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第2期喷施外源油菜素内酯对美乐葡萄幼苗抗低温胁迫的影响郭学良，汪月宁，刘妍，殷梦婷，贺琰，王振平，代红军（宁夏大学 农学院，宁夏 银川750021）摘要：以美乐葡萄营养袋扦插苗为试材，喷施0.4 mg/L的EBR，置于不同低温（4、0、-2）下4 h，研究EBR对美乐葡萄幼苗抗寒性的影响，为酿酒葡萄抗寒性的研究提供理论依据。结果显示：EBR处理提高了美乐葡萄叶片的过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性，增加了葡萄叶片中可溶性糖和脯氨酸含量，减少了电导率和丙二醛（MDA）含量。SOD活性和脯氨酸含量分别比对照提高了32.12%、29.61%，MDA含量比CK处理降低了46.98%。EBR处理提高了美乐葡萄幼苗的抗寒性。关键词：低温胁迫；外源油菜素内酯；美乐葡萄中图分类号：S663.1文献标志码：A收稿日期：2022-03-10基金项目：宁夏自然科学基金项目（2020AAC03088）；国家现代农业产业技术体系资助项目（CARS-29-zp-03）作者简介：郭学良（1995），硕士研究生，主要从事葡萄逆境生理与分子生物学研究。通信作者：代红军，教授，主要从事葡萄逆境生理与分子生物学研究，电子邮箱：dai_。农 业 科 学 研 究Journal of Agricultural Sciences2023年6月Jun.2023第44卷 第2期Vol.44 No.2文章编号：1673-0747（2023）02-0019-06美乐（Vitis vinifera L.cv.Merlot）原产于法国波尔多，欧亚种，是世界上著名的红葡萄品种，也是我国优质酿酒葡萄品种之一1，在贺兰山东麓被大面积种植。美乐适合沙质地种植，喜欢温暖气候，对低温反应十分敏感，春季出土后易受晚霜冻危害2。晚霜冻是中国北方早春时节常发生的自然灾害之一，轻者延缓葡萄的生长、重者造成大面积减产甚至绝产3。贺兰山东麓是中国著名的葡萄酒产区之一，虽然有着适宜的气候，但是此地葡萄也频频遭受晚霜冻的危害4。目前，应对晚霜冻，大多数采用加热、烟熏等方式来缓解5。油菜素内酯（24-Epibrassinolide，EBR）是一种无毒且高效的植物激素6，经研究发现可提高植物的抗逆性，在抵御低温胁迫中起着重要作用7。在对苹果、葡萄、杏等果树的研究中，发现喷施合适浓度的EBR能提高其抗寒力8-10；周伟江等11研究表明，EBR能缓解低温对水稻幼苗的伤害，从而提高幼苗的抗寒性；惠竹梅等12研究发现，EBR处理可提高保护酶活性和渗透调节物质，降低细胞膜透性损伤，从而提高葡萄幼苗的抗寒性。本研究以美乐营养袋扦插苗葡为试材，研究EBR对美乐葡萄幼苗抗寒性的影响，以期为进一步研究EBR调控葡萄幼苗抗低温胁迫的机理、利用EBR减轻葡萄幼苗低温伤害提供理论依据。1材料与方法1.1试验地概况试验于2021年57月在宁夏玉泉营农场国家葡萄产业技术体系水分生理与节水栽培岗位试验基地（38.28N，106.24E）进行。以酿酒葡萄美乐营养袋扦插苗为试材，营养袋直径10 cm、高15 cm，土样配比为m（原土）m（珍珠岩）m（腐殖质）=1 1 2，营养袋苗在日光温室经过炼苗后进行试验。1.2试验设计1）EBR喷施处理：用36株长势一致的美乐营养袋扦插苗，当长到67片叶子时，对叶片两面喷施0.4 mg/L的EBR，清水为CK，喷施标准为直到叶片滴水。第1次喷施后隔1 d进行第2次喷施，共计喷施2次，生长3 d后进行低温处理。2）低温处理：幼苗喷施后放在低温培养箱（BC1300）中，逐步降温到4、0、-2 时分别低温处理4 h，然后逐渐升温到4 保持4 h，升降温速率均为2/h。然后采取叶片样品，进行抗氧化酶第44卷农业科学研究图1EBR处理对美乐葡萄叶片MDA和电导率的影响活性（SOD、POD、CAT）、渗透调节物质（脯氨酸、可溶性糖）与膜脂透性（MDA、电导率）的测定。3）后期生长：将低温处理后的植株放入人工培养箱中生长，设置昼夜光照时间分别为14 h和10 h，温度分别为24 和16，相对湿度为65%85%，光照强度为3 000 lx，培养10 d后测量叶片生长状况。1.3测定指标1）生理指标：使用浸泡法测电导率13，使用硫代巴比妥酸法测MDA含量，分别用氮蓝四唑法、紫外吸收法、愈创木酚法测SOD、POD、CAT活性。用葱酮法测可溶性糖含量，用酸性茚三酮法测脯氨酸含量14。2）生长指标：用直尺测量株高、用手持叶面仪（YMJ-B型）测量最大叶叶面积，游标卡尺测量基径粗。3）冻害情况：恢复程序结束后，统计叶片和新梢的冻害情况。冻害率=（植株上表现出冻害症状的叶片数（新梢数）/植株叶片（新梢）总数）100%。1.4数据分析采用 Excel 2013、SPSS 23 和 Origin 29b 软件进行分析与绘图。2结果与分析2.1EBR处理对美乐葡萄新梢和叶片冻害率的影响在低温恢复过程结束后，对叶片和新梢的冻害率进行调查。由表1可知，不同的低温处理对葡萄幼苗叶片和新梢造成了不同程度的伤害。随着温度的不断降低，新梢和叶片冻害率都呈上升趋势，但经 EBR 处理的葡萄幼苗叶片和新梢冻害率都低于 CK 处理，可见 EBR 处理缓解了低温对葡萄幼苗新梢和叶片的伤害，从而提高了葡萄幼苗的抗寒性。处理CKEBR温度/40-240-2新梢冻害率/%204050.0016.672033.33叶片冻害率/%16.675066.6714.2928.5750表1EBR处理对美乐葡萄新梢和叶片冻害率的影响2.2EBR处理对美乐葡萄叶片MDA和电导率的影响低温胁迫会使植物细胞膜被破坏，电解质外渗，从而电导率增大。因此电导率越大，抗寒性越差。由图1可知，CK处理和EBR处理的葡萄叶片的电导率随着温度的降低呈上升趋势。CK处理始终高于EBR处理，可见EBR处理降低了细胞膜的损害，减少了电解质的外渗，从而提高了葡萄叶片的抗寒性。CK处理和EBR处理葡萄叶片的MDA含量都随着温度的降低呈上升趋势，当在-2 时 EBR 处理达到最高，比CK处理降低了46.98%，可见EBR处理的葡萄叶片随着温度的降低，MDA的含量也随之降低，从而缓解低温胁迫对葡萄叶片的影响，进而提高葡萄幼苗的抗寒性。20第2期郭学良等：喷施外源油菜素内酯对美乐葡萄幼苗抗低温胁迫的影响2.3EBR处理对美乐葡萄叶片SOD、POD、CAT活性的影响由图 2（ac）可知，CK 处理和 EBR 处理的幼苗 SOD 活性随着温度的降低呈上升趋势，经 EBR处理的 SOD 活性都显著高于CK处理。分别比CK处理增加了26%、29.23%、32.12%。可见，EBR处理提高了SOD 的活性，从而缓解了低温对葡萄叶片的伤害。CK 处理的葡萄叶片 POD 活性随着温度的降低先降低后升高，EBR 处理叶片 POD 活性随着温度的降低呈先升后降趋势。随着温度的降低，CK 处理的叶片在 0 时 POD 活性下降，在-2 出现回升，经EBR处理的叶片随着温度的降低，POD 的活性逐渐增加，在 0 达到最高。比CK 增加了 1.91倍，在-2 时出现下降，但仍高于CK处理。可见随着温度的降低，EBR处理组提高了葡萄叶片的POD活性，从而提高抗寒性。随着温度的不断降低，CK处理和EBR处理的葡萄叶片的CAT活性都呈下降趋势。经EBR处理的萄萄叶片的CAT的活性显著高于CK处理，在4 时达到最高，比CK处理提高33.33%。随着温度的不断降低，在温度达到-2 时，EBR 处理对叶片的效果不显著，但依然高于 CK 处理。可见 EBR 处理提高了 CAT 活性，从而缓解低温对葡萄叶片的伤害，从而提高抗寒性。图2EBR处理对美乐葡萄叶片SOD、POD、CAT活性的影响2.4EBR处理对美乐葡萄叶片脯氨酸和可溶性糖的影响如图3所示，CK处理和EBR处理的叶片脯氨酸含量随着温度的降低呈下降趋势，EBR处理明显高于 CK 处理，在 4 时达到最高，比 CK 处理提高29.61%。可见EBR处理提高了脯氨酸含量，缓解了低温对葡萄叶片的伤害，从而提高了其抗寒性。CK处理组的可溶性糖含量随着温度的降低先升高后降低，CK 处理在 0 时迅速上升，在-2 时稍有降低。而EBR处理组则呈下降走势，在温度低于21第44卷农业科学研究2.5EBR 处理对美乐葡萄地上部分生长指标的影响由表 2 可知，随着温度的降低，葡萄的株高、叶片数、叶面积和基径粗都有降低趋势。经EBR 处理的各生长指标都大于 CK 处理。株高比CK 提高了 16%、28%、8%，叶面积比 CK 处理提高 了 78%、46%、30%，叶 片 数 和 基 径 粗 差 异 不明 显。随着温度的降低，新叶和基径粗生长速度慢，但经EBR处理，有所回升，但仍生长缓慢。说明EBR 处理有利于低温胁迫后，提高葡萄幼苗的株高、基径粗、叶片数、叶面积，从而促进葡萄幼苗的生长。表2EBR处理对美乐葡萄地上部分生长指标的影响处理CKEBR温度/40-240-2株高/cm13.630.72Aa11.770.25Cc9.070.7Dd15.770.15Aa15.070.25Aa9.830.35Dd叶片数/个12.330.58Bb11.570.58BCb10.671.15Cb13.470.58Aa12.670.58Aa11.570.58BCb叶面积/cm219.730.42Cc16.970.57Dd12.930.42Ee35.030.47Aa24.730.5Aa16.800.6Dd基径粗/cm3.970.25ABa3.30.42Cb2.300.2Db4.470.35Aa3.800.3Ba2.800.3CDb0 时，EBR 处理和 CK 处理虽然差异不太明显，但 EBR 处理组始终高于 CK 处理，可见在低温下EBR能增加叶片中可溶性糖的含量，提高葡萄叶片的抗寒性。图3EBR处理对美乐葡萄叶片脯氨酸和可溶性糖的影响注：同列不同大小写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05）。2.6葡萄叶片生理指标与抗寒性的相关性分析由表 3 可知，喷施油菜素内酯在不同的温度下美乐葡萄的电导率与基径粗呈极显著负相关（P0.01），与株高呈显著负相关（P0.05），由此可知，酿酒葡萄叶片中电导率与抗寒性呈极显著负相关。CAT活性与叶面积、株高、基径粗呈极显著正相关（P0.01），与叶片数呈显著正相关（P0.05），由此可知：美乐葡萄叶片中CAT 活性与抗寒性呈极显著正相关。MDA 含量与叶面积和叶片数呈显著负相关（P0.05）。可溶性糖与基径粗与株高呈显著正相关（P0.05），脯氨酸含量与叶面积呈极显著正相关（P0.01），与叶片数呈显著性正相关（P0.05）。由相关性分析可得，葡萄叶片的电导率越低，幼苗的生长势越好，抗寒性越强。葡萄叶片中的 CAT 活性、可溶性糖和脯氨酸含量都与抗寒性相关。22第2期表3葡萄叶片生理指标与抗寒性的相关性分析基径粗株高叶面积叶片数电导率-0.950*-0.821*-0.765-0.744CAT0.927*0.957*0.925*0.896*SOD0.2320.2490.4570.534MDA-0.728-0.73-0.860*-0.881*可溶性糖0.901*0.823*0.7260.736脯氨酸0.7440.7320.962*0.893*POD0.4430.3390.3210.419注：*表示在0.01水平（双尾）相关性极显著；*表示在0.05水平（双尾）相关性显著。3讨论低温胁迫会造成细胞膜透性损伤，产生MDA，使大量的电解质外渗，使电导率增大，从而影响植物的生长15。可溶性糖和脯氨酸是植物体的渗透调节物质，能增加细胞液的浓度，对原生质起保护作用，增加幼苗的抗寒性16。SOD、POD、CAT作为植物体内的抗氧化酶，能积极参与对抗低温胁迫带来的危害17。张小贝等18研究表明，EBR处理甘薯可降低细胞的电导率和MDA含量，从而提高其抗寒性。本研究发现，随着温度的不断降低，经EBR处理的葡萄叶片电导率和MDA含量始终低于CK处理，EBR处理能降低MDA和电导率含量，从而促进叶片的抗寒性。随着温度的降低，经EBR处理的脯氨酸和可溶性糖含量都高于CK处理，说明一定浓度的EBR可以提高脯氨酸和可溶性糖含量，从而促进叶片的抗寒性，这与普布卓玛等19的研究一致。吴旺嫔等20研究发现，随着温度的降低，EBR处理的水稻种子的POD和SOD活性都显著增强。本研究发现，低温胁迫后，经EBR处理的葡萄叶片SOD、POD、CAT活性都高于CK处理，这与前人的研究结果一致，说明一定浓度的EBR能显著提高葡萄叶片中的保护酶活性，清除过多的活性氧，进而增强葡萄叶片的抗寒性。低温胁迫下植物的表型等通常会发生变化21，严重时会导致植物生长缓慢等22。有研究发现，低温胁迫下EBR处理能提高水稻株高、茎粗等生长量23。本研究发现，CK处理的葡萄幼苗的生长量低于EBR处理，说明EBR 能够显著提高葡萄幼苗的生长，这与前人研究结果一致24。因此，可通过喷施一定浓度的 EBR 来提高葡萄幼苗对低温胁迫的抗性。由相关性分析可知，膜脂透性与抗寒性呈负相关，保护酶活性和渗透调节物质都和抗寒性呈正相关，经一定浓度EBR处理后，可降低电导率和MDA含量，增加CAT活性，增加脯氨酸和可溶性糖含量，提高葡萄幼苗的抗寒力，从而促进葡萄幼苗的生长，这与前人研究一致25。4结论EBR通过提高葡萄叶片的保护酶活性和渗透调节物质，降低细胞膜透性损伤和电解质外渗来维持叶片生长代谢平衡，进而提高葡萄叶片的抗寒性，促进了葡萄幼苗的生长。参考文献：1刘松涛，李茜，吕雯，等.中国葡萄酒产业现状及发展趋势：以宁夏贺兰山东麓产区为例J.现代农业科技，2019（9）：241-243.2王锐，孙权，郭洁，等.贺兰山东麓砂质酿酒葡萄园土壤水分分布研究J.灌溉排水学报，2013，32（1）：69-73.3刘升，张长俭，戚尚恩.一次罕见晚霜冻对春季葡萄的冻害及晚霜冻的预防J.安徽农业科学，2011，39（20）：12364-12365.4李倩，李映龙，刘子雨，等.萌芽前枝蔓喷施S-诱抗素、水杨酸和萘乙酸对 北红 葡萄抗晚霜性的影响J.农业科学研究，2019，40（2）：29-32.5孙玉，王国槐.外源生长调节剂对植物抗寒性的影响J.作物研究，2011，25（3）：287-291.6BETTI C，DELLA R F，PIACENTINI D，et al.Jasmonates，ethylene and brassinosteroids control adventitious and lateral rooting as stress avoidance responses to heavy metalsand metalloidsJ.Biomolecules，2021，11（1）：77.7任鸿雁，王莉，马青秀，等.油菜素内酯生物合成途径的研究进展J.植物学报，2015，50（6）：768-778.8曲芳，姜丽梅.植物生长调节剂对红富士苹果抗寒性的影响J.北方果树，2001（3）：18-19.9练华山，李欣欣，林立金，等.表油菜素内酯对夏黑葡萄幼苗生长的影响J.浙江农业学报，2021，33（10）：1889-1896.郭学良等：喷施外源油菜素内酯对美乐葡萄幼苗抗低温胁迫的影响23第44卷农业科学研究Effects of exogenous brassinolide on the resistance of Merlot grapeseedlings to low temperature stressGuo Xueliang，Wang Yuening，Liu Yan，Yin Mengting，He Yan，Wang Zhenping，Dai Hongjun（School of Agricultural，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）Abstract：The effects of 0.4 mg/L EBR on the cold resistance of Merlot grape seedlings were studied by spraying it on thecutting seedlings of Merlot grape and placing them at different low temperatures of 4，0 and-2 for 4 hours，whichcan provide a theoretical basis for the research on the cold resistance of wine grapes.The results show that the EBRtreatment improved the activity of catalase（CAT），superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）in the leaves，increased the content of soluble sugar and proline，and decreased the conductivity and malondialdehyde（MDA）content.TheSOD activity and proline content increased by 32.12%and 29.61%compared to the control，respectively，and the MDAcontent decreased by 46.98%compared to the group with CK treatment.EBR treatment improved the cold resistance of winegrape Merlot seedlings.Key words：low temperature stress；exogenous brassinolide；Merlot；correlation analysis（责任编辑才波）10张瑞杰，张杼润，金鹏，等.24-表油菜素内酯减轻杏果实冷害及与活性氧的代谢关系J.现代食品科技，2018，34（4）：39-44.11周伟江，吴旺嫔，唐才宝，等.外源油菜素内酯对低温胁迫下水稻幼苗生长及生理特性的影响J.西北农业学报，2020，29（9）：1410-1416.12惠竹梅，王智真，胡勇，等.24-表油菜素内酯对低温胁迫下葡萄幼苗抗氧化系统及渗透调节物质的影响J.中国农业科学，2013，46（5）：1005-1013.13陈爱葵，韩瑞宏，李东洋，等.植物叶片相对电导率测定方法比较研究J.广东教育学院学报，2010，30（5）：88-91.14高俊山，蔡永萍.植物生理学实验指导M.2版，北京：中国农业大学出版社，2018.15邓天福，吴艳兵，李广领，等.油菜素内酯提高植物抗逆性研究进展J.广东农业科学，2009，11：21-25.16赵芳芳，郭学良，刘研，等.冬前喷施EBR对 美乐 葡萄枝条生理特性及萌芽的影响J.西北农业学报，2022（3）：1-7.17张帆航，李泽，谭晓风，等.不同温度下油菜素内酯对油桐幼苗生长及生理指标的影响J.经济林研究，2018，36（3）：17-24.18张小贝，祝志欣，南文卓，等.2，4-表油菜素内酯（EBR）对菜用甘薯抗寒生理生化的影响J.安徽农业大学学报，2017，44（3）：525-529.19普布卓玛，罗艺岚，高金柱，等.2，4表-油菜素内酯对低温胁迫下西藏野生垂穗披碱草幼苗抗氧化保护和渗透调节的影响J.草地学报，2019，27（3）：547-552.20吴旺嫔，周伟江，唐才宝，等.2，4-表油菜素内酯对低温胁迫下水稻种子萌发及生理特性的影响J.分子植物育种，2020，18（13）：4427-4434.21袁凌云，朱世东，赵冠艳，等.油菜素内酯诱导番茄幼苗抗冷效果的研究J.中国农学通报，2010，26（5）：205-208.22张娟，吴晓颖，许娜，等.2，4-表油菜素内酯对烟苗幼茎生长及相关基因表达的影响J.中国烟草科学，2021（4）：1-6.23周伟江.油菜素内酯对低温胁迫下水稻种子萌发及幼苗生长特性的调控机制D.长沙：湖南农业大学，2019.24GUPTA P，SRIVASTAVA S，SETH C S.2，4-Epibrassinolide and sodium nitroprusside alleviate the salinity stressin Brassica juncea L.cv.varuna through cross talk amongproline，nitrogen metabolism and abscisic acidJ.Plantand Soil，2017，411（1-2），483-498.25赵芳芳.外源油菜素内酯对 美乐 葡萄枝条抗寒性的影响D.银川：宁夏大学，2021.24