生物性牙再生研究进展.pdf

生物性牙再生研究进展周 建1a,2,3，李晓钰1a，王松灵1a,1b,31 首都医科大学 a 口腔健康北京实验室，b 基础医学院，北京 100069；2 首都医科大学附属北京口腔医院 特诊特需科，北京 100050；3 首都医科大学附属北京天坛医院 口腔和全身健康融合与转化研究实验室，北京 100070收稿日期：2023-05-15基金项目：国家自然科学基金委员会重大研究计划资助项目（91649124）；国家自然科学基金委员会面上资助项目（82170951）；中国 医学科学院牙齿发育与再生创新单元资助项目（2019-12M-5-031）；北京市医院管理局使命计划资助项目（SML20151401）；北京市教委人才培养资助项目（119207020201）；“北京学者”计划资助项目（PM-2020_014226_000005，PXM2019_014226_000039，PXM2019_014-226_000011，PXM2018_014226_000021，PXM2017_014226_0000-23，PXM2018_193312_000006_0028S643_FCG，PXM2016_01422-6_000034）；北京市自然科学基金面上资助项目（7222079）作者简介：王松灵，男，中国科学院院士，研究方向为睡液腺、牙发育和再生，e-mail:，通信作者关键词：干细胞；组织工程；牙发育中图分类号：R78文献标识码：Adoi：10.13885/j.issn.1000-2812.2023.06.002文章编号：1000-2812(2023)06-0009-06第49卷 第6期2023年6月兰州大学学报（医 学 版）Journal of Lanzhou University（Medical Sciences）Vol.49 No.6June.2023健康口腔是“健康中国”国家战略的重要内容。临床上，受感染、炎症、外伤、手术等多种因素影响，牙及牙齿组织缺失非常普遍，不仅影响咀嚼、发音等生理功能，还与呼吸及消化系统疾病、心脑血管疾病、阿尔茨海默病及痴呆等神经系统疾病密切相关，严重影响患者身心健康。目前临床上修复方法包括活动义齿、固定义齿及种植牙，但这些均为非生理性修复，无法恢复天然牙的结构、形态和功能。20 年前基于干细胞的组织工程和再生医学出现以来，生物性牙再生被广泛关注，被认为是恢复牙齿形态功能最理想的方式，包括全牙、牙根、牙髓-牙本质和牙周组织再生及牙釉质仿生，见图1。图1 生物性牙再生的研究现状PDLSC为牙周膜干细胞，DPSC为异体牙髓干细胞。第49卷兰州大学学报（医 学 版）1生物性牙再生的研究方向生物性牙再生的研究方向1.1 全牙再生全牙再生旨在模拟牙发育生物学的基本原理，基于体外重组培养牙胚间充质细胞与牙胚上皮细胞以诱导牙齿再生。早期啮齿类动物实验发现，将重组细胞移植至小鼠肾囊膜下及小鼠颌骨内均可再生出全牙1，但其牙的发育模式及牙列形式与人类相差较大，研究策略具有明显局限性。为实现全牙再生的临床转化，本团队利用与人类牙发育模式相似、具有乳恒牙替换的小型猪作为动物模型，成功通过细胞重组技术实现了大型哺乳动物的全牙再生，为全牙再生提供了可靠的技术方法2。随后建立了小型猪牙胚发育不同阶段的互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）文库、基因表达谱、非编码核糖核酸（non-coding ribonucleic acid，ncRNA）表达谱、DNA甲基化谱及蛋白质调控网络3-5，发现 Wnt/-catenin信号通路可调控小型猪牙囊组织以促进牙根牙周的发育再生6，且发育过程中颌骨以外泌体形式传递到牙胚的ssc-mir-133b信号可精确调控牙齿的形态发生7。同时，通过体内外重组猪牙胚上皮和间充质细胞的方法，首次实现了小型猪的颌骨原位全牙再生8。此外，本团队发现乳牙发育快于颌骨产生的内应力可抑制恒牙发育，乳牙萌出内应力释放启动恒牙发育，揭示组织内应力调控器官的发育启动的分子机制，提出“组织内应力调控器官发育”学说9，为研究全牙再生及临床转化奠定了基础。最近一项研究10发现，表观遗传调控可以控制牙根的形成和发育。另有一项研究11通过单细胞测序，利用生物信息学技术，不仅更清晰、更准确地描述了牙胚基因的空间分布与动态变化，还通过体内移植的重组牙胚和体外的牙胚类器官证实了牙龛细胞包含与牙齿上皮相互作用并有效诱导牙齿重建的关键干细胞群，直接参与了牙胚发育与重组再生。近年来，在以小型猪为主的大型动物研究中发现通过细胞重组技术虽然能实现全牙再生，但成活率较低，且萌出不到位。因此，目前全牙再生临床前研究的关键问题仍应聚焦于种子细胞来源、恒牙发育调控机制及颌骨微环境等方面。1.2 生物牙根再生在生物性牙再生的方法中，全牙再生尚存在一系列瓶颈问题，距离临床应用尚有距离。从解剖学的角度分析，牙根是整个牙齿主要的支持和承重部分，在咀嚼过程中发挥着不可替代的作用。本团队在国际上首次提出“生物牙根”概念，即利用牙源性干细胞和生物支架材料，借助组织工程学的原理和技术构建出具有类似天然牙根生理解剖结构和功能的组织工程牙根，并在新形成的功能性生物牙根上再进行人工冠的修复，以恢复患者的咀嚼功能，并达到生理意义的修复。研究12发现，将自体根尖牙乳头干细胞（stem cell from apical papilla，SCAP）和牙周膜干细胞（peri-odontal ligament stem cell，PDLSC）复合羟基磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）生物支架材料，回植于小型猪颌骨内可成功再生包含有类牙本质、牙骨质及牙周膜结构的生物性牙根，并能行使功能，验证了“生物牙根”的概念。考虑到自体干细胞有限且不利于临床转化，另一项研究将异体牙髓干细胞（den-tal pulp stem cell，DPSC）以及 PDLSC 膜片复合HA/TCP生物支架材料，回植于小型猪颌骨内也成功实现了功能性生物牙根再生，进一步确定了生物牙根再生标准化的操作流程13。本团队利用小型猪同期进行生物牙根及种植修复，首次发现与种植牙相比，生物牙根在组织结构适合性、弹性模量、扭转力及抗压强度等力学性能匹配性方面，在钙、磷等元素构成相似性方面都更接近天然牙14。这表明生物牙根与种植体相比有明显优势，生物牙根再生技术基本成熟。目前，该生物牙根已被美国国立牙科博物馆永久收藏，展览注释为“为牙齿缺失修复提供全新的生物性修复方法”，收录于国际教科书。此外，有两项研究15-16报道了经过处理的同源异体牙本质基质（treated dentin matrix，TDM）可作为生物支架，在比格犬和恒河猴中均成功实现了生物牙根的生理性再生。与全牙再生相比，牙根结构较简单，且不存在后续萌出的问题，有望更早进入临床应用。现阶段仍需聚焦在干细胞优化、微环境改善及生物材料构建等方面，进一步为生物牙根再生基础与临床转化研究奠定基础。10第6期周 建，等：生物性牙再生研究进展1.3 牙髓牙本质再生牙髓组织包含各种类型的细胞和组织，主要功能是形成牙本质，维持牙本质的活力，提供营养、感觉和对各种病原体的防御。目前牙髓再生的策略分为两种：基于支架和/或外源性干细胞的牙髓再生；以及包括牙髓血运重建在内的内源性干细胞归巢。研究17证实，基于 HA/TCP 在内的多种支架材料，结合DPSC、脱落乳牙干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）或SCAP，再植于小鼠体内均可见牙髓牙本质复合体样结构形成。近期，有一项研究18利用间充质干细胞支持性的3D培养体系，将诱导形成干细胞小球的新型种子细胞-多能牙髓再生干细胞复合TDM 材料移植于裸鼠皮下，发现可高效地形成再生性牙髓牙本质复合体。同时，在大型动物模型的临床前研究中，利用小型猪自体DPSC结合-磷酸三钙（-tricalcium phosphate，-TCP）支架可介导猪的牙髓牙本质再生19；将复合粒细胞集落刺激因子的同源异体DPSC再植于比格犬的根管内同样实现了牙髓牙本质再生20。此外，有研究21报道通过利用SHED自组装的细胞聚合体技术，成功在小型猪根管系统内实现了牙髓牙本质的功能性再生，随机临床试验近 50 例患者获得成功。与上述干细胞移植方法不同，干细胞归巢是指内源性干细胞在相关生物信号分子的作用下，迁移至损伤组织并实现组织的再生修复22。多项研究23-24发现，由包括干细胞因子、基质细胞衍生因子-1在内的一系列生物信号分子介导的细胞归巢，在裸鼠皮下及比格犬恒牙牙髓腔内均实现了牙髓牙本质样组织的再生。此外，本团队通过结合 Wnt/-catenin 信号通路的重要配体 Wnt3a，成功在小型猪下颌切牙髓腔中原位再生结构、性能与原生牙本质无显著差异的管样牙本质，同时诱导生成含血管、神经的血管神经化牙髓组织，即功能化牙髓牙本质复合体25。目前，干细胞移植尚处于临床试验阶段，干细胞归巢还处于动物实验阶段。因此，进一步塑造易于牙髓牙本质再生的微环境，并建立规范完整的临床操作程序，将加快牙髓牙本质再生的临床治疗性应用。1.4 牙周组织再生牙周组织包括牙龈、牙骨质、牙周膜和牙槽骨 4 部分，发挥支持、固定和营养牙齿的作用。传统的再生性牙周治疗包括引导组织再生术、引导骨组织再生术、与生长因子有关的促进再生的方法等26，由于并不能从根本上恢复牙周组织的再生能力，造成再生效果不理想。考虑到再生依赖于牙周组织中剩余干细胞的数量及功能，因此基于间充质干细胞介导的组织工程牙周再生成为可能27。本团队在研究28-30中将自体及异体PDLSC移植到小型猪牙周炎模型中，牙周组织再生效果良好，表明PDLSC介导的组织工程可以成为治疗牙周炎的一种有效方法。随后发现，其作用机制主要取决于PDLSC的免疫调节特性。PDLSC具有低免疫原性，可通过分泌前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）诱导T细胞失去效能29。此外，PDLSC还通过程序性细胞死亡蛋白1和程序性细胞死亡配体1 介导的细胞间接触抑制B细胞激活，从而起到显著的免疫抑制作用31，为异体牙源性干细胞的临床转化应用奠定了理论基础。而且，不论采用局部注射细胞，还是运用局部手术翻瓣放置细胞膜片的方式，PDLSC、DPSC、SHED和小鼠骨髓间充质干细胞均有明显的牙周组织再生效果32-35。目前，基于干细胞的牙周组织再生已进入临床试验阶段36。其中，一是移植与明胶支架材料混合的自体PDLSC，可显著降低中、重度牙周炎患者的牙周袋深度，增加骨缺损区的骨密度37；二是移植与-TCP支架材料结合的自体PDLSC膜片，可显著改善牙周袋超4 mm深度患者的牙周袋深度和骨高度38，且没有发现可归因于研究性PDLSC的临床安全问题39。根据临床转化需求，本团队发现牙髓干细胞在增殖和抗衰老等方面有显著优势40，进而研发“人牙髓间充质干细胞注射液”，这是中国新的干细胞管理条例颁布以来 首 个被国家受理的干细胞新药（受理号：CXSL700137），该药物治疗方式为局部注射操作，相对微创、简便，现已进入临床三期试验，11将揭开干细胞治疗慢性牙周炎的新篇章，未来有望在慢性牙周炎治疗和牙周组织再生领域取得创新性突破，为人类慢性牙周炎的再生治疗提供新的治疗药物和方法。1.5 牙釉质仿生釉质是人体中最硬的组织，由终末分化的成釉细胞分泌细胞外基质并生物矿化而成，其中以羟基磷灰石为主的无机物占总重量的96%97%。目前牙釉质仿生再矿化是指通过模拟牙釉质发育过程，应用相关蛋白控制无定形磷酸钙在脱矿釉质表面有序排列，形成与天然釉质相似的羟基磷灰石晶体结构及相关机械性能。最近一项研究41报道了一种新的碳酸钙离子簇连续彩色成像及分类系统来建立仿生晶态-非晶态矿化边界，在维持原有结构复杂性的同时用以诱导牙釉质的外延生长，所形成的新牙釉质层具有与修补前相同的精密结构，实现了结构性的完全修复仿生，建立了新型的牙釉质仿生矿化策略。同时，还有一项研究基于“纳米结构单元的宏量合成及可控组装”的多尺度类牙釉质复合材料合成路线，实现了迄今为止与天然牙釉质成分、结构及性能最为相近的类牙釉质复合材料的可控性，其综合性能超过了天然牙釉质和已报道过的HA基复合材料、陶瓷-聚合物基复合材料，为人造牙釉质的宏观组装提供了一种新的工程设计方法和途径42。随着三维生物打印技术在构建人体器官系统方面的重大进展，近期有研究团队报道了基于3D打印制备的聚合渗透陶瓷网络复合材料，表现出与商用复合材料相当的抗弯强度，且具有可接受的水吸附性和可溶性，与牙釉质和牙本质具有良好的机械兼容性，可作为牙釉质仿生的理想材料43-44。目前所应用的仿生途径并不能完全模拟釉原蛋白、非釉原蛋白及矿物之间在时间及空间上的同步组装行为，因此仍需探究一种更趋近于天然牙釉质发育生成的手段，以实现釉质受损区域快速高效的仿生修复。2展望展望随着细胞生物学、分子生物学与材料学等基础学科的快速发展和广泛影响，以及干细胞与组织工程技术在基础研究和临床应用中的进展，使得再生医学在生物性牙再生的临床治疗方面显示出广阔的应用前景。其中，以干细胞治疗技术应用的临床示范基地和产业基地建设为代表的重大科技专项落地，持续为干细胞技术的发展注入新动能。同时，国家的政策引导及资金投入，保障了对干细胞技术研究的支持。但在进入广泛推进临床转化应用阶段之前，仍需开展很多工作，如尽快完善相关生物技术应用的政策法规及规章制度、制定行业标准、加快临床前研究等。此外，未来还需要加快核心关键技术研发、推进科技与产业的深度融合、强化科技成果转化等，以使生物性牙再生技术能够尽早地真正为患者服务。参 考 文 献1 Ikeda E,Morita R,Nakao 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