.01；*0.001；*Pol6c9Ld()sfe+Q图6随增龄VDR和P16相关性分析2.6人类肾脏VDR随年龄的变化 从Neph r o seq提 取肾脏VDR mRNA表达数据，分析其与衰老相关性。结果显示:尽管没有统计学意义,但无论将年龄作为二 分类变量（是否M65岁）（P 0.05）还是连续性变量（P 0.05）,肾脏VDR mRNA表达都随年龄的增加呈 现下降趋势。（图7A-B）O前专家共识的肾脏衰老基因集。在Ju _Gl o m_CKD 数据库提取VDR表达的数据,将其按表达量（中位数）分为2组,以表达量高为对照组,以Ro d w el l _Agin g_Kid-n ey _u p为子集分析其相关的生物学途径。结果显示，低 VDR表达组呈现更多衰老表型,即Ro d w el l _Agin g_Kid-n ey.u p衰老基因集表达上调（图8），提示其生物学途 径与衰老密切相关，其标准富集得分（No r ma l ized En-783老年医学与保健2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4r ic h men t Sc o r e,NES）为 1.244,P=0.24o-.8.64.2Q O.O.6O.6 A uossaldxa KQ65岁 M65岁注：图A：年龄二分类变量;图B：年龄连续性变量。图7肾脏VDR表达都随增龄变化Enrichment plot:RODWELL_AGING.KIDNEY.UP20 40 80 BO 100 120 100 ISO 200Rank in Ordered Dataset220Enrichment profile HitsRanHng metric scores I24035302520151088 aaoaaaao.oe(S3)图8 GSEA富集分析3讨论本研究通过多种数据库分析及动物实验验证，发 现肾脏是VDR表达最多的器官之一，肾脏VDR整体 表达随增龄下降;肾脏VDR表达降低与衰老标记物增 加密切相关，基于基因表达微阵列的GSEA分析提示 肾脏VDR参与衰老相关生物学途径。临床研究证实，1,25D/VDR缺乏不仅导致钙磷 代谢紊乱、骨质疏松及骨软化，也参与肿瘤、心血管疾 病、糖尿病、感染、肺功能减退等增龄相关疾病的发生 和发展，与老年人死亡风险增加密切相关69】。基础 研究表明VDR全身基因敲除小鼠出现皮肤增厚和褶 皱、脱发、寿命减短等表现。器官局部VDR表达降 低可能参与组织细胞的衰老进程陆续有研究报道。在多种VDR条件性敲除小鼠的实验研究中可发现相 关部位的衰老表型，例如骨骼肌VDR敲除小鼠出现肌 肉纤维萎缩和衰弱、心脏VDR敲除小鼠出现心肌 肥厚和纤维化、肠道上皮VDR敲除出现支架蛋白 Ax in l的破坏从而引起结肠直肠癌和炎症性肠病。肾脏VDR缺乏与肾脏衰老的研究既往未见报道。有研究表明，人类衰老可出现四大表型一免疫型、代 谢型、肝脏型和肾脏型。肾脏衰老是重要表型之 一,预防及延缓肾脏衰老对提高人类生命质量至关重 要。CKD和衰老的肾脏在结构和功能变化上存在一 些共性,如肾小球硬化、基底膜增厚、肾小管萎缩、肾间 质纤维化、肾功能下降、蛋白尿等，因此CKD定程 度上可以被认为是加速的肾脏衰老。肾脏是产生活 性维生素D的重要器官，又是VDR作用的重要靶器 官,关于肾脏局部VDR调控肾脏衰老的研究目前未见 报道。本研究不仅发现肾脏VDR表达随增龄下降，还 提示肾脏VDR在衰老过程中的生物学作用,为进一步 揭示肾脏VDR在肾脏衰老中的作用奠定了基础。器官局部VDR在衰老调控中的作用机制尚未完 全阐明。Bo c h ev a13等研究显示皮肤VDR可以通过 诱导抗氧化反应、抑制DNA损伤及提高DNA修复等 建立对皮肤的各种抗衰老和光保护作用。衰老过程 中VDR表达降低会降低肌肉细胞对1,25-二径维生 素D的功能反应或损害肌肉细胞中蛋白质合成，接受 维生素D治疗可导致骨质疏松的老年妇女II型肌纤 维的横截面面积和相对数量增加，从而改善肌肉形态 和力量。衰老小鼠脑部VDR敲除可能通过维生素 D 依赖蛋白 c a l bin d in-D9k 和 c a l bin d in-D28k 对调控组 织中钙稳态的调控影响小鼠大脑矿物质稳态,使丘脑 血管周围出现严重钙化。肾脏衰老机制复杂，涉及 细胞衰老、凋亡、自噬、炎症、氧化应激、免疫等多方 面，这些均与VDR调节的生物学通路相重叠。因此，肾脏VDR缺乏可能是导致肾脏衰老的重要原 因，其确切机制有待进一步研究。综上所述,本研究从人和动物全面揭示了肾脏 VDR表达与衰老关系,提示由VDR介导的1,25D生 物学作用减弱可能是导致肾脏衰老的重要原因，为全 面揭示肾脏衰老机制和研发肾脏衰老防控新策略提 供了理论依据。参考文献1 Pa r t r id ge L,Deel en J,Sl a gbo o m PE.Fa c in g u p t o t h e gl o ba l c h a l l en ges o f a gein gJ.Na t u r e,2018,561(7721)：45-56.2 Lo pez-Ot in C,Bl a sc o MA,Pa r t r id ge L,et al.Th e h a l l ma r k s o f a gin gJ.Cel l,2013,153(6):1194-1217.3 Ah a d i S,Zh o u WY,Sc h iissl er-Fio r en za Ro se SM,et al.Perso n a l a gin g ma r k er s a n d a geo t y pes r ev ea l ed by d eep l o n git u d in a l pr o f il in gJ.Na t Med,2020,26(1)：83-90.(下转第788页)784 老年医学与保健2023 年第 29 卷第 4 期 Ger ia t r Hea l t h Ca r e,2023,Vo l.29.No.4等优点，可准确地观察肾脏肿瘤的血流灌注情况，在 显示病灶区范围和轮廓方面，更为精准。增加假包膜 和坏死区域的检出概率,对肾脏肿瘤的鉴别诊断以及 良、恶性判别提供了重要信息。由于本研究中病例数 目较少，尤其是比较少见类型的肾肿瘤例数较少，有 待于扩大样本量，继续跟进，总结规律，以提高CEUS 在诊断肾脏占位性疾病中的敏感性和特异性。参考文献:1 孔迅，张秀梅，刘毅，等.超声造影检查在肾脏非典型占位 性病变诊断中的价值中华泌尿外科杂志，2020,41(3)：185-189.2 Misd r a ji J,Ya n t iss RK,Gr a eme-Co o k FM,et al.Appen d ic ea l mu c in o u s n eo pl a sms:a c l in ic o pa t h o l o gic a n a l y sis o f 107 c a ses J.Am J Su r g Pa t h o l,2003,27(8):1089-1103.3 Wei SP,Xu CL,Zh a n g Q,et cd.Co n t r a st-en h a n c ed u l t r aso u n d f o r d if f er en t ia t in g ben ign f r o m ma l ign a n t so l id sma l l r en a l ma sses:c o mpa r iso n w it h c o n t r a st-en h a n c ed CT J.Abd o m Ra d io l(NY),2017,42(8):2135-2145.4 Gu l a t i M,Kin g KG,Gil l IS,et al.Co n t r a st-en h a n c ed u l t r aso u n d(CEUS)o f c y st ic a n d so l id r en a l l esio n s:a r ev iew J.Abd o m Ima gin g,2015,40(6):1982-1996.5 Sid h u PS,Ca n t isa n i V,Diet r ic h CF,et al.Th e EFSUMB gu id el in es a n d r ec o mmen d a t io n s f o r t h e c l in ic a l pr a c t ic e o f Co nt r a st-En h a n c ed u l t r a so u n d(CEUS)in No n-Hepa t ic a ppl ic at io n s：u pd a t e 2017(l o n g v er sio n)J.Ul t r a sc h a l l Med,2018,39(2):e2-e44.6 Mu k h eijee S,Pa t r a CR.Th er a peu t ic a ppl ic a t io n o f a n t i-a n giogen ic n a n o ma t er ia l s in c a n c er s J.Na n o sc a l e,2016,8(25):12444-12470.7 Av er k io u M,La mpa sk is M,Ky r ia k o po u l o u K,et al.Qu a n t if ic a t io n o f t u mo r mic n o v a sc u l a r it y w it h r espir a t o r y ga t ed c o n t r a st-en h a n c ed u l t r a so u n d f o r mo n if br in g t h er a py J.Ul t r a so u n d Med Bio l,2010,36(1)：68-77.8 曾功君，高云华，谭开彬，等.一种新型声学造影剂对兔肾 VX2肿瘤显像的实验研究J.中国医学影像技术，2004,20(3)：342-345.9 忻晓洁，张晟，穆洁.超声造影在鉴别小肾癌与脂肪缺乏型 肾错构瘤中的应用价值J.中华泌尿外科杂志，2016,37(6):436439.10 Ber t o l o t t o M,Bu c c i S,Va l en t in o M,et al.Co n t r a st-en h a n c ed u l t r a so u n d f o r c h a r a c t er izin g r en a l ma sses J.Eu r J Ra d io l,2018,105：4148.11 朱凯，苗陈堀，田野，等.肾细胞癌假包膜的研究进展J.中华泌尿外科杂志，2019,40(5)：398400.12 张颖，李建初.肾脏占位性病变超声造影的现状及发展趋势 J.中华医学超声杂志(电子版)，2015,12(7)：503-506.13 廖松林，刘彤华.肿瘤病理诊断与鉴别诊断学M.福州：福建科学技术出版社，2006：402403.14 郝美娜，赵玉珍，郭丹丹肾嗜酸细胞瘤的超声表现与病理 对照分析J.中国超声医学杂志，2013,29(6):572-574.15 王知力，唐杰，李稣，等.超声卿藪!1诊断肾脏占位性病变 的价值J.中国医学影像学杂志，2007,15(4):278-280.16卫月，蔡艳，许杨明.超声造影评估肾占位病变的临床应用 J.中国医药科学，2012,2(3)：145-146,162.(收稿日期：2023-03-31)(本文编辑：邓春光)(上接第784页)4 Den ic A,Gl a sso c k RJ,Ru l e AD.St r u c t u r a l a n d f u n c t io n a l c h a n ges w it h t h e a gin g k id n ey f J.Ad v Ch r o n ic Kid n ey Dis,2016,23(1)：19-28.5 Wei J,Zh u AN,Ji JS.A c o mpa r iso n st u d y o f v it a min D d ef ic ien c y a mo n g o l d er a d u l t s in Ch in a a n d t h e Un it ed St a t es J.Sc i Rep,2019,9(1)：19713.6 Kh a w KT,Lu ben R,Wa r eh a m N.Ser u m 25-h y d r o x y v it a min D,mo r t a l it y,a n d in c id en t c a r d io v a sc u l a r d isea se,r espir a t o r y d isea se,c a n c er s,a n d f r a c t u r es:a 13-y pr o spec t iv e po pu l a t io n st u d y J.Am J Cl in Nu t r,2014,100(5)：1361-1370.7 Wima l a w a n sa SJ.Vit a min D d ef ic ien c y:ef f ec t s o n o x id a t iv e st r ess,epigen et ic s,gen e r egu l a t io n,a n d a gin g J.Bio l o gy(Ba sel),2019,8(2)：30.8 Keisa l a T,Min a sy a n A,Lo u YR,et al.Pr ema t u r e a gin g in v it a min D r ec ept o r mu t a n t mic e J.J St er o id Bio c h emMo l Bio l,2009,115(3/5):91-97.9 Af za l S,Br 0n d u m-Ja c o bsen P,Bo jesen SE,et al.Gen et ic a l l y l o w v it a min D c o