射干叶固态发酵对其有效成分影响的研究.pdf

St82试验研究饲料研究FEEDRESEARCHNO.162023射干叶固态发酵对其有效成分影响的研究龚婷吴姣姣徐晓玲杨利博武玉翠*（河北工程大学园林与生态工程学院，河北邯郸0 56 0 38)摘要：试验旨在研究射干叶固态发酵对其有效成分的影响。试验采用固态发酵技术，以植物乳杆菌为菌种，对射干叶的发酵条件进行优化，并对发酵后射干叶中总黄酮、总酚、抗氧化活性和5种黄酮类有效成分进行测定。结果表明，经固态发酵增加了射干叶中总黄酮、总酚的含量和抗氧化能力。射干叶最佳发酵条件为不添加碳源、液料比4mL/g。固态发酵显著提高了射干叶中鸢尾黄素、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量。研究表明，固态发酵技术提高了射干叶有效成分的含量，增强了抗氧化活性。关键词：发酵射干叶；有效成分；抗氧化活性中图分类号：S816.7文献标识码：A文章编号：10 0 2-2 8 13（2 0 2 3）16-0 0 8 2-0 5Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.16.016udy on effect of solid state fermentation of Belamcanda chinensis leaves on its active ingredienGONG TingWU Jiao-jiaoXU Xiao-lingYANGLi-boWU Yu-cuiAbstract:The experiment was to study the effect of solid state fermentation of Belamcanda chinensis leaves on the activecomponents.The experiment used solid state fermentation technology and Lactacillus plantarum as the culture to optimizethe fermentation conditions of Belamcanda chinensis leaves and determine total flavonoids,total phenols,antioxidantactivity and five kinds of flavonoids in fermented leaves.The results showed that solid state fermentation can increase thecontent of total flavonoids,total phenols and antioxidant capacity.The optimum fermentation conditions were no carbonsource and liquid to material ratio 4 mL/g.Solid state fermentation significantly increased the content of irisflorentin,irisflorentin and irisflorentin in Belamcanda chinensis leaves.The study indicates that through solid state fermentation,thecontents of active ingredients in Belamcanda chinensis leaves is increased,and the antioxidant activity is enhanced.Key words:fermentation of Belamcanda chinensis leaves;effective constituent;antioxidant activity射干（Belamcanda chinensis（L)D C.）为鸢尾科植物。2 0 2 0 版中华人民共和国药典中记载，射干以根茎入药，具有清热解毒、利咽、消炎等功效，用于治疗热毒痰火郁结、痰涎雍盛、咳嗽气喘等病症。现代中药研究指出黄酮类化合物是射干主要的化学成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等药理作用 2-3。射干的茎、叶、花、果实和根均含有黄酮类成分，且不同部位含量不同，射干叶中的总黄酮含量远高于射干根。目前，射干利用的绝大部分是干燥根茎，而射干叶很少被利用，甚至会被丢弃，造成射干资源的极大浪费。近年来，在畜牧养殖行业，寻找抗生素的替代品迫第一作者：龚婷，硕士，研究方向为中药发酵技术、中药材有效成分分离提取。通信作者：武玉翠，博士，副教授，硕士生导师。基金项目：河北省重点研发计划项目（项目编号：2 0 32 6 418 D、19226412D）；河北省高等学校科学技术研究项目（项目编号：ZD2021310）；邯郸市科学技术研究与发展计划（项目编号：21422083257)收稿日期：2 0 2 3-0 1-0 5在眉睫。中草药作为饲料添加剂应用于养殖动物疾病的防治，不仅可以提高畜禽的生长性能，还可以降低药物残留。邓素平等 5 研究发现，射干中的异黄酮类和三类物质为其主要的抗病毒成分，可以作为防治鸡传染性喉气管炎的有效成分。发酵中草药是指借助微生物的作用，在适当的接种量、温度、时间、湿度条件下对中草药进行发酵，不仅可以提高中草药的有效成分，还可以降低毒性，减少毒副作用 6 ，从而作为绿色饲料添加剂更好地替代抗生素 7 。本试验设置添加与不添加碳源、液料比两个不同的变量，通过植物乳杆菌对射干叶进行固态发酵，探究发酵对射干叶总黄酮、总酚含量、抗氧化能力和5种有效成分的影响，为发酵射干叶作为饲料添加剂代替抗生素治疗动物疾病提供参考，促进射干非药用部位的开发与利用。1材料与方法1.1药材与试剂芦丁标准品品（质量分数 99%）、没食子酸、2,2-联苯基-1-苦基肼基（DPPH）、2,2 -联氨-双二胺盐（A BT S）、Fo l i n-Ci o c a l t e u 试剂、水溶性维生素E（美国米(3)(2)NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH83试验研究Sigma公司），无水乙醇、10%AICl溶液、5%NaNO,溶液、4%NaOH溶液、Na,CO;溶液（实验室配制），葡萄糖、植物乳杆菌（ATCC8014）（苏州达麦迪生物医学科技有限公司），鸢尾苷、野鸢尾苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、鸢尾黄素、色谱级乙腈（成都普瑞法科技有限公司），射干叶采自河北工程大学校园。1.2仪器设备Agilent1100系列高效液相色谱仪、UV检测器、Agilent色谱工作站、大功率破壁机、KQ-100DE型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），ST8R台式高速冷冻离心机（美国赛默飞），HH-S恒温水温箱（天津赛德利试验分析仪器制造厂），普析TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），千分位电子电子天平（青岛聚创环保设备有限公司），LDO-101-1电热恒温鼓风干燥箱（上海龙跃仪器设备有限公司），高压蒸汽灭菌锅，超净工作台。1.3试验方法1.3.1射干叶预处理新鲜的射干叶流水洗净，于50 恒温干燥箱中干燥，烘干后粉碎，过6 0 目筛，密封保存。1.3.2发酵工艺称取射干叶粉3g，按照不同液料比加入蒸馏水，于121灭菌2 0 min，冷却，在超净工作台中加入8 0 0 L植物乳杆菌溶液，菌液浓度配置为1g/mL，30 恒温培养7 d后得到发酵产物即射干叶发酵。称取3g射干叶粉，加入液料比为4mL/g的蒸馏水，灭菌，按照上述操作进行发酵作为对照组。1.3.2.1添加与不添加碳源对射干叶发酵的影响称取3g射干叶粉2 份，液料比4mL/g，1份添加碳源（1g葡萄糖），1份不添加碳源。灭菌后加入植物乳杆菌，经固体发酵后得到添加碳源发酵（G1）和不添加碳源射干叶发酵（GO），同时设置对照组，试验重复3次。1.3.2.2不同液料比对射干叶发酵的影响分别称取射干叶粉3g，按照液料比3、4、5、6、7mL/g加入蒸馏水，不添加碳源，灭菌后加入植物乳杆菌，发酵得到不同液料比射干叶发酵，试验重复3次。1.3.3射干叶发酵中的成分提取将射干叶发酵于50 恒温干燥箱中干燥，精密称取2 0 mg，加入6 0%乙醇，置于超声波清洗机中，在超声功率8 0 W、超声温度7 0、超声频率40 kHz条件下提取30min。50 0 0 r/m i n 离心3min。沉淀复提1次后，得上清液，-2 0 保存，用于总黄酮、总酚和抗氧化活性测定 8 。1.3.4射干叶发酵中的总黄酮含量、总酚含量和抗氧化能力测定1.3.4.1总黄酮含量测定青确称量10.0 mg芦丁标准品，配置浓度为1.0 g/L的标准芦丁母液，分别稀释成浓度为0.0 1、0.0 5、0.10、0.15、0.2 0、0.2 5、0.30、0.40、0.50 g/L的梯度溶液，吸取各梯度50 0 L至10 mL离心管中，分别加入4mL60%乙醇，10 0 L5%NaNO,溶液，混匀，室温静置6 min；加入10 0 L10%AICl,溶液，混匀，室温反应6 min；最后加入30 0 L4%Na0H溶液，室温显色反应10 min；空白对照用6 0%乙醇 9。使用紫外可见分光光度计，调至510nm波长处测定各反应液的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度（g/L）为横坐标，得出线性回归方程为y=1.0295x-0.0018，R=0.9992。移液枪各吸取1.3.3中500L上清液，分别加入离心管中，按芦丁标准曲线的方法进行样品总黄酮含量测定，记录各样品的吸光度，代入线性方程，计算总黄酮含量。总黄酮含量=浓度提取剂总量(mL)/样本重(g)(1)1.3.4.2总酚含量测定精密称取10.0 mg没食子酸标准品，使用蒸馏水配置终浓度为1.0 g/L的没食子酸标准品母液；依次稀释成浓度为5、10、2 0、30、40、50、10 0 mg/L的梯度溶液；取各梯度2 0 0 L至10 mL离心管中，分别加入2 0 0 LFolin-Ciocalteu试剂，充分混匀黑暗反应8 min；加入600 L Na,CO；（7.5%），4 m L蒸馏水，40 水浴30minl。在7 6 5nm下测定反应液的吸光度，重复3次。以吸光度为纵坐标，浓度(g/L)为横坐标，得回归方程y=4.9568x+0.0143，R=0.9999。根据1.3.3中方法提取上清液，移液枪各吸取2 0 0 L分别加入离心管中，按没食子酸标准曲线的方法进行样品总酚含量测定，记录各样品的吸光度，代入线性方程，计算总酚含量。总酚含量=浓度提取剂总量(mL)/样本重(g)1.3.4.3DPPH自由基清除率的测定精确称取1mgDPPH，使用甲醇溶液定容至10 0 mL，得到浓度为0.0 1%的DPPH反应溶液，避光备用。分别将1.3.3样品提取液稀释成浓度为0.0 5、0.10、0.2 0、0.40、0.60、0.8 0、1.0 0、1.2 0、1.40、1.6 0 g/L。取30 0 L不同浓度的样品稀释液，加入1.2 mL的DPPH反应液，摇匀后，室温避光静置30 min，于波长为517 nm处测得反应液吸光度（A样品），同时将甲醇反应液的吸光度作为空白（A 空白），重复3次取平均值。根据DPPH自由基清除率公式，计算不同浓度下样品DPPH自由基清除率，以样品浓度为横坐标、DPPH清除率为纵坐标绘制曲线。通过GraphPad Prism软件计算出不同浓度下样品自由基清除率的ICso值。DPPH自由基清除率=(1-A样品/A空白)10 0%1.3.4.4ABTS+自由基清除能力的测定称取38 4.0 8 mgABTS使用蒸馏水定容至10 0 mL，配制成浓度为7 mmol/L的ABTS溶液，称取6 6.2 8 4mgK,S,Og，用蒸馏水定容至10 0 mL，配制成浓度为2.45mmol/L的K,S,O:溶液。将上述2 种溶液各取10 mL，2.NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH84试验研究混匀后避光放置12 16 h，得到工作液母液。加入适量的无水乙醇稀释，测定波长为7 34nm的吸光度为（0.7 0.0 2），得到工作液。然后吸取7 50 L工作液和100L待测射干叶发酵溶液混合摇匀，室温下避光反应6 min后，于7 34nm处测吸光度（A样品），使用无水乙醇代替样品液作为对照测定吸光度（A空白），按照公式（4）计算ABTS+自由基清除率。ABTS+自由基清除率=(1-A样品/A空白)10 0%(4)以水溶性维生素E（T r o lo x）作为标准品，用无水乙醇稀释成浓度为0.0 5、0.10、0.15、0.2 0、0.2 5、0.30 mol/L的标准品溶液。以标准品浓度为横坐标，ABTS+自由基清除能力为纵坐标，得到线性回归方程y=0.0007x+0.0017，R=0.9938。以每克射干叶发酵干粉内Trolox抗氧化活性当量为单位(umol/g)1.3.5射干叶发酵中5种有效成分含量测定1.3.5.1对照品溶液制备精密称取适量的鸢尾苷、野鸢尾苷、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、莺尾黄素对照品，使用7 5%甲醇溶解并定容至2 5mL，作为对照品溶液。1.3.5.2供试品溶液制备精密称取对照组、不添加碳源射干叶发酵0.5g（精确至0.0 0 0 1g）至10 mL离心管，加入7 5%甲醇10mL，超声1h，30 0 0 r/m i n 离心5min，上清液移入新的离心管中，残渣再重复提取1次，合并上清液，冷却至室温，使用7 5%甲醇定容至刻度，0.45m微孔滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液。1.3.5.3色谱条件利用HPLC测定射干叶发酵中5种有效成分。色谱柱:CAPCELL PAK C18 MGII 250 mm 4.6 mm，5 L;预柱：Alltech C18 guard column（7.5 mm 4.6 mm,5m)；流动相：乙腈（B）及0.4%冰醋酸（A)；流速：1.0mL/min；检测波长：2 6 9nm；柱温：30；进样量：10L。梯度洗脱条件见表1。表1洗脱梯度条件时间/minA/mLB/mL02592838172535839117193545817919214560797421266065746026406575605040501.3.5.4标准曲线的制定精密吸取混合对照品溶液至5个不同体积置量瓶中，75%甲醇定容至刻度，进样10 L测定。以峰面积y为纵坐标，浓度x（m g/L）为横坐标，绘制标准曲线，发酵后射干叶黄酮类成分标准曲线见表2。表2发酵后射干叶黄酮类成分标准曲线项目标准曲线R2鸢尾苷y=44 311.53x+12 491.520.999 982野鸢尾苷y=38 237.83x+10 335.420.999 985野鸢尾黄素y=51 085.08x+15 155.860.999 981次野鸢尾黄素y=44 564.57x+14 643.150.999 977鸢尾黄素y=57 796.35x+18 222.630.999 9772结果与分析发酵对射干叶总黄酮含量的影响(见图1、图2)由图1、图2 可知，发酵增加了射干叶中总黄酮含量。不添加碳源的射干叶发酵（GO）总黄酮含量比对照组提高10 8.93%，比添加碳源射干叶发酵（G1）提高了8 2.97%。液料比显著影响了射干叶发酵中的总黄酮含量。液料比为4mL/g时，射干叶发酵中的总黄酮含量最高，达到6 2.12 mg/g，但随着液料比的继续增加，射干叶发酵中总黄酮含量反而下降。70a60(8/au)/鲁号显巢5040bC3020100对照组GO组G1组组别图1碳源对射干叶发酵总黄酮含量影响70Ta60(3/u)鲁号l巢b50dd40302010034567液料比/(mL/g)图2液料比对射干叶发酵总黄酮含量影响2.2发酵对射干叶总酚含量的影响(见图3、图4)14ab12C(3/au)/鲁号湿1086420对照组GO组G1组组别图3碳源对射干叶发酵总酚含量影响由图3、图4可知，射干叶固态发酵后总酚含量显著增加。不添加碳源的总酚含量比添加碳源提高了17.14%。NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH85试验研究不同液料比射干叶发酵的总酚含量无显著差异。不添加碳源进行射干叶发酵提高了总酚的含量，但液料比对射干叶发酵总酚含量影响较小。结合总黄酮含量的变化，最佳发酵条件为不添加碳源、液料比为4mL/g。16厂aaa14aa(3/aul)/鲁号湿贸12108642034567液料比/(mL/g)图4液料比对射干叶发酵总酚含量影响2.3发酵对射干叶抗氧化活性的影响2.3.1DPPH自由基清除率测定结果2.3.1.1碳源对射干叶发酵DPPH自由基清除率的影响(见图5、表3)由图5可知，不添加碳源射干叶发酵(GO)DPPH自由基清除率高于添加碳源射干叶发酵（G1）；添加碳源射干叶发酵DPPH自由基清除率低于对照组，表明添加碳源会降低DPPH自由基清除率。ICso值是评价抗氧化力强弱的重要指标，抗氧化性强弱与ICso值成反比，即ICso值越小，表明抗氧化能力越强。由表3可知，不添加碳源射干叶发酵(GO)ICso值（0.347 3%）低于对照组IC5o值（0.4538%）禾和添加碳源射干叶发酵(G1）（0.516 1%），表明不添加碳源可以提高射干叶发酵抗氧化能力。0.60.50.4-对照组+GO组0.3-Gi组0.20.100.20.40.60.81.01.221.41.61.8射干叶发酵浓度/g/L)图5碳源对发酵射干叶发酵DPPH自由基清除率的影响表3碳源对射干叶发酵DPPH自由基清除率ICso值的影响单位：%项目对照组GO组G1组IC500.453 80.34730.516 12.3.1.2液料比对射干叶发酵DPPH自由基清除率的影响(见图6、表4)由图6 可知，不添加碳源、不同液料比射干叶发酵对DPPH自由基清除率高于对照组。液料比的影响作用呈现先升高然后逐渐降低的趋势。当液料比为4mL/g时，DPPH自由基清除率达到最高。抗氧化能力与黄酮含量呈正相关，DPPH自由基的清除率随着提取物黄酮浓度的增加而增大。发酵后射干叶在不同浓度下抑制自由基的能力有所差异。由表4可知，在试验浓度范围内，液料比为4mL/g时，射干叶发酵的ICso值最低，表明具有较好的DPPH自由基清除能力。0.6%/率塑凰清甲月H0.50.43.4567一米0.3对照组0.20.100.20.40.60.81.01.21.41.61.8浓度/g/L)图6 液料比对射干叶发酵DPPH自由基清除率的影响表4液料比对射干叶发酵DPPH自由基清除率IC5o值的影响液料比/(mL/g)项目34567ICs0/%0.468 30.347 30.367 20.419 60.44492.3.2ABTS+自由基清除力测定结果(见图7、图8)由图7、图8 可知，不添加碳源射干叶发酵(GO)对ABTS+自由基的清除能力高于添加碳源射干叶发酵（G 1）和对照组。不添加碳源、不同液料比条件下，射干叶发酵对ABTS+自由基清除能力排序为液料比4 mL/g液料比5mL/g液料比7 mL/g液料比6 mL/g液料比3mL/g，表明液料比在4mL/g时，发酵对ABTS+自由基的清除力最高。250a200b150100500对照组GO组G1组组别图7碳源对射干叶发酵ABTS+自由基清除能力的影响250ab200d15010050034567液料比/(mL/g)图8液料比对射干叶发酵ABTS+自由基清除能力的影响NO.162023饲料研究FEEDRESEARCH86试验研究2.4射干叶发酵中5种黄酮类有效成分含量测定结果(见表5)由表5可知，发酵后射干叶中鸢尾黄素、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量分别比对照组提高了2 8.39%、17.36%和30.35%。表5发酵后射干叶5种黄酮类成分含量变化单位:mg/g项目对照组射干叶射干叶发酵鸢尾苷0.000 000 0.0000000.000 000 0.000 000野莺尾苷0.0210000.0000440.0000000.000000野鸢尾黄素1.201 000 0.002 8371.942 000 0.005 817次野鸢尾黄素0.190 000 0.000 3170.223 000 0.001 112鸢尾黄素0.313 000 0.000 6280.408 0000.0034173讨论3.1碳源对射干叶发酵的影响本试验以射干叶作为发酵原料，以植物乳杆菌为菌种，30 恒温发酵7 d，利用超声波振荡提取法得到射干叶发酵产物，即射干叶发酵的提取液。采用亚硝酸钠-氯化铝比色法测定总黄酮的含量、利用福林酚法测定总酚的含量，进一步使用HPLC测定射干叶发酵中5种黄酮类有效成分的含量变化。结果表明，相比对照组，不添加碳源的试验组总黄酮和总酚含量均显著提高，发酵后的射干叶总黄酮含量比对照组提高10 8.93%，发酵后的总酚含量比对照组提高2 0.98%。在发酵阶段，添加碳源与不添加碳源相比，不添加碳源更能有效提高总黄酮和总酚的含量。刘卢生等 12 研究发现，当发酵物中含有足够多的葡萄糖时，pH值会迅速降低，达到4以下，低pH值抑制了乳酸菌继续生长繁殖，导致葡萄糖对紫花首进行发酵的促进作用并不明显 12 3.2液料比对射干叶发酵的影响本研究从总黄酮含量、总酚含量、DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率4个方面均得出相同结论，不同液料比会影响发酵后射干叶成分含量和抗氧化活性，其中液料比为4mL/g时，发酵后射干叶的总黄酮和总酚含量最高，分别达到了6 2.17、13.35mg/g，且抗氧化能力最强。文培华等 13 研究发现，虎耳草的抗氧化活性与黄酮的含量呈正相关。张祺祺等 14 研究发现，抹茶茶汤中的多酚含量及体外抗氧化活性存在正相关关系，但影响不显著。本试验中，当液料比为4mL/g时，射干叶中总黄酮和总酚含量最高、抗氧化能力最强。相关研究发现，在动物生产中应用射干不仅对治疗产蛋鸡传染性支气管炎具有明显效果，而且还可以促进肉鸡生长，具有良好的防病效果 15-16 3.3HPLC测定射干叶发酵有效成分分析本研究发现，发酵后射干叶中鸢尾黄素、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量比对照组均有所增加。张晓瑞等17 研究发现，利用枯草芽孢杆菌发酵能够提高射干根鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的含量，表明发酵可以增加射干有效成分的含量。4结论在不添加碳源、液料比为4mL/g条件下对射干叶进行固体发酵，可以有效提高总黄酮和总酚的含量，增强抗氧化能力。本研究为射干作为绿色饲料添加剂、代替抗生素治疗家禽疾病提供一定的参考。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典(2 0 2 0 年版):一部 M.北京：中国中医药科技出版社,2 0 2 0.2凌悦,陈金鹏,叶晴,等.射干的研究进展及其质量标志物的预测分析.中草药,2 0 2 2,53(5):1595-16 0 8.3张良,张玉奎,陈艳,等.射干叶中异黄酮类化学成分的研究.天然产物研究与开发,2 0 11,2 3(1):6 9-7 1.4沈华南.中草药饲料添加剂在畜禽养殖中的研究与应用进展.中国农业文摘-农业工程,2 0 2 1,33(6):8 1-8 3.5邓素平,郑继方,罗永江,等.中药防治鸡传染性喉气管炎的研究进展湖北农业科学,2 0 10,49(9):2 2 7 5-2 2 7 8.6宋予震,史洪涛,范明夏,等.微生物发酵中药研究进展.动物医学进展,2 0 2 1,42(1):10 5-10 9.7李秋月,林连兵,杨雪娇,等.微生物发酵中草药的研究现状.微生物学通报,2 0 2 1,48(6):2 2 32-2 2 44.8李森林.射干中异黄酮类化合物的分离提取及体外活性研究 D.长春：长春师范大学,2 0 18.9齐建红.超声细胞粉碎法提取射干总黄酮的工艺研究.陕西农业科学,2 0 19,6 5(8):1-3.10凌永梅,谢典,朱聪,等.山慈菇中总酚的提取工艺优化.江西科技师范大学学报,2 0 2 1(6):10 6-110.11杨利军,田迪英.11种中草药抗氧化活性与黄酮含量相关性研究.食品工业科技,2 0 0 8(1):119-12 3.12刘卢生,玉永雄,王东,等.紫花首草渣及浆汁发酵研究D.草业科学，2010,27(3):144-147.13文培华,颜怡冰,王文君,等.虎耳草总黄酮含量测定及其抗氧化性.食品工业,2 0 2 2,43(2):315-319.14张祺祺,程俊侠,王琦,等.抹茶茶汤感官理化特性、多酚组成及抗氧化活性研究.食品与机械,2 0 19,35(9):18 1-18 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