罗编09版生化分析实验课本.doc

生
物
化
学
分
析
实
验
南
京 罗
大
学 喜
生
二 命 牛
零 科
零 学
九 学
年 院
九 生
月 物
修 化
订 学
版 系

目 录

第一单元 分光光度法实验方法 …………………………………………………… 1

实 验 一 紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量 ……… 1
实 验 二 核黄素的荧光光度定量测定法 …………………………… 4

第二单元 柱层析分离纯化实验方法 ……………………………………………… 7

实 验 三 离子交换柱层析法 ……………………………………… 7
实 验 四 凝胶渗透层析法 ………………………………………… 11
实 验 五 DEAE—纤维素梯度层析法 ……………………………… 14
实 验 六 疏水层析（HIC）法 ……………………………………… 18

第三单元 亲和柱层析分离纯化实验方法 ……………………………………… 22

实 验 七 亲和层析—分离纯化尿激酶 …………………………… 22
实 验 八 亲和层析—分离纯化胰蛋白酶 …………………………… 27
实 验 九 亲和层析—分离纯化胰蛋白酶抑制剂 …………………… 32

第四单元 电泳检测分离纯化实验方法 …………………………………………… 38

实 验 十 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 ……………………………… 38
实验十一 SDS—聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（1） …………………… 43
实验十二 SDS—聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳（2） …………………… 47
实验十三 聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 ………………………… 52
实验十四 SDS—聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳 …………………… 56
实验十五 管式凝胶等电聚焦 ………………………………………… 61
实验十六 单向火箭琼脂糖凝胶免疫电泳 …………………………… 65
实验十七 潜水式琼脂糖凝胶电泳 ………………………………… 68
实验十八 U型管密度梯度等电聚焦 ……………………………… 71
实验十九 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白银染色法 …………………… 74
实验二十 聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白铬银染色法 ………………… 77

1

第一单元 分光光度法

实 验 一

紫外分光光度法测定蛋白质吸收光谱曲线及含量

1、 实验目的与要求：
（1）、了解紫外分光光度仪的基本原理和使用方法。
（2）、学习和掌握紫外吸收光谱曲线的制作方法。
（3）、了解和掌握蛋白质的定性、定量测定原理和方法。
2、实验原理：
蛋白质所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共轭双键结构能够
产生π→π﹡及n→π﹡类型的电子跃迁，因此能够在近紫外光区产生光吸收，并且在280 nm波长处有一特征吸收峰。利用这一特性，通过对蛋白质紫外吸收光谱曲线的测定，可以进行定性分析。根据蛋白质溶液在280 nm波长处的吸光度，在一定范围内与其浓度呈正比关系，可以进行定量测定。
3、实验仪器与器材：
3-1、实验仪器：
（1）、 紫外分光光度计
（2）、 混合器
（4）、 天 平
3-2、实验器材：
（1）、 可调取液器
（2）、 试 管
（3）、 试管架
（4）、 吸 管
（5）、 吸管架
（6）、 烧 杯
（7）、 滴 管
（8）、 定容瓶
（9）、 洗耳球
（10）、剪 刀
（11）、镊 子
（12）、玻 棒
（13）、骨 勺
（14）、称量纸
（15）、吸水纸
（16）、洗 瓶
（17）、标签纸
2 3-1
4、试剂及配制：
4-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：
准确称取牛血清白蛋白标准品50毫克，置于50毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即为浓度1.0 毫克/毫升的标准品溶液。
4-2、牛血清白蛋白测试品溶液的配制（1.0 毫克/毫升）：
准确称取牛血清白蛋白测试品50毫克，置于50毫升容量瓶中，然后加蒸馏水定容至刻度，溶解混匀后即浓度为1.0 毫克/毫升的测试品溶液。

方法一、蛋白质的紫外吸收光谱曲线测定与制作

1-1、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的测定：
采用2只光径1.0厘米洁净的石英比色杯，分别倒入蒸馏水4.0毫升和牛血清白蛋白标准品（或测试品）溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸馏水为空白溶液，调节仪器零点。样品溶液在250—300 nm波长的范围内，每间隔5个nm波长依次测定，同时记录各波长蛋白质溶液的吸光值。在每次更换测定波长时均需要重新用空白溶液调节仪器的零点后，方能再测定样品溶液。对测定波长的范围和间隔大小，亦可根据不同样品的情况和要求加以确定（加大或缩小间隔）。
1-2、蛋白质的紫外吸收光谱曲线的制作：
以测定的波长为横坐标，相对应的吸光值为纵坐标对应作图。将图中各点用线连起来，即得到蛋白质的紫外吸收光谱曲线，其中最大吸收峰值所对应的波长即为该蛋白质最大吸收波长。

方法二、蛋白质的紫外分光光度法含量测定

2-1、牛血清白蛋白标准品溶液的配制：
将已配好的牛血清白蛋白标准品（BSA）溶液（浓度为：1.0毫克/毫升），按表1稀释成六种不同浓度的标准品溶液。
表1、六种不同浓度的标准品溶液的配制方法及结果表
管 号
0
1
2
3
4
5
6
样品
BSA溶液 (ml)
0.0
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0

蒸馏水 (ml)
5.0
4.5
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0

总体 积 (ml)
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0

实际含量(mg/ml)
0.0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0

A280 nm

2-2、牛血清白蛋白测试样品溶液的配制：
将未知测试样品按估计含量，用蒸馏水配成在标准曲线范围内的浓度，估计浓度应尽量接近标准曲线中间点的浓度。如果测试样品估计浓度超出（低或高）标准曲线范围需重新配制。
2-3、标准品溶液及测试样品溶液的测定：
以蒸馏水（或样品的溶剂）为空白，在280 nm波长处，分别测定标准品溶液和测试样品溶液的吸光值。
3-2 3
2-4、标准曲线的制备：
（1）、以所测得的标准品溶液吸收值为纵坐标，相应已知的标准品含量为横坐标对应
作图，既得标准品溶液吸收值和含量的标准曲线。
（2）、将被测试样品的吸光值在标准曲线上查出相应蛋白质含量。

友情提醒：
切记！实验结束后，应及时关闭自己所有使用的仪器、设备电源开关，及时清洗自己所使用的全部玻璃器皿，及时清理自己使用范围内的台面等。为养成良好的实验操作习惯。从这节课起，我们大家就一起携起手来，开始各自从我做起来吧………明天的工作环境，由于我们今天养成的良好习惯，一定会更加美好！今天的南大学子不仅需要业务精湛，还需要有榜样的作用。榜样的力量是无穷的，这一点也需切记。来，同学们，快动起来！

4 3-3
第一单元 分光光度法
实 验 二
荧光光度法测定核黄素含量
1、实验目的和要求：
（1）、了解荧光法测定核黄素的原理和方法。
（2）、学习荧光光度计的操作和使用。
（3）、掌握荧光定量分析的工作曲线。
2、实验原理：
核黄素
二氢核黄素
核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物。在水及乙醇的中性溶液中为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：

核黄素的激发光波长范围约为440—500nm(一般规定为440nm),发射光波长范围约为510—550nm(一般规定为520nm)。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度呈正比，由还原前后的荧光差数可以进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。
3、实验仪器与器材：
3-1、实验仪器：
（1）、 荧光光度计
（2）、 磁力搅拌器
（3）、 天 平
（4）、 水浴锅
（5）、 混合器
3-2、实验器材：
（1）、 可调取液器
（2）、 试 管
（3）、 试管架
（4）、 吸 管
（5）、 吸管架
（6）、 容量瓶
（7）、 烧 杯
（8）、 量 筒
（9）、 滴 管
（10）、镊 子
3-1 5
（10）、镊 子
（11）、剪 刀
（12）、玻 棒
（13）、骨 勺
（14）、称量纸
（15）、吸水纸
（16）、吸耳球
（17）、记号笔或标签纸
4、试剂与配制：
4-1、试剂：
（1）、连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠
（2）、核黄素
（3）、冰醋酸
4-2、试剂配制：
（1）、连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠 ，直接用.
（2）、36%醋酸溶液的配制：
取冰醋酸36.0毫升,用蒸馏水稀释至100.0毫升，混匀即可。
（3）、核黄素标准品（母）溶液（10.0ug/ml）的配制：
准确称取核黄素10.0毫克，放入预先装有少量蒸馏水（50ml）的1000.0毫升容量瓶中，加入5.0毫升36%醋酸溶液，再加约 800.0毫升蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水再定容至1000.0毫升，混匀即可。
5、操作步骤：
5-1、核黄素标准品溶液的配制：
用已配制的核黄素标准品溶液（10.0ug/ml），按表1再稀释成六种不同浓度。

表1、核黄素标准品溶液配制方法表
步 骤 / 管 号
0
1
2
3
4
5
样品
标 准 品 母 液（ml）
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.25

蒸 馏 水（ml）
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
9.75

总 体 积（ml）
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0
10.0

核黄素 含量（ug/ml）
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.25

5-2、核黄素样品溶液的配制：
将被测试的核黄素样品参照标准品溶液的含量范围和溶剂体系配成测定溶液。对于食
物和生物材料中的核黄素测定，一般需要事先经过抽提，或分离、纯化处理后，方可测定。
5-3、荧光测定：
(1)、选用滤色片：
参照附录中荧光光度计的使用说明，选用滤色片。核黄素荧光测定的激发光波长为455nm，发射波长为523nm。因此可选用带普通型400nm（兰字）滤色片，选用截止型510nm滤色片为发射光滤色片，同时启动仪器进行预热。
（2）、调仪器满刻度：
待仪器预热后，用2.5ug/ml（含量最高的）的溶液调荧光光度计相对荧光强度，既调读数到满刻度（100%），反复多次，直至数据稳定为止。调好的满刻度，在整个实
6 3-2
验结束之前，不可随意重调满刻度。
（3）、标准品和测试样品的测定：
A、未还原时标准品和测试样品溶液荧光强度的测定( F1 )：
调好满刻度之后，分别从高浓度到低浓度依次测定表1所配制的各浓度的标准品溶液和测试样品溶液的荧光强度，并记录各自的读数。需要特别注意的是：在每
一份溶液测定完后，必需重新倒回到各自的原试管内，供测试溶液还原用。在测定
中如果测试溶液的荧光强度超出100%或荧光强度过低，则需要重新配制。
B、还原后标准品和彩色测试品溶液荧光强度的测定 ( F2 )：
再在上述已测定并倒回到各自试管内的溶液中，分别加入连二亚硫酸钠（保险
粉）约10.0毫克，经溶解混匀后，再重新测其各自荧光强度，并记录其读数。
5-4、数据处理：
每一个测定溶液的实际荧光强度校正公式为：
F = F1 - F2
F : 校正后的实际荧光强度
F1：未还原时测定的荧光强度
F2：还原后测定的荧光强度

友情提醒：
切记！实验结束后，应及时关闭自己所有使用的仪器、设备电源开关，及时清洗自己所使用的全部玻璃器皿，及时清理自己使用范围内的台面等。为养成良好的实验操作习惯。从这节课起，我们大家就一起携起手来，开始各自从我做起来吧………明天的工作环境，由于我们今天养成的良好习惯，一定会更加美好！今天的南大学子不仅需要业务精湛，还需要有榜样的作用。榜样的力量是无穷的，这一点也需切记。

3-3 7
第二单元 柱层析法

实 验 一

离 子 交 换 柱 层 析 法

1、实验目的与要求：
本实验是采用阳离子交换树脂所装的柱，选以特定的pH缓冲洗脱液，以恒溶剂洗脱的方式来分离含有两个性质不同的氨基酸溶液。通过实验要求掌握装柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、收集、测定等离子交换柱层析技术的要点。
2、实验原理：
有些高分子物质含有一些可以分离的基团，例如–SO3H；–COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。
如： R–SO3H + M+ ⇆ R–S3M + H+
或 R–NH3OH + CL— ⇆ R–NH3CL + OH—
这类高分子物质通称离子交换剂，其中使用最普遍的是离子交换树脂。由于一定的离子交换剂对不同离子的亲和力不同，因此在洗提过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后得到分离。
3、实验仪器、器材与装置：
3-1、实验仪器：
（1）、 紫外、可见分光光度计
（2）、 水浴锅（或电炉与容器）
（3）、 自动部分收集器
（4）、 磁力搅拌器
（5）、 混合器
（6）、 恒流泵
（7）、 天 平
3-2、实验器材：
（1）、 可调取液器
（2）、 连续加液器
（3）、 层析柱
（4）、 吸 管
（5）、 吸管架
（6）、 试 管
（7）、 试管架
（8）、 烧 杯
8 4-1
（9）、 量 筒
（10）、滴 管
（11）、玻 棒
（12）、剪 刀
（13）、镊 子
（14）、骨 勺
（15）、洗耳球
（16）、称量纸
（17）、吸水纸
（18）、保膜鲜
（19）、标签纸
（20）、胶布条
3-3、实验装置：
烧杯
恒流泵
层析柱
部分收集器

图1离子交换层析实验装置图

4、试剂与配制：
4-1、实验试剂：
（1）、 阳离子交换树脂
（2）、 天门冬氨酸
（3）、 赖 氨 酸
（4）、 无水乙醇
（5）、 95%乙醇
（6）、 氢氧化钠
（7）、 柠 檬 酸
（8）、 茚 三 酮
（9）、 浓 硫 酸
（10）、盐 酸

4-2 9

4-2、试剂配制：
（1）、洗脱溶液的配制（0.45mol/L;pH5.3,柠檬酸缓冲）：
称取柠檬酸2.85克，氢氧化钠1.86克于一烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，再加浓硫酸1.05毫升，最后用蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。
（2）、盐酸（0.02mol/L HCL）溶液的配制:
吸取1.0 mol / L HCL,1.0 毫升，用蒸馏水稀释至50.0毫升，混匀即可。
（3）、样品溶液的配制（LASP和LYS）：
分别称取赖氨酸和天门冬氨酸各7.0毫克，然后加0.02 mol / LHCL10毫升溶解即可。
（4）、60%乙醇溶液的配制：
取95%乙醇63.0毫升，加蒸馏水至100.0毫升，混匀即可。
（5）、显色剂的配制：
称取茚三酮2.0克于一烧杯中，然后加无水乙醇100.0毫升溶解即可。
5、实验操作步骤：
5-1、树脂的处理：
有关市售新树脂的处理和树脂浮选的方法参见教材讲义所述，本实验采用已处理好的树脂。
5-2、装层析柱：
（1）、选择层析柱，观察柱底端过滤是否完好，将选择的层析柱垂直装在台式铁架上，关闭柱底部出口，在柱内注入少许（约1.0 cm高）洗脱液。
（2）、将烧杯中已处理好的树脂，加适量的洗脱液，搅成悬浮状，然后沿柱内壁小心的加至适当高度。倒入时不要太快，以免产生泡沫和气泡。
（3）、待树脂在柱子底部有明显沉积（10分钟左右）后，慢慢打开柱底部的出口，或用吸管吸去柱内上层过多的洗脱夜，继续向柱内加入悬浮的树脂直至沉积后柱床体高度达6.0厘米为止。
（4）、在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败。另外树脂悬浮液的温度要相对恒定或应与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响层析效果。
（5）、检查层析柱是否装好。装好的层析柱应该没有“纹路”，节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。这样方可投入使用，否则需要按上述步骤(1-4)重新装柱直至达到要求为止。
（6）、在装柱的同时应将其他仪器设备（如：自动部分收集器，恒流泵）接通电源，并按实验要求进行调试。
5-3、层析柱平衡：
层析柱装好后接上已调好流速的恒流泵，用洗脱液以 0.4 ml / min 的流速进行平衡，直
至流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（大约2-3倍柱床体积）。
5-4、层析柱加样：
（1）、移去层析柱上端出口塞，打开层析柱底端出口，小心使层析柱内液体流至层析柱床体表面时即行关闭。
（2）、打开自动部分收集器电源开关，以0.4ml / min的流速，按 4.0 ml / 10.0 min / 管的条件开始进行收集。
（3）、自动部分收集器电源开关打开后，用自动吸管吸取0.5毫升氨基酸混合样液沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加样完毕后，慢慢打开层析柱底端出口，使液面流至与树脂表面相平时即行关闭。
5-5、层析柱洗涤：
用自动吸管（或滴管）吸取适量（0.5ml）洗脱液，重复上样方法反复洗涤层析柱内壁四周2-3次，当最后一次洗脱液面流至与树脂表面相平时即行关闭柱底端出口。
5-6、层析柱洗脱：
10 4-3
用自动吸管（或滴管）吸取洗脱液，沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面。加
至约2-3厘米高后，接上移去的层析柱上端出口塞，同时打开层析柱底端出口和已调好流速的恒流泵开关，开始进行自动洗脱。
5-7、收集样液：
以每管4.0毫升的条件进行收集，约需收集12-15管即可。也可一边收集，一边测定，根据测定结果来确定收集的管数，即结果所显示的第二样品峰完全洗脱完毕。此时即可停止收集。
5-8、样液的测定：
（1）、将收集的各管按序编号后，依次分别吸取各管收集液0.5毫升，于另一批同样编号的各对应的试管中。
（2）、然后各管分别加入洗脱缓冲液1.0毫升和茚三酮溶液0.5毫升,混匀后于100度沸水浴中加热20分钟左右，然后用自来水冷却至室温。
（3）、再在各管分别加入60%乙醇溶液3.0毫升，用混合器混匀，即可。
（4）、混匀后的各管样液，以“0”号管为对照管于570 nm 处进行比色。
（5）、测定后，以光吸收值（A570nm）为纵坐标，收集的管数（或体积）为横坐标绘制洗脱曲线图。同时书写出结论性报告结果。

友情提醒：
实验结束后，请立即回收树脂，清洗层析柱、管道及其它用具、器皿、台面等等。上次你做到了吗？

11 4-4
第二单元 柱 层 析 法

实 验 二

凝 胶 渗 透 层 析 法

1、实验目的与要求：
用凝胶柱，分离一含有溶质分子大小不同的样品溶液。并绘出洗脱曲线。通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析的原理和实际应用。
2、实验原理：
凝胶渗透层析就是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。分子量大的因不易渗入网络，被排阻在颗粒外，因而所受到的阻滞作用小，先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部洗脱流程长，因而所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分离的目的。
3、实验仪器、器材与装置：
3-1、实验仪器：
（1）、 层析工作站装置
（2）、 笔记本电脑
（2）、 紫外检测仪
（3）、 磁力搅拌器
（4）、 恒流泵
（5）、 混合器
（6）、 天 平
3-2、实验器材：
（1）、 可调取液器
（2）、 砂芯漏斗
（3）、 吸 管
（4）、 吸管架
（5）、 烧 杯
（6）、 量 筒
（7）、 抽滤瓶
（8）、 层析柱
（9）、 滴 管
（10）、玻 棒
（11）、剪 刀
（12）、镊 子
（13）、骨 勺
12 3-1
（14）、吸耳球
（15）、称量纸
（16）、吸水纸
（17）、保膜鲜
（18）、标签纸或记号笔等

3-3、实验装置图:

4、试剂与配制：
4-1、试剂：
(1)、葡聚糖凝胶
(2)、磷酸氢二钠
(3)、磷酸二氢钠
(4)、血红蛋白
(5)、核黄素
4-2、试剂配制：
(1)、洗脱液（0.05 mol / L,pH 4.3磷酸缓冲）的配制：
分别称取磷酸二氢钠 克；磷酸氢二钠 克于一烧杯中，加蒸馏水 毫升，搅
拌溶解即可。
(2)、样品溶液的配制：
分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升，
搅拌溶解即可。
5、操作步骤：
5-1、凝胶的处理：
将凝胶放入过量的蒸馏水中浸泡6小时（沸水浴中2小时），使其充分溶涨，浸泡时
3-2 13
动凝胶再静置，等凝胶沉积后，轻轻倾去上层细颗粒悬浮液，如此反复数次，以除去凝胶中的细颗粒。新购凝胶的处理方法祥见教科书。
5-2、凝胶静态预平衡：
将经过浸泡处理的凝胶抽干，用约10倍量的洗脱液处理约1小时，方法同浸泡操作，
每次均要将上层细颗粒悬浮液弃去。
5-3、装柱：
将层析柱垂直装好在台式铁架上，关闭柱下端出口，加适量（约1.0厘米高）洗脱液，
再在经预平衡处理的凝胶烧杯中加1.0倍量的洗脱液，搅成悬浮液，然后自柱顶部沿管内
壁缓缓加入柱中，待柱底部凝胶沉积至1—2厘米高时，缓缓打开柱底端出口，随之继续添
加凝胶悬浮液直至柱床体沉积至15.0厘米高度为止。柱内如有气泡、节痕和床表面不平整，
必须重新装柱，直至无气泡、节痕和床表面平整为止。在装柱的同时应将恒流泵的流速调
至0.5 毫升/分钟，以及电脑、色谱工作站等一切设备的连接与调试完毕，准备随时可以
启用。需要注意的是，必须将恒流泵与层析柱的连接管道内的气泡全部排除，否则会影响
层析效果。
5-4、平衡：
柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用2.0
倍于床体积的洗脱液动态平衡，同时也使层析柱床体稳定。平衡好的柱子在上样之前，除了用眼观察无误（无气泡和“纹路”，床表面平整）外，最好还要用兰葡聚糖2000进行层析行为的检查。在层析柱内加入1.0毫升兰葡聚糖2000溶液（2.0毫克/毫升），然后用洗脱液进行洗脱（流速不变）。在层析中移动的指示剂色带狭窄均一则表明装柱良好。检查后，再重复步骤5-4进行重新平衡，方可使用。
5-5、加样：
打开平衡好的层析柱底端出口，使柱内液体流至床体表面相平时，关闭层析柱底端出口，吸取样品溶液0.5毫升，沿柱内壁缓缓加入，尽量不要破坏柱表面，加样完毕后，先启动已调好的电脑-色谱工作站，然后打开层析柱底端出口，自然流出，当样品溶液流至床表面相平 时，再次关闭层析柱底端出口，但色谱工作站继续工作。
5-6、洗涤：
吸适量洗脱液（约1.0毫升/次）如同加样方法，反复洗涤层析柱床体表面2-3次，完
毕后，将层析柱内再加入洗脱液至3.0厘米高，目的是防止柱床体表面被冲坏。
5-7、洗脱：
此时接上已调好流速的恒流泵进行自动洗脱。当电脑屏幕出现的第二个洗脱峰回到基
线后，继续洗脱10分钟，停止洗脱（约60—80分钟）。
5-8、保存和打印实验结果：
停止洗脱后,将实验结果保存到老师规定的文件中，同时打印实验结果报告，并给出结论性的结果。
5-9、清洗仪器及相关装置：
（1）、先从仪器装置中移去层析柱，并回收柱内的填充凝胶，然后用自来水冲洗层析柱，洗净后的层析柱再用蒸馏水荡洗一遍，方可。
（2）、将紫外检测仪比色管道的出口端（上部）与所用其他管道相连接，再把恒流泵管道的进口端放入一干净盛有蒸馏水的烧杯中，同时将另一烧杯放在管道的出口端，收集流出的
废液。启动恒流泵，冲洗管道15分钟，方可。
友情提醒：
实验结束后，请及时将所有的仪器设备的电源开关关闭，并清洗所有用具和台面。
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