浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究.pdf

5孙宝国,吴继红,黄明泉,孙金沅,郑福平.白酒风味化学研究进展J.中国食品学报,2015,15(09):1-8.6王忠彦，尹昌树.白酒色谱骨架成分的含量及比例关系对香型和质量的影响J.酒科技，2000(6)：93-96.7周晓静,周文,杨官荣,曾勇.浓香型白酒窖泥功能微生物对风味物质形成的影响研究J.酿酒,2022,49(05):29-33.8马世源,周健,明红梅,何朝玖,任清,熊堂语,马浩,胥佳.不同发酵醅层的浓香型原酒风味成分对比分析J.酿酒科技,2022(06):109-116.9汤道文,谢玉球,朱法余,王卫东,朱红青,汤翠红.白酒中的微量成分及与白酒风味技术发展的关系J.酿酒科技,2010(05):78-81.10张群.浓香型白酒典型特征风味来源及其风味调控技术研究J.食品与生物技术学报,2020,(04):112.11张杰,程伟,潘天全,李娜.浓香型白酒风味成分研究现状及展望J.酿酒,2019,46(01):29-32.12张琦,徐勇,沈才洪,敖宗华,敖灵,孙啸涛,杨建刚,郭家秀.浓香型白酒挥发性风味成分分析研究进展J.酿酒科技,2017(12):98-104.文章编号:1002-8110（2023）04-0080-05第 50 卷 第 4 期2 0 2 3 年 7 月酿酒LIQUORMAKINGVol.50.4July，2023浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究杨智华1，陈菊2（1.四川宜宾高洲酒业有限责任公司，四川宜宾645150；2.舍得酒业股份有限公司，四川射洪629209）摘要:己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质，其合成的关键酶为酯酶，因此研究酯酶的特性对浓香型白酒具有重要的意义。以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究。关键词：己酸乙酯；酯酶；白酒中图分类号：TS262.31；TS201.2文献标识码：A己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质1，如何提高原酒中己酸乙酯的含量，是解决浓香型白酒生产的瓶颈、提高浓香型白酒质量的关键2-7。酯酶(Esterase，EC，3.1.1.1)亦称羧基酯酶，是指可以水解羧酯键的酶，但该酶也能催化合成低级脂肪酸酯，由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。己酸和乙醇在酯化酶作用下合成己酸乙酯，是己酸乙酯合成的主要途径；酯酶主要是由大曲发酵过程中由微生物代谢产生的8-11。因此，对大曲中酯酶的分离纯化及酶学特性具有重要的意义。本研究以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究。1材料与方法1.1试验材料1.1.1酯酶的提取和纯化1.1.1.1样品来源浓香大曲为金徽酒股份有限公司及四川宜宾高洲酒业有限责任公司提供。1.1.1.2试剂己酸、无水乙醇，购于 Sigma 公司；冰冻离心机；751 型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋；硫酸铵；0.l mol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.0。1.1.1.3仪器蛋白分离纯化系统,瑞典 GEAKTA purifier100；UV-2100 型分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；冷冻离心机，美国 Beckman Coulter 公司；数显恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司；PB-10pH 计，Sartorius公司；ALPHAI-5 真空冷冻干燥仪,德国 Christ 公司；层析柱，上海华美实验仪器厂。1.1.2酯酶特性研究1.1.2.1试剂乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸，色谱纯，Acros Organics。1.1.2.2主要试验设备及仪器气相色谱仪 PerkinElmer 配有 FID 捡测器。2.2试验方法收稿日期：2022-11-18作者简介：杨智华，四川高县人，大专，现任四川省宜宾高洲酒业副总工、国家级白酒评委、国家级露酒评委、中国酒业协会陈年白酒老酒鉴定师、中国酒业协会中青年专家培养成员。80杨智华，等：浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究第四期20232.2.1酯酶酶活力定义及测定方法由于白酒发酵时间较长（在 25 天以上），大曲的用量较大（原料量 10%左右/以上）；且在发酵过程中，以粗酶制剂（反应体系中原料、菌体、酶相互作用）的形式进行酶促反应的；发酵过程，酯酶作用温度在 30左右；发酵过程中酒精浓度可达 10%以上，相当于水溶液中乙醇浓度为 15%左右。因此，为了更好的指导生产，将酯酶活力定义为：1 mg 酶制剂在模拟白酒发酵反应体系（1%己酸，15%无水乙醇，5%酯酶制剂，79%蒸馏水）中，30酯化 120 h 后，用气相色谱法测定反应体系中己酸乙酯的浓度，每生成 1 mg/L 己酸乙酯定义为 1 酶活力单位，用 u 表示。2.2.2蛋白质含量测定用考马斯亮兰 G-250 法测定不同提取及纯化阶段的蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。2.2.3酯化率及相对酯化率由于目前关于酶活的定义并不统一，因此在进行酶学特性研究时，以酯化率作为酶促反应进行的度量标准，同时为了更好的比较，引入相对酯化率。酯化率和相对酯化率定义如下：酯化率=生成酯的摩尔量添加酸的摩尔量100%相对酯化率=各反应的酯化率本次试验的最大酯化率其中最大酯化率定义为 100%。2.2.4酯酶的分离纯化2.2.4.1提取按大曲水=15 加入预先冷却的蒸馏水，在预冷的组织捣碎机中捣碎匀质，置于 4下浸提1 h，用 4 层纱布过滤，滤液于 15000 r/min 冷冻离心15 min，取上清液。2.2.4.2纯化2.2.4.2.1盐析在冰浴中缓缓加入硫酸铵，使其最终浓度为 80%，18000 r/min冷冻离心，离心 10 min，弃去上清液。2.2.4.2.2透析复溶于 pH 为 7.0 的磷酸钠缓冲溶液，装入透析袋，4下透析，直至无硫酸根离子析出为止（用BaCl2溶液检查）。2.2.4.2.3离子交换透析完毕后，用 DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析（1.6 cm20 cm），平衡缓冲液为 pH为 7.0 的磷酸钠缓冲溶液，280 nm 下检测吸光值，取不同吸光值的流分。2.2.2.4.4判定重复步骤 a 和步骤 b，测定酶活，取目标组分，进行冷冻干燥，即得酯化酶。2.2.5酯酶酶学特性研究2.2.5.1酯酶对不同酸与乙醇酯化能力大小的研究（底物专一性）分别吸取乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸各 1 mL 于 100 mL 锥形瓶中，加入 15 mL 无水乙醇，分别加入酯化酶 1 mg，用蒸馏水将其定容到100 mL，30下酯化 120 h 后，测定反应体系中各种酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。试验 3 个水平，取平均值。2.2.5.2酯酶对白酒四大酸酯化的选择性（优先选择性）分别吸取乙酸、乳酸、丁酸、己酸各 0.25 mL 于100 mL 锥形瓶中，加入 15 mL 无水乙醇，分别加入酯化酶 1 mg，用蒸馏水将其定容到 100 mL，30下酯化 120 h 后，测定反应体系中各种酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。2.2.5.3对于酯酶催化合成己酸乙酯随时间的变化情况吸取己酸 1.0 mL 于 100 mL 锥形瓶中，加入15 mL 无水乙醇，加入酯化酶 1 mg，用蒸馏水定容到 100 mL，分别置于 30下酯化，每隔 24 h 测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。2.2.5.4不同乙醇浓度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响分别吸取己酸 1 mL 于 100 mL 锥形瓶中，依次加入 6、8、10、12、14、16、18、20、22 mL 无水乙醇，分别加入酯化酶 1 mg，用蒸馏水将其定容到 100 mL，30下酯化 120 h 后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。2.2.5.5不同己酸浓度对酯酶催化合成己酸乙酯的影响81分别吸取己酸 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于 100 mL锥形瓶中，加入 15 mL 无水乙醇，分别加入酯化酶 1mg，用蒸馏水将其定容到 100 mL，30下酯化 120h 后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。2.2.5.6温度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响吸取己酸 1.0 mL 于 100 mL 锥形瓶中，加入15 mL 无水乙醇，加入酯化酶 1 mg，用蒸馏水定容到 100 mL，分别置于 25、30、35、40、45下酯化 120 h后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。2.2.5.7酯酶的热稳定性将酯酶接种到没有底物的反应体系中，分别置于 4585下保持 2 min，加入反应底物，测定酯酶活力。做三次重复试验，取平均值。2.2.6己酸酸乙酯测定方法酯化后，将整个反应溶液倒入 500 mL 的圆底烧瓶中，加入 100 mL 蒸馏水进行蒸馏，收集 100 mL馏分，用气相色谱测定其中己酸乙酯的含量。气相色谱条件如下：毛细管柱：CP-WAX 57：50 m0.25 mm 色谱柱进样口温度：240，检测器温度：260，载气：氮气（1 mL/min）。色谱柱升温程序：30保温 4 min，4/min 升温至60，10/min 升到 130，15/min 升温至 205保温 15 min。2结果与分析2.1酯酶纯化大曲酯酶按本实验条件经匀质提取，过滤，硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换，透析和冷冻干燥后，得到纯化后的酯酶，相关指标见表1。从表 1 可以看出，酯酶的纯化倍数为 32.21 倍，酶活力回收率为 36.19%.表 1酯酶的分离纯化结果步骤大曲提取液盐析离子交换成品总蛋白质/g11.759.794.570.180.13总酶活/u3165.432737.862464.071267.251145.56比活力/(u g-1)269.40279.61539.187040.288678.48酶活力回收率/%100.0086.4977.8440.0336.19纯化倍数1.001.042.0026.1332.212.2酶学特性研究2.2.1酯酶对不同酸与乙醇酯化能力大小的研究（专一性）在反应体系中分别单独加入不同种类的酸，加入酯化酶进行酯化反应，反应结束后测定酯化率和相对酯化率，结果见图 1。由试验结果可以看出，除乳酸外，酯酶对乙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸的酯化率随分子量的增大而逐渐增大，这可能因为乳酸的支链结构，阻碍了酯化过程。2.2.2酯酶对白酒四大酸酯化的选择性（选择性）在反应体系中添加与白酒四大酯对应的酸类物质，加入酯化酶进行酯化反应，反应结束后测定酯化率和相对酯化率，试验结果见图 2。从图 2 可以看出，在白酒四大酯类相对应的酸类物质乙酸、乳酸、丁酸、己酸同时存在的情况下，酯酶优先催化合成己酸乙酯，且相对酯化率要明显高注：以酯化率最高的辛酸的酯化率为对照（相对酯化率 100%），其它与其相比较，以下试验均取酯化率最高的作为对照。图 1酯酶对白酒中不同酸类的相对酯化率辛酸庚酸己酸戊酸丁酸乳酸乙酸020406080100120相对值化率/%图 2混合条件下酯酶对白酒中四大酯的相对催化率己酸丁酸乳酸乙酸020406080100120140相对值化率/%第四期2023酿酒82于单独催化时的相对酯化率，这与大曲的试验结果一致。说明，在白酒发酵体系中，酯酶优先催化合成己酸乙酯，且催化合成以己酸乙酯为主。而己酸乙酯又为浓香型白酒的特征风味，因此大曲中酯酶对与浓香型白酒己酸乙酯含量具有重要作用。因此，以下将结合浓香型白酒实际生产的工艺，重点研究浓香型大曲中酯酶对己酸的催化特性。2.2.3时间对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响在反应体系中加入己酸，加入浓香型大曲中提取的酯化酶进行酯化，于不同时间测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图 3。从图 3 可以看出，在 72 h 之前，酯化反应的速度是基本恒定的，72 h 以后，酯化速度随反应时间的延长而降低，120 h 后反应基本结束。因此取 120 h为以下研究的反应时间。2.2.4不同乙醇浓度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响为了进一步弄清乙醇对酯化反应的影响，改变反应体系中乙醇的浓度，进行酯化，酯化结束后，测定己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图 4。从图 4 可以看出，酯酶对己酸的酯化能力受乙醇的影响较大。在乙醇浓度为 10%以下时，酯酶催化合成己酸乙酯的能力随乙醇浓度的增加而提高，这可能是由于乙醇浓度的提高致使底物浓度的提高，促使反应向酯化方向进行。当乙醇大于 10%时，酯酶催化合成己酸乙酯的能力随乙醇浓度的增加而呈减少趋势，这一方面是由于底物浓度的饱和致使酯酶酯化反应速率趋于恒定，另一方面，随着乙醇浓度的增加，导致反应体系极性的变化，就导致酯酶空间结构的变化，从而使其催化活力降低。因此，在浓香型白酒酿造时，酒醅中乙醇浓度达到 10%时，为控制己酸乙酯含量的重要控制点。2.2.5不同己酸浓度对酯酶催化合成己酸乙酯的影响为了进一步弄清乙酸对酯化反应的影响，改变反应体系中乙酸的浓度，进行酯化，酯化结束后，测定己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图 5。由试验结果可以看出，随着己酸浓度的增加，酯酶催化合成己酸乙酯的量也呈先增加后减少的趋势，并不符合典型的米氏方程，最适宜的己酸浓度为1%。当己酸浓度大于 1%时，酯酶催化合成己酸乙酯的含量随己酸量的增加呈逐渐减少趋势。这可能是由于在水溶液反应体系下，当己酸含量增加到一定程度后，将对酯酶的空间结构产生影响，从而对酯酶的活性产生抑制。2.2.6温度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响温度，是白酒酿造过程中一个很重要的控制指标。为了更好的通过控制温度来控制己酸乙酯含量，将酯化体系置于不同的温度下进行酯化，酯化结束后测定体系中己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图 6。从图 6 可以看出，酯化率随温度的变化呈近似的正态分布趋势，最适宜的催化温度在 3550之间，40以下时，反应速度随温度的升高而增加，100806040200024487296120144发酵时间/h图 3酯化率随反应时间的变化情况1201008060402006810121416乙醇浓度/%vol图 4不同酒精浓度下酯酶对己酸的相对酯化率图 5不同己酸浓度下己酸乙酯相对酯化率1008060402000.51.01.52.02.5己酸乙酯浓度/%杨智华，等：浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究第四期202383Study on Enzymatic Characteristics of Key Enzymes for CharacteristicFlavor of Luzhou FlavorYANG Zhihua1,CHEN Ju2(1.Sichuan Yibin Gaozhou Liquor Industry Co.,Ltd.,Yibin 645150,Sichuan,China;2.Shede Spirits Co.,Ltd.,Shehong 629209,Sichuan,China)Abstract:Ethyl caproate is the main flavor substance of Luzhou flavor Baijiu,and the key enzyme for its synthesis is esterase.Therefore,it isof great significance to study the characteristics of esterase for Luzhou flavor Baijiu.The esterification enzymes were isolated and purifiedfrom Luzhou flavor Daqu,and their enzymatic properties were studied.Key words:ethyl caproate,esterase,Baijiu40以上时，反应速度随温度的升高而降低，在60仍有 23%的相对酯化率，在发酵过程中的酯化温度 30下，相对酯化率为 58%。3小结以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究，得到如下结论。3.1对浓香型大曲中催化合成己酸乙酯的酯酶进行分离纯化，样品经匀质提取，过滤，硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换，透析和冷冻干燥后，酶活纯化倍数为 32.21 倍，酶活保留率为36.19%。3.2以浓香型大曲中酯酶为研究对象，与白酒生产实际相结合，研究了其酶学特性。包括催化己酸和乙醇合成己酸乙酯随时间变化趋势，对酸类底物的专一性、优先选择性，底物浓度（乙醇浓度、乙酸浓度）对己酸酯化率的影响，以及温度对酯化率的影响。研究发现：3.2.1除乳酸外，酯化率随分子量的增大而逐渐增大，这可能与乳酸的结构有支链，阻碍了酯化过程。3.2.2在乙酸、乳酸、丁酸、己酸同时存在的情况下，酯化能力主要表现在己酸乙酯的酯化合成，说明酯化酶对浓香型白酒特征风味的生成具有关键作用。3.2.3在本试验条件下，在一定范围内，酯化酶对己酸乙酯的酯化率均随乙醇浓度和乙酸浓度增加而增加，超出一定的浓度范围则对酯化作用产生抑制，这可能是导致反应体系极性的变化从而导致酶活力中心结构的变化，进而影响酶的活力；在乙醇浓度为10%时，酯化率最大；在己酸浓度为 1%（v/v）时，酯化率最大。3.2.4不同催化温度和酶添加量对酯化酶催化合成己酸乙酯的影响。发现最适宜的酯酶添加量为 5%，最适宜的催化温度为 3550。参考文献1GB/T 10781.12006 浓香型白酒S.2施安辉，刘积和，曲维祺，张文璞，徐恩润，徐长新.当前浓香型白酒增己降乳的微生物学技术J.酿酒科技,1994,20(5):8-10.3陈建平，葛清秀，黄祖新.碱性脂肪酶催化合成己酸乙酯的研究C.华东六省一市生物化学与分子生物学会 2003 年学术交流会论文摘要集，2003.4吴衍庸,郭世则,卢世珩,等.浓香型酒已酸乙酯合成的生物学研究泸型酯化菌 M-101 分离特性及酯化条件的探讨J.食品与发酵工业,1990(05):1-4.5李佐华，张静，吴衍庸，郭世则，朱荣秀.浓香型酒优质、高产的酶工程技术应用研究J.酿酒科技,1997(4):23-24.6庄名扬.缩短浓香型白酒发酵周期提高质量的研究酯化酶粗制剂的生产与应用J.食品科学,1994,15(1):79-79.7胡峰.微生物技术在浓香型白酒生产中的应用研究J.酿酒科技,2008(12):56-59.8侯小歌，王俊英，李学思，胡炳义，李绍亮，高应运.浓香型白酒糟醅及窖泥产香功能菌的研究进展 J.微生物学通报,2013,40(7):1257-1265.9李佐华，张静，吴衍庸，刘光烨.浓香型酒酿制酯酶的应用研究J.食品与发酵工业,1998(1):42-43.10任道群，唐玉明，姚万春，刘宇驰，卓毓崇，徐克赞.浓香型酒酯化酶工程的研究及其应用J.酿酒,2009,36(4):36-37.11李大和，李家顺，李天道.浓香型曲酒酿造过程中产酯酵母生态分布的研究J.酿酒,1989(2):61-64.100806040200202530354045505560酯化温度/图 6不同温度下己酸的相对酯化率第四期2023酿酒84