升阳益胃汤加减对溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症和黏膜屏障的影响.pdf

升阳益胃汤加减对溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症和黏膜屏障的影响吕小燕张 瑜冯五金(山西省中医药研究院(山西省中医院)山西 太原)摘要 目目的的 从肠黏膜屏障受损角度探究升阳益胃汤加减治疗溃疡性结肠炎大鼠的效应机制 方方法法 将 大鼠随机分为正常组、模型组、升阳益胃汤组和美沙拉秦组每组 只 除正常组外其余组大鼠均上午予 葡聚糖硫酸钠溶液灌胃同时予 葡聚糖硫酸钠溶液自由饮用下午升阳益胃汤组大鼠予升阳益胃汤加减煎剂灌胃美沙拉秦组予美沙拉秦肠溶片粉末溶液灌胃正常组大鼠予纯净水灌胃及自由饮水 各组均干预 记录各组大鼠造模前及造模第 天摄食量、体重、粪便含水率实验结束处死各组大鼠 染色观察结肠组织病理形态免疫组化染色观察肠黏膜屏障蛋白紧密连接蛋白()、闭合蛋白()和炎症因子白细胞介素()、肿瘤坏死因子 ()表达情况 结结果果造模第 天模型组大鼠摄食量、体重均明显低于同期正常组(均.)粪便含水率均明显高于同期正常组(均.)升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠摄食量、体重均明显高于同期模型组(均 .)粪便含水率第 天高于同期模型组(.)第 天均明显低于同期模型组(均.)与正常组比较模型组大鼠病理评分及结肠黏膜组织中 、阳性表达评分均明显升高(均.)结肠黏膜组织中 、阳性表达评分均明显降低(均.)与模型组比较升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠病理评分及结肠黏膜组织中 、阳性表达评分均明显降低(均.)肠黏膜组织中 、阳性表达评分均明显升高(均.)结结论论 益气健脾补肾修复肠黏膜拮抗炎症因子 、表达恢复肠道免疫平衡可能是升阳益胃汤加减治疗溃疡性结肠炎的主要机制关键词 溃疡性结肠炎升阳益胃汤加减肠黏膜屏障:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 吕小燕女博士硕士研究生导师主任医师研究方向为中西医结合消化系统疾病的临床与实验研究基金项目 第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函 号)山西省中医药研究院创新骨干人才专项()山西省应用基础研究计划项目()(/):().现代中西医结合杂志 ()()()().(.)(.)(.)(.)(.).(.)(.)(.)(.).:溃疡性结肠炎是一种以直肠、结肠黏膜非特异性炎症、溃疡形成为主要特征的病变其临床表现主要为反复发作的腹泻、黏液脓血便、里急后重、腹痛等 病程迁延日久伴随着肠内外多种并发症严重影响患者的健康和生活质量 氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂等基础药物治疗该病存在患者耐受性欠佳、疗效不稳定、停药后复发、骨髓抑制、潜在感染、肿瘤风险、激素依赖等憋端 升阶梯生物制剂在临床应用中也遇到疗效不佳的“瓶颈”给患者及家庭带来沉重的经济和心理负担有必要从溃疡性结肠炎发病的关键点 肠黏膜屏障损伤角度探究中医药扶正祛邪治疗该病的效应机制 升阳益胃汤加减方是在脾胃学说创始人李东垣的“升阳益胃汤”益气健脾祛湿基础上结合溃疡性结肠炎久病及肾的中医理念加仙茅、仙灵脾、厚朴组成具有益气健脾、补肾祛湿解毒之功效 课题组前期的临床观察发现该方可有效治疗脾虚型溃疡性结肠炎活动期患者为进一步探究其效应机制本研究从肠黏膜屏障损伤角度观察了其对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜屏障蛋白及炎症因子表达的影响 实验材料与方法 实验动物 级 大鼠 只雌雄各半体重 由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供动物合格证号:大鼠饲养于山西省中医药研究院东山科教院区实验中心动物房室内温度 空气相对湿度 光照和黑暗循环 本实验经山西省中医药研究院审核通过()药物与试剂 升阳益胃汤加减煎剂由黄芪、半夏 、党参、炙甘草、羌活、独活、防风 、炒白芍 、炒白术 、陈皮 、茯苓、柴胡、泽泻、黄连、仙茅、仙灵脾、厚朴 组成由山西省中医药研究院东山科教院区实验室提供并熬制成水煎剂按标准成人剂量与大鼠转换系数.含生药量为./美沙拉秦肠溶片(德国福克公司生产批号:规格:./袋)用量为./至研磨机中研至呈细微粉末加 热水搅拌均匀置容器中密封备用 紧密连接蛋白()、闭合蛋白()、白细胞介素 ()、肿瘤坏死因子 ()抗体(公司)葡聚糖硫酸钠(上海麦克林生化科技有限公司生产批号:)实验方法大鼠适应性喂养 周后标号、称重随机分为正常组、模型组、升阳益胃汤组和美沙拉秦组每组 只 模型组、升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠上午按 /体重予 溶液(定容于 蒸馏水)灌胃同时予溶液自由饮用下午升阳益胃汤组大鼠按现代中西医结合杂志 ()/体重予升阳益胃汤加减煎剂灌胃美沙拉秦组予美沙拉秦肠溶片粉末溶液灌胃 正常组大鼠按 /予纯净水灌胃及自由饮水 实验进行 检测指标及方法 大鼠生存状态及摄食量、体重、粪便含水率实验过程中观察各组大鼠生存状态分别记录大鼠造模前及造模第 天摄食量、体重、粪便含水率 摄食量:对饲喂每只大鼠的食物称重 后对剩余食物再次称重二者之差即为该大鼠 摄食量 体重:以电子秤测量 粪便含水率:收集各组大鼠 粪便置于电子天平称重量为粪便初重 然后将粪便置于干燥箱内 左右取出再次称重量收集数据反复干燥粪便待其重量不再减少作为粪便末重 粪便含水率 (粪便初重 粪便末重)/粪便初重 结肠组织形态 实验期满大鼠禁食不禁水 用 水合氯醛腹腔麻醉后取出结肠 纵向切开肠腔 用生理盐水冲洗肠道内容物肉眼观察其结肠黏膜变化后予中性福尔马林固定然后水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋冰冻切片机做连续冠状切片片厚 隔 取 切片收集于./部分 染色光镜下观察并进行病理形态评分 分:未见明显损伤 分:上皮层和固有层炎细胞浸润组织充血水肿程度轻不超过膜下层伴轻度腺体损伤 分:炎症局灶性改变累及黏膜下层且组织充血水肿程度显著伴中度腺体损伤 分:黏膜下层炎细胞形成灶状浸润上皮坏死溃疡深大可累及肌层伴严重黏膜腺体损伤 结肠黏膜组织中 、表达情况室温下取实验大鼠结肠组织冰冻石蜡切片依次漂洗、封闭处理、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、显色、复染、脱水、透明封片后显微镜下观察不同部位 、表达情况 参照免疫组织化学检测技术共识的评分标准根据阳性细胞染色程度及着色细胞百分率对各指标进行评分并统计:分不着色 分浅棕色 分深棕色着色细胞 为 分 两种分值相加 分为()分为弱阳性()分为阳性()分为强阳性()统计学方法采用 .统计学软件分析数据 计量资料如符合正态分布组间比较采用 检验不符合正态分布的计量资料和计数资料用 非参数检验并计算平均秩次 组间比较采用 非参数检验 .)造模第 天模型组大鼠摄食量、体重均明显低于同期正常组(均.)粪便含水率均明显高于同期正常组(均.)但粪便含水率呈递减趋势升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠摄食量、体重均明显高于同期模型组(均.)粪便含水率第 天明显高于同期模型组(.)第 天均明显低于同期模型组(均.)且大鼠摄食量、体重逐渐增加粪便含水率逐渐减少见表 表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段摄食量比较()组别只数造模前造模第 天造模第 天造模第 天造模第 天正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.现代中西医结合杂志 ()表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段体重比较()组别只数造模前造模第 天造模第 天造模第 天造模第 天正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠不同阶段粪便含水率比较()组别只数造模前造模第 天造模第 天造模第 天造模第 天正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.各组大鼠结肠组织形态正常组大鼠结肠黏膜上皮组织整齐细胞排列密集可见杯状隐窝无炎性细胞浸润未见糜烂、溃疡 模型组大鼠结肠黏膜上皮缺损基本无结构完整的隐窝黏膜及黏膜下层见大量炎细胞浸润 升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠结肠黏膜上皮部分中断与模型组相比缺损面积小部分隐窝结构破坏可见少许炎性细胞浸润见图 图 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织病理形态(染色)各组大鼠结肠组织病理评分比较模型组大鼠病理评分明显高于正常组(.)升阳益胃汤组和美沙拉秦组大鼠病理评分均明显低于模型组(均.)见表 表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠组织病理评分比较组别只数病理评分 分/只 分/只 分/只 分/只平均秩次正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.各组大鼠结肠黏膜组织中 、表达情况比较模型组结肠黏膜组织中 、阳性表达较少表达评分均明显低于正常组(均.)升阳益胃汤组和美沙拉秦组肠黏膜组织中 、阳性表达较多表达评分均明显高于模型组(均.)见图、图 及表 各组大鼠结肠黏膜组织中 、表达情况比较 模型组结肠黏膜组织中 、阳性表达较多表达评分均明显高于正常组(均 )升阳益胃汤组和美沙拉秦组肠黏膜组织中 、阳性表达较少表达评分均明显低于模型组(均.)见图、图 及表 讨 论溃疡性结肠炎发病具体机制虽未阐明但近年研究表明肠黏膜屏障损伤基础上启动的肠道免疫失调是其发病的关键在西药抗炎、抑制免疫治疗存在症状反复、患者不应答等正气亏虚的病情下是否可以通过扶正修复损伤的肠黏膜屏障来解决溃疡性结肠炎治疗瓶颈的困惑呢?结合该病患者肠黏膜活检组织中肠上皮机械屏障破环及在正常/获得性现代中西医结合杂志 ()图 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 表达情况(免疫组化染色)图 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 表达情况(免疫组化染色)表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 、表达情况比较组别只数/只/只/只/只平均秩次 /只/只/只/只平均秩次正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.图 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 表达情况(免疫组化染色)图 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 表达情况(免疫组化染色)现代中西医结合杂志 ()表 正常组和溃疡性结肠炎各组大鼠结肠黏膜组织中 、表达情况比较组别只数 /只/只/只/只平均秩次 /只/只/只/只平均秩次正常组.模型组.升阳益胃汤组.美沙拉秦组.注:与正常组比较.与模型组比较.肠道菌群和正常及获得性免疫条件下肠黏膜屏障中紧密连接受损仍可启动肠道黏膜炎症的研究报道再次提示临床需重视修复损伤的肠黏膜屏障在溃疡性结肠炎治疗中的重要作用本实验结果显示溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜屏障主要的紧密连接蛋白 和肠上皮细胞间的重要连接蛋白 低表达或几乎不表达肠组织病理示结肠黏膜上皮缺损基本无结构与文献报道一致升阳益胃汤加减组大鼠的结肠黏膜上皮虽部分中断但与模型组相比缺损面积小肠黏膜屏障蛋白、表达明显增加表明该方有修复肠黏膜屏障的作用中医认为肠黏膜屏障损伤属于正气受损 升阳益胃汤加减方组方中黄芪益气健脾生肌敛疮参、苓、术、草四君子配伍橘皮以调理、培补后天脾胃之气仙茅、仙灵脾补肾暖脾具有益气健脾、补肾祛湿之功效 本实验结果显示升阳益胃汤加减方可明显改善溃疡性结肠炎大鼠摄食量、体重、粪便含水率等脾虚证候表明升阳益胃汤加减修复肠黏膜屏障的功能可能与其具有益气健脾、补肾扶正的功效有关炎症是溃疡性结肠炎重要的病理特征 是贯穿溃疡性结肠炎发病过程中的重要细胞因子由淋巴细胞、活化的单核巨噬细胞产生可进一步刺激单核巨噬细胞和中性粒细胞等合成 等促炎性细胞因子通过/等信号通路损伤细胞间的黏附分子加重肠黏膜屏障破坏肠黏膜通透性增加继发免疫失调的炎症形成恶性循环致肠道持续性炎症 中医认为肠道炎症隶属于湿、热、毒等病邪升阳益胃汤加减方中的半夏、黄连、厚朴辛开苦降化湿清热泽泻、茯苓分消水湿羌、独、柴、防升散祛湿、调畅气机白芍养阴解痉诸药合用祛湿解毒 本实验结果显示 、在溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜内高表达黏膜及黏膜下层可见大量炎细胞浸润升阳益胃汤组大鼠肠黏膜内 、表达明显减少肠黏膜可见少许炎性细胞浸润病理评分明显降低 提示升阳益胃汤加减可明显减轻溃疡性结肠炎肠道炎症综上所述升阳益胃汤加减方可有效缓解溃疡性结肠炎大鼠的肠道炎症机制可能与其益气健脾补肾修复肠黏膜屏障、祛邪抗炎有关 另外本研究中升阳益胃汤加减方和美沙拉秦肠溶片均显示出较好治疗溃疡性结肠炎的功效及调节 、表达的作用但与正常组大鼠相比仍有差距提示中西药联合扶正祛邪抗炎治疗可能效果更好利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .:.:.():.():.():.:.():现代中西医结合杂志 ().:.():.?.:.:.():.:.高颖庞钧译潘越宁等.免疫组织化学检测技术共识.中华病理学杂志():.:.():./().():.:.():./.:.收稿日期 (上接第 页)游元元万德光杨文宇等.四种桑类药材对小鼠免疫功能的影响.中药药理与临床():./.():.:.():.:.():.:.():.():.()/:.():.():.():.():.():.收稿日期 现代中西医结合杂志 ()