麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及其作用机制.pdf

第 卷第期陕西科技大学学报V o l N o 年月J o u r n a l o fS h a a n x iU n i v e r s i t yo fS c i e n c e&T e c h n o l o g y A u g 文章编号:X()麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及其作用机制齐琦,田露,杨思琪,龚国利(陕西科技大学 食品科学与工程学院,陕西 西安 )摘要:藤黄微球菌是一种条件致病菌,不仅会感染养殖水产品,还会导致人体感染麝香草酚作为一种绿色、天然、高效的植物源抗菌剂,具有良好的抑菌活性本研究在细胞水平上探究了麝香草酚对藤黄微球菌的生长、细胞膜通透性以及细胞形态等多方面的影响结果表明,麝香草酚对藤黄微球菌的最小抑菌浓度为 m g/m L,在该浓度下藤黄微球菌的细胞膜电位、胞内AT P、D NA完整性、胞内p H分别降低了 、倍,胞内活性氧增加了 倍,并通过C L S M和S EM进一步观察到细胞膜皱缩、破损揭示了麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及可能的抑菌机制,为麝香草酚作为天然抗菌剂提供理论支撑关键词:麝香草酚;藤黄微球菌;抑菌活性中图分类号:T S 文献标志码:AA n t i b a c t e r i a l a c t i v i t ya n da c t i o nm e c h a n i s mo ft h y m o l a g a i n s tM i c r o c o c c u s g a r c i n i a eQ IQ i,T I ANL u,YANGS i q i,G ONGG u o l i(S c h o o l o fF o o dS c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g,S h a a n x iU n i v e r s i t yo f S c i e n c e&T e c h n o l o g y,X i a n ,C h i n a)A b s t r a c t:M i c r o c o c c u s g a r c i n i a ei sac o n d i t i o n a l l yp a t h o g e n i cb a c t e r i u mt h a tn o to n l yi n f e c t sf a r m e da q u a t i cp r o d u c t s,b u ta l s oc a u s e si n f e c t i o n si nh u m a n s T h y m o l,a sag r e e n,n a t u r a la n dh i g h l ye f f e c t i v ep l a n t d e r i v e da n t i m i c r o b i a la g e n t,h a sg o o da n t i b a c t e r i a la c t i v i t y I nt h i ss t u d y,t h ee f f e c t so fm u s c i m o l o nt h eg r o w t h,c e l lm e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya n dc e l lm o r p h o l o g yo fM g a r c i n i a ew e r e i n v e s t i g a t e da t t h ec e l l u l a r l e v e l T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h em i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o no f t h y m o l o nMg a r c i n i a ew a s m g/m L,a tw h i c ht h ec e l lm e m b r a n ep o t e n t i a l,i n t r a c e l l u l a rAT P,D NAi n t e g r i t ya n di n t r a c e l l u l a rp Ho fMg a r c i n i a ed e c r e a s e db y ,a n d f o l d,r e s p e c t i v e l y,a n dt h e i n t r a c e l l u l a r r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s i n c r e a s e db y f o l d,a n df u r t h e rc e l lm e m b r a n ew r i n k l i n ga n db r e a k a g ew a so b s e r v e db yC L S Ma n dS EM T h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo f t h y m o la g a i n s tMg a r c i n i a ea n dt h ep o s s i b l em e c h a n i s mo f i n h i b i t i o nw e r er e v e a l e d,p r o v i d i n gt h e o r e t i c a l s u p p o r t f o r t h y m o la san a t u r a l a n t i b a c t e r i a l a g e n t K e yw o r d s:t h y m o l;M i c r o c o c c u s g a r c i n i a e;a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y收稿日期:基金项目:陕西省教育厅专项科研计划项目(J K );陕西省咸阳市秦创原科技创新专项项目(Z D Z X NY )作者简介:齐琦(),女,陕西咸阳人,在读硕士研究生,研究方向:天然食品防腐剂通讯作者:田露(),女,陕西榆林人,副教授,博士,研究方向:微生物代谢产物分离及鉴定,t i a n l u s u s t e d u c n第期齐琦等:麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及其作用机制引言藤黄微球菌属于微球菌属,在自然界中广泛存在,在人和其他哺乳动物的皮肤上可分离得到当机体抵抗力下降时,藤黄微球菌可能会引发如脑脊液感染、脑膜炎、脊髓感染、藤黄微球菌关节炎等疾病 研究表明,黄褐斑患者的面部藤黄微球菌数量高于正常人藤黄微球菌还会导致黄鳝出血病,造成经济损失在过去的二十年中,由于不规范地使用抗生素,以及遗传耐药性成分的不断演变和传播,导致多种多重耐药(MD R)甚至极端耐药(X D R)细菌病原体出现,增加了患者的发病率、死亡率和医疗成本而天然产物所具备的低毒、无公害和无抗药性等优势,使其被开发为新型抗菌剂并对解决当前抗生素危机提供了新思路麝香草酚又称百里酚,是伞花烃的天然酚单萜衍生物和香芹酚的异构体,具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗炎和解痉活性,以及作为生长促进剂和免疫调节剂的潜力据报道,麝香草酚可抑制食源性病原体生长,例如产气荚膜梭菌、大肠杆菌和李斯特菌,主要机制是通过降低细胞质膜上的p H使其去极化 p H梯度的降低也会对质子动力产生不利影响,导致细胞内AT P的消耗,从而导致细胞死亡,K h a n等 发现,麝香草酚会诱导变形链球 菌的自溶和 应激,诱导 提升自溶素 基因(a t l E)和超氧化物歧化酶基因(s o d A)的表达水平此外,R a n j b a r等 发现麝香草酚还具有抗真菌活性,表现为通过降低细胞壁降解酶的活性,抑制石榴果实腐烂真菌的生长然而目前还缺乏有关麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性和其作用机制的研究本文通过测定麝香草酚对藤黄微球菌的最小抑菌浓度、生长曲线、膜电位、胞内AT P水平、胞内活性氧含量、D NA完整性和胞内p H,同时通过激光共聚焦扫描显微镜(C L S M)和场发射扫描电镜(S EM)观察细胞膜完整性和细胞形态,探究麝香草酚对藤黄微球菌的抑制作用和可能的机制,为麝香草酚作为新型抗菌剂提供可靠的理论依据材料与方法 材料及仪器 菌株和培养物藤黄微球菌(B N C C ),购自北京细菌培养保藏中心(C h i n aB N C C),储存于 主要试剂麝香草酚(纯度 )、,二氯荧光素(上海生工生物工程股份有限公司),磷酸缓冲盐(北京索莱宝科技有限公司),L B肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司),D i B A C()(美国s i g m a公司),S Y T O/P I试剂盒(赛默飞世尔科技公司),A T P检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)主要仪器B S S电子天平(上海天平仪器厂),D Z F 真空干燥箱、TH Z A恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司),T G L M台式高速离心机(长沙英泰仪器有限公司),S y n e r g yH 多功能酶标仪(B T),L S M 激光共聚焦扫描显微镜(德国卡尔蔡司),ML A场发射扫描电子显微镜(美国F E I)实验方法 菌悬液的制备将保藏在 冰箱中的菌株用平板划线法接种在L B固体平板上,置于 恒温培养箱中培养 h挑取单菌落于L B肉汤培养基中活化,即可获得藤黄微球菌的菌悬液 麝香草酚对藤黄微球菌 最小抑菌浓 度(M i n i m u mi n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n,M I C)测定根据 节的方法制备O D 为(约 C F U/m L)的菌悬液本实验在 孔板中采用微量稀释法测定,先将麝香草酚溶解于无水乙醇中,制成 m g/m L的母液,在 孔板中加入菌悬液和母液,使麝香草酚的终浓度为 m g/m L、m g/m L、m g/m L、m g/m L、m g/m L、m g/m L和 m g/m L,以不含麝香草酚的实验组为阴性对照组,以终浓度为 m g/m L的氨苄青霉素钠的实验组为阳性对照组混合均匀后,将孔板进行恒温培养,用酶标仪测定 n m处的吸光值,并结合肉眼观察 麝香草酚对藤黄微球菌的生长曲线的影响根据 节中的方法制备菌悬液经 节测定得到M I C值后,在 孔板中加入菌悬液和母液,使麝香草酚的终浓度为 M I C、M I C、/M I C、/M I C、/M I C、/M I C、/M I C、/M I C,同时以不含麝香草酚的实验组作为对照组每隔h用酶标仪测定 n m处的吸光值,共检测 h,并绘制生长曲线 麝香草酚对藤黄微球菌膜电位的影响根据 节中的方法制备菌悬液离心收集菌体沉淀,用P B S洗涤菌体并重悬,加入母液后使麝香草酚的终浓度为、M I C和 M I C,培养h后离心收集菌体沉淀,洗涤并重悬后加入mM陕西科技大学学报第 卷D i B A C()膜电位荧光探针,避光孵育 m i n,分别吸取 L加入到黑色 孔板中多功能酶标仪测定荧光强度(激发波长 n m,发射波长 n m)麝香草酚对藤黄微球菌胞内AT P的影响方法同 节,得到麝香草酚处理并用P B S洗涤的菌体沉淀后,使用AT P检测试剂盒测定细菌胞内AT P含量 麝香草酚对藤黄微球菌胞内活性氧(R e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s,R O S)的影响方法同 节,得到麝香草酚处理并用P B S洗涤的菌体沉淀后,加入 L的 mM的,二氯荧光素,避光孵育h,离心并用P B S洗涤菌体沉淀后重悬各吸取 L加入到黑色 孔板中,测定荧光强度(激发波长 n m,发射波长 n m)麝香草酚对藤黄微球菌D NA完整性的影响方法同 节,向P B S重悬的菌悬液中加入 L的S Y T O荧光探针,避光孵育 m i n,分别吸取 L加入到黑色 孔板中,测定荧光强度(激发波长 n m,发射波长 n m)麝香草酚对藤黄微球菌p Hi n的影响根据 节中的方法制备O D 为(约 C F U/m L)的菌悬液,离心后用磷酸钾溶液洗涤菌体并重悬,加入mMc F D A S E荧光探针后孵育 m i n,洗涤菌体并离心用 mM葡萄糖溶液重悬菌体 m i n以去除未结合的c F S E荧光探针 P B S洗涤后重悬,加入母液使麝香草酚的终浓度为、M I C和M I C培养h后分别吸取 L加入到黑色 孔板中,测定荧光强度(激发波长 /n m,发射波长 n m)测定不同p H溶液负载荧光探针后的荧光强度,将激发波长在 n m和 n m下的荧光比值与藤黄微球菌的p Hi n构建校准曲线用N a OH/H C l调节缓冲溶液的p H值至、和 用缬氨霉素(M)平衡细胞的p H值使p Hi n等于p Ho u t最后测定荧光强度,并根据标准曲线计算细菌样品的p H值 麝香草酚对藤黄微球菌细胞膜完整性的影响方法同 节,得到麝香草酚处理的菌体沉淀,用P B S洗涤并重悬,向菌悬液中按(v/v)加入L的S Y T O和P I荧光探针,避光孵育 m i n,用P B S洗涤并重悬吸取 L菌悬液滴加在载玻片上,通过C L S M观察其荧光颜色的变化,拍照保存 麝香草酚对藤黄微球菌细胞形态的影响方法同 节,得到麝香草酚处理并用P B S洗涤后的菌体沉淀用(v/v)戊二醛在冰箱()固定过夜,P B S洗涤菌体,将无水乙醇稀释为、和 的梯度浓度,逐步脱水(每个梯度处理 m i n)用乙酸异戊酯重悬菌体 m i n后离心烘箱干燥后通过导电胶将菌体粘附在样品台上,溅射喷金,通过S EM观察细胞形态的变化,拍照保存结果与讨论 麝香草酚对藤黄微球菌的最小抑菌浓度最小抑菌浓度是指培养细菌 h后能抑制病原菌生长的最低药物浓度由图可见,当麝香草酚的浓度 m g/m L时,h后 n m处的吸光度值均已超过,且培养液出现浑浊,说明细菌 进 行 了 生 长 繁 殖;当 麝 香 草 酚 的 浓 度 m g/m L时,吸光度值均低于,与阳性对照组的数值相当,且培养液相对清澈,说明细菌的生长受到了抑制结果表明,麝香草酚对藤黄微球菌具有抑制作用,其M I C约为 m g/m L图麝香草酚对藤黄微球菌的最小抑菌浓度 麝香草酚对藤黄微球菌生长曲线的影响生长曲线是指培养细菌时,以O D 为纵坐标,以时间为横坐标作图得到的曲线由图可知,在h为藤黄微球菌的生长迟缓期,此时期各浓度下的吸光度未出现明显差异在 h内,浓度M I C组的细菌进入对数增长期,活菌数呈现直线上升,且随处理浓度的增加出现梯度降低趋势,表明麝香草酚对藤黄微球菌的生长曲线有明显第期齐琦等:麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及其作用机制影响;当浓度M I C时,未出现菌体繁殖,表明生长被完全抑制在 h内,细菌进入生长稳定期,此时期菌群总数几乎处于平坦阶段在第 h,对照组 的O D ,/M I C组 的O D ,菌群总数约降低了 ,说明即使麝香草酚的浓度低于M I C,对藤黄微球菌依然有明显的影响作用综上可见,麝香草酚严重影响了藤黄微球菌的生长曲线图麝香草酚对藤黄微球菌生长曲线的影响 麝香草酚对藤黄微球菌膜电位的影响膜电位是指生物细胞膜内外的电位差,由图可见,与对照组相比,经过麝香草酚处理h后,藤黄微球菌的细胞膜电位显著降低对照组的藤黄微球菌膜电位为 ,M I C组为 ,M I C组为 ,分别降低了 和 倍,表明麝香草酚引起了藤黄微球菌细胞膜的超极化,这可能会改变钾离子通道的活性并导致其泄露,从而干扰菌体的正常生命活动图麝香草酚对藤黄微球菌膜电位的影响 麝香草酚对藤黄微球菌胞内AT P的影响胞内AT P是细胞内最重要的能量分子,参与细胞的各种生命活动由图可见,对照组的AT P含量为 ,经M I C和 M I C处理后的细菌胞内AT P分别为 和,分别下降了 倍和 倍说明经麝香草酚处理后,藤黄微球菌的胞内AT P浓度显著降低胞内AT P的显著降低,可能是麝香草酚增加了藤黄微球菌的细胞膜的通透性,引起AT P的大量泄露;也可能是其影响了细菌胞内AT P的正常合成和代谢,导致胞内AT P的快速消耗或抑制了AT P的合成,最终紊乱菌体的正常生命活动,甚至导致菌体的死亡图麝香草酚对藤黄微球菌胞内AT P的影响 麝香草酚对藤黄微球菌胞内R O S的影响R O S是氧正 常 代 谢 的 天 然 副 产 物,在 恶 劣条件下,R O S水平会急剧增加 ,二氯荧光素二乙酸酯是 一种可渗透 细胞 的 荧 光 探 针,可定量R O S变化,用于评估毒理学中的整体氧化应激如图所示,对照组的R O S含量为 ,经M I C和 M I C浓度处理h后,藤黄微球菌的R O S含量分别为 和 ,分别增加了 倍和 倍表明麝香草酚会诱导细菌发生氧化应激,导致胞内R O S过量积累进而氧化损伤图麝香草酚对藤黄微球菌胞内活性氧的影响陕西科技大学学报第 卷 麝香草酚对藤黄微球菌D NA完整性的影响如图所示,对照组荧光强度为 ,而经M I C和M I C浓度处理h后,藤黄微球菌的荧光强度分别为 和 ,分别降低了 倍和 倍 S Y T O是一种可以和D NA小沟结合的荧光染料,荧光强度越高,则D NA的完整度越高表明随麝香草酚处理浓度增加,可与S Y T O结合的D NA被降解或结构被破坏,荧光强度逐渐降低 D NA损伤会抑制细菌的正常增殖和代谢,甚至导致菌体死亡图麝香草酚对藤黄微球菌D NA完整性的影响 麝香草酚对藤黄微球菌p Hi n的影响荧光探针c F D A S E易被细胞质中的脂酶水解,水解产物会发出绿色荧光,且在 n m和 n m处的荧光强度比值与p H呈现良好的线性关系,通过计算荧光强度比值,并与p H标准曲线进行构建,可以获得荧光强度比值与p Hi n的校准曲线:y x ,R 如图所示,未经处理的藤黄微球菌p Hi n为,而经过M I C和 M I C浓度处理h后,其p Hi n值为 和,分别降低了 倍和 倍 p H降低说明处理后的细胞内氢离子大量积累,导致离子通道的干扰和关闭,从而影响细胞膜的通透性和正常的生长代谢 麝香草酚对藤黄微球菌细胞膜完整性的影响图(a)表示对照组的藤黄微球菌,细胞膜完整从而发出绿色荧光;图(b)和图(c)表示经过M I C和M I C浓度处理后,细胞膜已不再完整,被P I染色后发出红色荧光结果表明,经麝香草酚处理后,细菌的细胞膜被破坏,导致细菌死亡本实验采用S Y T O和P I双荧光染料染色法,S Y T O透过活细胞膜,与完整的D NA结合,发出绿色荧光;P I只能通过破损的细胞膜,标记死细胞并发出红色荧光用 两 个 荧 光 探 针 同 时 浸 染 细 菌,并 在C L S M下观察荧光,可区分细胞膜完整和破损的细菌图麝香草酚对藤黄微球菌p Hi n的影响图麝香草酚对藤黄微球菌细胞膜完整性的影响 麝香草酚对藤黄微球菌细胞形态的影响通过S EM进一步研究了麝香草酚对细胞形态的影响如图(a)所示,对照组中细胞结构完整,细胞膜表面圆滑规整;图(b)为M I C处理后的细菌,细胞膜表面出现裂纹,细胞膜被损伤出现创口;图(c)为M I C处理后的细菌,可见大部分细菌的细胞膜和细胞形态都被严重破坏,细胞出现塌陷和皱缩S EM结果与前文细胞膜渗透性和完整性的研究结果一致,验证了麝香草酚会导致藤黄微球菌细胞膜的结构和功能发生改变,影响细菌的正常生长代谢,进而抑制或杀死细菌第期齐琦等:麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性及其作用机制图麝香草酚对藤黄微球菌细胞形态的影响结论本研究在细胞水平上探究了麝香草酚对藤黄微球菌的抑菌活性和可能的抑菌机制实验结果表明麝香草酚对藤黄微球菌有良好的抑菌作用,其M I C值约为 m g/m L,麝香草酚会使藤黄微球菌的细胞膜发生超极化,诱导细胞发生氧化应激,导致细胞过氧化损伤,破坏细胞膜的通透性和形态,使胞内AT P浓度降低、核酸分子被破坏,细胞出现塌陷和皱缩、细胞膜破 损本研究结果可为麝香草酚的开发和利用提供理论依据参考文献陈玲,姚齐龙从血液及痰液中均同检出藤黄微球菌例报道 J四 川 省 卫 生 管 理 干 部 学 院 学 报,():姜梅杰,魏绪廷颅脑外伤患者脑脊液中检出藤黄微球菌一例J中华神经外科杂志,():刘英,邹桂玲,孟小玉,等骨髓培养检出藤黄微球菌例J中华医院感染学杂志,():林敏黄褐斑患者皮损表面微球菌定植情况研究D遵义:遵义医科大学,彭彬,杨光友,陈晓利,等黄鳝藤黄微球菌的分离鉴定及药 敏 试 验 J上 海 海 洋 大 学 学 报,():B a n i n E,H u g h e s D,K u i p e r s O P E d i t o r i a l:B a c t e r i a lp a t h o g e n s,a n t i b i o t i c sa n da n t i b i o t i cr e s i s t a n c eJ F EM SM i c r o b i o l o g yR e v i e w s,():D a i J,H a nR,X uY,e t a l R e c e n tp r o g r e s so fa n t i b a c t e r i a ln a t u r a l p r o d u c t s:F u t u r ea n t i b i o t i c sc a n d i d a t e sJ B i o o r g a n i cC h e m i s t r y,:S a l e h iB,M i s h r aAP,S h u k l aI,e ta l T h y m o l,t h y m e,a n do t h e rp l a n t s o u r c e s:H e a l t ha n dp o t e n t i a lu s e sJ P h y t o t h e r a p yR e s e a r c h,():D uE,G a nL,L iZ,e ta l I nv i t r oa n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h y m o l a n dc a r v a c r o l a n dt h e i re f f e c t so nb r o i l e rc h i c k e n sc h a l l e n g e d w i t h C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sJ J o u r n a lo fA n i m a lS c i e n c ea n dB i o t e c h n o l o g y,:G u a r d aA,R u b i l a rJF,M i l t zJ,e ta l T h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t yo fm i c r o e n c a p s u l a t e dt h y m o la n dc a r v a c r o lJI n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo fF o o d M i c r o b i o l o g y,():U l t e eA,B e n n i k M H,M o e z e l a a rR T h ep h e n o l i ch y d r o x y l g r o u po fc a r v a c r o l i se s s e n t i a lf o ra c t i o na g a i n s tt h e f o o d b o r n ep a t h o g e nB a c i l l u sc e r e u sJ A p p l i e da n dE n v i r o n m e n t a lM i c r o b i o l o g y,():X uJ,Z h o uF,J iBP,e ta l T h ea n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s mo f c a r v a c r o l a n dt h y m o l a g a i n s tE s c h e r i c h i ac o l iJ L e t t e r s i nA p p l i e dM i c r o b i o l o g y,():K h a nST,K h a nM,A h m a d J,e t a l T h y m o l a n d c a r v a c r o li n d u c ea u t o l y s i s,s t r e s s,g r o w t h i n h i b i t i o na n dr e d u c e t h eb i o f i l mf o r m a t i o nb yS t r e p t o c o c c u sm u t a n sJ AMBE x p r e s s,():R a n j b a rA,R a m e z a n i a nA,S h e k a r f o r o u s hS,e ta l A n t i f u n g a la c t i v i t yo f t h y m o la g a i n s t t h em a i nf u n g i c a u s i n gp o m e g r a n a t e f r u i t r o tb ys u p p r e s s i n gt h ea c t i v i t yo fc e l lw a l ld e g r a d i n g e n z y m e sJ LWT F o o d S c i e n c e a n dT e c h n o l o g y,:【责任编辑:蒋亚儒】