牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析.pdf

畜牧兽医学报 2 0 2 3,5 4(9):3 6 8 9-3 6 9 9A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i:1 0.1 1 8 4 3/j.i s s n.0 3 6 6-6 9 6 4.2 0 2 3.0 9.0 1 0开放科学(资源服务)标识码(O S I D):牛C A R T基因核心启动子鉴定及转录调控分析王栋梁1,任 静2,郝琴琴2,李鹏飞2*(1.朔州职业技术学院,朔州 0 3 6 0 0 2;2.山西农业大学生命科学学院,太谷 0 3 0 8 0 1)摘 要:旨在筛选牛C A R T基因核心启动子区并鉴定调控C A R T表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组D NA,通过P C R扩增、测序获得牛C A R T启动子序列,EMB O S S、M e t h P r i m e r、N e w P L A C E数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的C A R T启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用D NA p u l l d o w n结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至2 9 3 T细胞,分析转录因子对牛C A R T核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛C A R T基因-1 2 0 0 b p+2 2 b p区域存在C p G岛和TA T A b o x、C AA T b o x等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-2 9 2 b p+2 2 b p片段转录起始活性最强,为牛C A R T基因核心启动子区;转录因子R F X 5、C R E B、R F X 1、J UN D、T E A D 4、T F A P 2 D、R E L A可与牛C A R T基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实R F X 5、R F X 1、T E A D 4抑制C A R T转录(P0.0 1),C R E B与R E L A激活C A R T转录(P0.0 0 1)。本研究成功扩增获得牛C A R T启动子区域,筛选鉴定-2 9 2 b p+2 2 b p为牛C A R T基因的核心启动子区,证实R F X 5、R F X 1、T E A D 4为C A R T转录抑制因子,C R E B、R E L A为C A R T转录激活因子。研究结论为丰富牛下丘脑C A R T表达调控机制,深入研究C A R T调控卵泡发育机理提供依据。关键词:牛;C A R T;核心启动子;转录调控;D NA p u l l d o w n中图分类号:S 8 2 3.2 文献标志码:A 文章编号:0 3 6 6-6 9 6 4(2 0 2 3)0 9-3 6 8 9-1 1收稿日期:2 0 2 3-0 3-2 4基金项目:国家自然科学基金面上项目(3 1 8 7 3 0 0 2);山西省应用基础研究计划面上项目(2 0 2 1 0 3 0 2 1 2 3 3 8 0);山西农业大学横向科技项目(2 0 2 2 HX 0 1 0;2 0 2 1 HX 2 3;2 0 2 0 HX 0 6;2 0 1 9 HX 0 3)作者简介:王栋梁(1 9 8 2-),男,山西朔州人,硕士,讲师,主要从事动物生殖生理方面的研究,E-m a i l:3 4 9 8 5 9 4 6 0q q.c o m*通信作者:李鹏飞,主要从事动物生殖生理方面的研究,E-m a i l:a d a m l p f 1 2 6.c o mI d e n t i f i c a t i o n a n d T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t i o n A n a l y s i s o f C o r e P r o m o t e r o f B o v i n e C A R T G e n eWANG D o n g l i a n g1,R E N J i n g2,HAO Q i n q i n2,L I P e n g f e i2*(1.S h u o z h o u V o c a t i o n a l T e c h n o l o g y C o l l e g e,S h u o z h o u 0 3 6 0 0 2,C h i n a;2.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,T a i g u 0 3 0 8 0 1,C h i n a)A b s t r a c t:T h e p r e s e n t s t u d y a i m e d t o s c r e e n t h e c o r e p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e a n d i d e n t i f y t h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s r e g u l a t i n g C A R T e x p r e s s i o n,a n d e x p l o r e i t s t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n m e c h a n i s m.T h e h y p o t h a l a m u s o f 3 h e a l t h y c o w w e r e c o l l e c t e d f o r g e n o m i c D NA e x t r a c t i o n.T h e p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e w a s o b t a i n e d t h r o u g h P C R a m p l i f i c a t i o n a n d c l o n e s e q u e n c i n g,a n d i t s s e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c s w e r e a n a l y z e d b y EMB O S S,M e t h P r i m e r,N e w P L A C E d a t a b a s e.T h e 4 C A R T g e n e p r o m o t e r r e p o r t e r v e c t o r s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t t r u n c a t e d l e n g t h s w e r e c o n-s t r u c t e d t o i d e n t i f y t h e c o r e p r o m o t e r r e g i o n b y d u a l l u c i f e r a s e r e p o r t e r g e n e a c t i v i t y a s s a y.D NA p u l l d o w n a n d m a s s s p e c t r o m e t r y,f u n c t i o n a l c l u s t e r a n d b i n d i n g s i t e p r e d i c t i o n a n a l y s i s w e r e 畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 u s e d t o s c r e e n t h e c a n d i d a t e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n t h e c o r e p r o m o t e r r e g i o n(n=3).T h e t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r s o v e r e x p r e s s i o n v e c t o r s w e r e c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d t o 2 9 3 T c e l l s t o a n a l y z e t h e r e g u l a t o r y f u n c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o n b o v i n e C A R T g e n e t r a n s c r i p t i o n(n=3).T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e C p G i s l a n d a n d c i s-a c t i n g e l e m e n t s s u c h a s T AT A b o x a n d C AAT b o x i n t h e-1 2 0 0 b p-+2 2 b p r e g i o n o f b o v i n e C A R T g e n e.A l l t h e 4 r e p o r t e r v e c t o r s w i t h t r u n-c a t e d p r o m o t e r s h a d t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n a c t i v i t y a n d t h e-2 9 2 b p-+2 2 b p w a s t h e h i g h e s t,t h i s r e g i o n w a s t h e c o r e p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e.R F X 5,C R E B,R F X 1,J UN D,T E A D 4,T F A P 2 D,R E L A c o u l d s p e c i f i c a l l y b i n d t o t h e c o r e p r o m o t e r r e g i o n o f t h e b o v i n e C A R T g e n e.F u r t h e r m o r e,i t w a s p r o v e d t h a t R F X 5,R F X 1,T E A D 4 c o u l d i n h i b i t C A R T g e n e t r a n s c r i p t i o n(P0.0 1);C R E B a n d R E L A c o u l d a c t i v a t e C A R T g e n e t r a n s c r i p t i o n(P0.0 5表示无显著差异,P0.0 5表示差异显著,P5 0%、I s l a n d s i z e 1 0 0以及O b s/E x p 0.6 0,结果显示牛C A R T基因启动 子 区 含 有1个C p G岛,位 于-2 3 9 b p-3 5 b p(2 0 5 b p)(图3 A)。顺式作用元件位点预测结果显示,存在2个T AT A b o x,分别位于-2 8-2 1 b p和-8 4 6-8 4 0 b p;8个C AAT b o x,分别位于-1 4 7-1 4 2 b p、-8 0 9-8 0 6 b p、-8 6 8-8 6 5 b p、-8 9 6-8 9 2 b p、-1 0 4 6-1 0 4 3 b p、-1 0 8 7-1 0 8 2 b p、-1 1 2 1-1 1 1 8 b p和-1 1 6 6-1 1 6 2 b p(图3 B)。A.C p G岛位点分析;B.顺式作用元件位点预测A.A n a l y s i s o f C p G i s l a n d s i t e s;B.P r e d i c t i o n o f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i t e s图3 牛C A R T基因启动子序列特征分析F i g.3 T h e s e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c a n a l y s i s o f b o v i n e C A R T g e n e p r o m o t e r3963畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 2.3 牛C A R T基因核心启动子区鉴定双荧光素酶活性检测结果显示,截短重组载体相对荧光活性均显著高于p G L-B a s i c对照载体,其中p G L-3 1 4的 相 对 荧 光 活 性 显 著 高 于p G L-4 9 7(图4),表明-2 9 2 b p+2 2 b p内可能存在正向转录调控元件,该区域为牛C A R T基因转录所需的最短核苷酸序列,即牛C A R T基因的近端核心启动子区。*.P0.0 5;*.P0.0 5。下同*.P0.0 5;*.P0.0 5.T h e s a m e a s b e l o w图4 牛C A R T基因启动子截短片段相对荧光活性检测F i g.4 D e t e c t i o n o f t h e r e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f b o v i n e C A R T g e n e p r o m o t e r t r u n c a t e d f r a g m e n t s2.4 D N A p u l l d o w n筛选核心启动子区转录因子D NA p u l l d o w n产物进行S D S-P AG E分离及考马斯亮蓝染色,结果显示对照组(N C)与试验组(D P D)在4 05 5 k u间存在2条差异条带(图5)。质谱分析去除各组中特异性肽段数2的蛋白质后,D P D组获得互作蛋白9 2 1个,去除与N C组有交集的1 4 3个蛋白质后,共获得7 7 8个与N C组差异表达的蛋白质(图6)。图5 差异性互作蛋白筛选F i g.5 S c r e e n i n g o f d i f f e r e n t i a l l y i n t e r a c t i n g p r o t e i n s2.5 互作蛋白功能分析G O功能富集分析显示,7 7 8个蛋白质中有1 5个具有D NA结合功能(图7 A);K E G G分析显示,差异蛋白涉及的1 0条主要的信号通路包括:信号转导、内分泌调节、癌症发生、神经调节、细胞生长与凋图6 差异蛋白韦恩图F i g.6 V e n n d i a g r a m o f d i f f e r e n t i a l p r o t e i n s亡、免疫调节、糖代谢、翻译、转录和能量代谢(图7 B),其 中R F X 5、C R E B、R F X 1、J UN D、T E A D 4、T F A P 2 D、R E L A共7个蛋白质具有基因转录调控功能,且均与牛C A R T核心启动子区存在结合位点(表2)。2.6 转录因子对C A R T基因核心启动子转录活性的影响 p c D NA 3.1(+)-转录因子重组质粒瞬时转染至2 9 3 T细胞,R T-q P C R检测细胞中转录因子表达水 平。结 果 显 示,转 染p c D NA 3.1(+)-R F X5、p c D NA 3.1(+)-C R E B、p c D NA 3.1(+)-R F X1、p c D NA 3.1(+)-J UND、p c D NA 3.1(+)-T E AD4、p c D NA 3.1(+)-T F A P2 D、p c D NA 3.1(+)-R E L A后,细胞中相应的候选转录因子mR NA水平均极显著提高(P0.0 1)(图8),表明转录因子过表达载体构建成功。应用双荧光素酶报告基因系统检测各转录因子对牛C A R T基因核心启动子区转录活性4963 9期王栋梁等:牛C A R T基因核心启动子鉴定及转录调控分析 A.分子功能富集分析;B.信号通路分析A.M o l e c u l a r f u n c t i o n e n r i c h m e n t a n a l y s i s;B.S i g n a l i n g p a t h w a y a n a l y s i s图7 差异蛋白功能分析F i g.7 F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f d i f f e r e n t i a l p r o t e i n s表2 转录因子结合位点预测T a b l e 2 P r e d i c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g s i t e s蛋白名称P r o t e i n n a m e起始点/b pS t a r t终止点/b pE n d结合位点序列(5 3)B i n d i n g s i t e s e q u e n c e评分S c o r eR F X 5-1 5 7-1 3 6G C C C G G C G G G C A T T G A C G T C AA1 5.9 0 7 9C R E B-1 5 5-1 3 5C C G G C G G G C A T T G A C G T C A1 5.5 3 0 3R F X 1-1 9 7-1 8 1T C G T T C C G G G G C G C C T G1 1.7 0 7 9J UN D-8 3-6 2C C T C C T T C T T C C C T G C G C C C C G1 3.6 3 1 6T E A D 4+1 4+2 2T T C A G C A C C1 6.9 0 7 9T F A P 2 D-1 8 6-1 7 3C G C C T G G AG C C C G G1 0.0 4 0 7R E L A-1 0 6-9 1C C C C C T T C C T T C C T T C1 2.1 0 5 3的影响,结果显示,过表达R F X5、R F X1、T E AD4后,2 9 3 T细胞相对荧光活性显著下降(P0.0 5);过表达C R E B、R E L A后2 9 3 T细胞相对荧光活性极显 著 上 升(P0.0 5)(图9)。3 讨 论包裹在卵泡外周的G C s为卵母细胞发育提供营养物质,并通过分泌E2促进卵泡成熟和排卵1 3,G C s凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因1 4。研究发现,神经肽C A R T通过下丘脑-垂体-卵巢轴作用于G C s,抑制E2分泌1 5,E2水平降低是卵泡闭锁的主要特征之一1 6,低浓度的E2促进G C s凋亡1 7。前期对牛优势卵泡(d o m i n a n t f o l l i c l e s,D F s)和从属卵泡(s u b o r d i n a t e f o l l i c l e s,S F s)转录组测序分析发现,C A R T在D F s中表达量显著高于S F s,且主要在G C s层表达,认为C A R T通过促进C G s凋亡来影响E2分泌,进而对卵泡发育发挥抑制作用1 8。本课题组对C A R T在牛下丘脑表达的转录后水平调 控 机 制 进 行 了 研 究,发 现b t a-m i R-3 7 7可 与C A R T 3 UT R区结合抑制C A R T mR NA转录1 9。为进一步完善C A R T表达调控网络,本研究对牛C A R T基因表达 转 录 水 平 调 控 机 制 进 行 了 深 入探究。启动子是基因转录起始的关键区域,转录因子与该区域内的顺式作用元件结合,发挥转录增强或抑制作用。Y a m a d a等2 0克隆获得人C A R T基因启动子序列,对T S S上游1 0 7 2 b p的序列进行结构分析,发现-1 5 6 b p处的基因多态性位点与肥胖遗传相关。D o m i n g u e z等2 1构建小鼠D NA文库,对C A R T基因测序鉴定后发现在近端启动子区内存5963畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 A.R FX5过表达检测;B.C R E B过表达检测;C.R FX1过表达检测;D.J UND过表达检测;E.T E AD4过表达检测;F.T F A P2 D过表达检测;G.R E L A过表达检测。*.P0.0 0 1;*.P0.0 0 0 1,下同A.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f R FX5;B.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f C R E B;C.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f R F X1;D.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f J UND;E.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f T E AD4;F.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f T F A P2 D;G.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f R E L A.*.P0.0 0 1;*.P0.0 0 0 1,t h e s a m e a s b e l o w图8 2 9 3 T细胞内转录因子过表达检测F i g.8 D e t e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o v e r e x p r e s s i o n i n 2 9 3 T c e l l s在c AMP反应元件等多种顺式作用元件,且人和小鼠C A R T基因-3 2 0 b p+1 b p区同源性高达8 3%。L i n g等2 2分析猪C A R T 5 端缺失启动子片段转录起始活性,确定-2 1 7 b p+1 5 2 b p为猪C A R T转录起始所需的最短序列,即猪C A R T基因核心启动子区。本研究从牛下丘脑组织中扩增获得牛C A R T基因启动子片段,构建4个不同截短长度的启动子报告基因载体,筛选并鉴定C A R T基因核心启动 子 区,明 确-2 9 2 b p+2 2 b p区 为 牛C A R T基因核心启动子区。C p G岛通过甲基化影响转录因子与启动子的结合能力,在真核生物基因转录过程中发挥重要调控作用2 3-2 4。生物信息学分析结果显示,牛C A R T基因C p G岛位于核心启动子区,认为C A R T基因转录调控可能受到C p G岛甲基化的影响。C R E B是目前研究较为广泛的一类转录激活因子,主要参与调控神经元反应相关基因的表达2 5,可通过磷酸化和去磷酸化调节靶基因转录2 6,前人研究表明C R E B激活大鼠下丘脑C A R T表达1 0,本研究同样明确C R E B对牛下丘脑C A R T转录发挥激活作用。R F X家族可与主要组织相容性抗原MHC 类基因特异性结合影响机体免疫性应答,在真核生物的各类细胞中广泛表达并发挥基因转录激活作用2 7-2 8。R F X转录因子家族广泛存在于真核生物的各个组织中,通过与细胞增殖和迁移相关基因启动子结合发挥转录激活作用,进而影响癌症发生发展2 9-3 0。R F X 1是已知的具有双向活性的转录因 子3 1;王 娜 等3 2研 究 表 明,干 扰 神 经 元 中R F X 5表达导致P c d h 基因水平显著上调,表明R F X 5具有 抑制基因转 录的功能,本 研究则发现R F X 5可显著降低C A R T核心启动子转录活性,因此认为R F X 5具有与R F X 1相似的双向转录活性。T E A D 4可与转录辅助激活因子YA P/T A Z结合发挥共激活作用,参与调节H i p p o信号通路并影响癌症发 生3 3-3 4,另 有 研 究 发 现,T E A D 4参 与 介 导P I 3 K/AK T 信号通路,促进膀胱癌细胞的迁移3 5,还可在肝癌细胞中抑制p2 7基因的表达3 6。本研究筛选获得的转录因子J UN D、T F A P 2 D和R E L A均已被证明具有双向转录活性3 7-4 0。综上所述,转录因子在不同细胞中对不同基因转录调控方向有所6963 9期王栋梁等:牛C A R T基因核心启动子鉴定及转录调控分析A.R F X 5组相对荧光活性检测;B.C R E B组相对荧光活性检测;C.R F X 1组相对荧光活性检测;E.J UN D相对荧光活性检测;F.T E A D 4组相对荧光活性检测;G.T F A P 2 D组相对荧光活性检测;H.R E L A组相对荧光活性检测A.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R F X 5 g r o u p;B.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f C R E B g r o u p;C.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R F X 1 g r o u p;E.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f J UN D g r o u p;F.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f T E A D 4 g r o u p;G.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f T F A P 2 D g r o u p;H.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R E L A g r o u p图9 转录因子对牛C A R T基因核心启动子转录活性的影响F i g.9 E f f e c t s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o n t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f b o v i n e C A R T g e n e c o r e p r o m o t e r不同,仅根据前人研究成果判断某转录因子对目的基因的转录调控作用易导致结果偏差。本研究应用双荧光素酶报告基因系统对R F X 5、C R E B、R F X 1、J UN D、T E A D 4、T F A P 2 D、R E L A 7个转录因子与牛C A R T基因核心启动子区的靶向结合关系进行验证,初 步 明 确R F X 5、R F X 1、T E A D 4抑 制 牛C A R T核心启动子转录活性;C R E B与R E L A增强牛C A R T核心启动子转录活性。本研究未针对牛下丘脑细胞及动物活体进行转录因子功能验证,后续将开展定点突变及细胞功能试验,并设计相应的转录因子靶向药物进行动物活体试验,探究转录因子对牛下丘脑C A R T分泌及卵泡发育的影响,进一步明确各转录因子与C A R T核心启动子区的靶向结合位点及相互作用关系。4 结 论本研究扩增获得牛C A R T基因启动子序列,预测该片段上存在C p G岛等多种涉及基因转录调控的顺式 作 用 元 件,确 定-2 9 2 b p+2 2 b p为C A R T核心启动子区,构建转录因子过表达载体并明确R F X 5、R F X 1、T E A D 4为牛C A R T基因转录抑制因子,C R E B与R E L A为转录激活因子。上述7963畜 牧 兽 医 学 报5 4卷 结论为进一步揭示牛下丘脑C A R T转录调控机制奠定理论基础。参考文献(R e f e r e n c e s):1 R A J AKO S K I E.T h e o v a r i a n f o l l i c u l a r s y s t e m i n s e x u a l l y m a t u r e h e i f e r s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o s e a s o n a l,c y c l i c a l,a n d l e f t-r i g h t v a r i a t i o n sJ.A c t a E n d o c r i n o l,1 9 6 0,3 4(S 3):S 7-S 6 8.2 S AM S ON W K,S A L V EM I N I D,YO S T E N G L C.O v e r c o m i n g s t r e s s,h u n g e r,a n d p a i n:c o c a i n e-a n d a m p h e t a m i n e-r e g u l a t e d t r a n s c r i p t p e p t i d es p r o m i s eJ.E n d o c r i n o l o g y,2 0 2 1,1 6 2(8):b q a b 1 0 8.3 ON G Z Y,MC NA L L Y G P.C A R T i n e n e r g y b a l a n c e a n d d r u g a d d i c t i o n:C u r r e n t i n s i g h t s a n d m e c h a n i s m sJ.B r a i n R e s,2 0 2 0,1 7 4 0:1 4 6 8 5 2.4 B A R ANOWS KA B,WO L I NS KA-W I TO R T E,MA R T YNS KA L,e t a l.E f f e c t s o f c o c a i n e-a m p h e t a m i n e r e g u l a t e d t r a n s c r i p t(C A R T)o n h o r m o n e r e l e a s eJ.R e g u l P e p t,2 0 0 4,1 2 2(2):5 5-5 9.5 S M I TH G W,S E N A,F O L G E R J K,e t a l.P u t a t i v e r o l e o f c o c a i n e-a n d a m p h e t a m i n e-r e g u l a t e d t r a n s c r i p t(C A R T P T)i n d o m i n a n t f o l l i c l e s e l e c t i o n i n c a t t l eJ.S o c R e p r o d F e r t i l S u p p l,2 0 1 0,6 7:1 0 5-1 1 7.6 L V L H,J I ME N E Z-K R A S S E L F,S E N A,e t a l.E v i d e n c e s u p p o r t i n g a r o l e f o r c o c a i n e-a n d a m p h e t a m i n e-r e g u l a t e d t r a n s c r i p t(C A R T P T)i n c o n t r o l o f g r a n u l o s a c e l l e s t r a d i o l p r o d u c t i o n a s s o c i a t e d w i t h d o m i n a n t f o l l i c l e s e l e c t i o n i n c a t t l eJ.B i o l R e p r o d,2 0 0 9,8 1(3):5 8 0-5 8 6.7 S HO B A T AK E R,T AKA S AWA K,OT A H,e t a l.U p-r e g u l a t i o n o f P OMC a n d C A R T mR NA s b y i n t e r m i t t e n t h y p o x i a v i a GA T A t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n h u m a n n e u r o n a l c e l l sJ.I n t J B i o c h e m C e l l B i o l,2 0 1 8,9 5:1 0 0-1 0 7.8 Z HAN G J,WAN G S H,YUAN L,e t a l.N e u r o n-r e s t r i c t i v e s i l e n c e r f a c t o r(N R S F)r e p r e s s e s c o c a i n e-a n d a m p h e t a m i n e-r e g u l a t e d t r a n s c r i p t(C A R T)t r a n s c r i p t i o n a n d a n t a g o n i z e s c AMP-r e s p o n s e e l e m e n t-b i n d i n g p r o t e i n s i g n a l i n g t h r o u g h a d u a l N R S E m e c h a n i s mJ.J B i o l C h e m,2 0 1 2,2 8 7(5 1):4 2 5 7 4-4 2 5 8 7.9 R OG G E G A,J ON E S D C,G R E E N T,e t a l.R e g u l a t i o n o f C A R T p e p t i d e e x p r e s s i o n b y C R E B i n t h e r a t n u c l e u s a c c u m b e n s i n v i v oJ.B r a i n R e s,2 0 0 9,1 2 5 1:4 2-5 2.1 0 R OG G E G A,S HE N L L,KUHA R M J.C h r o m a t i n i mm u n o p r e c i p i t a t i o n