南药阳春砂、草豆蔻挥发油抑菌活性研究.pdf

Vol.9 No.3Jun.2023生物化工Biological Chemical Engineering第 9 卷 第 3 期2023 年 6 月文章编号：2096-0387（2023）03-06南药阳春砂、草豆蔻挥发油抑菌活性研究魏洁书，胡锦珊，洪群华，邱远琦，刘禹辰，罗育文，张素中*（广州新华学院，广东广州 510520）摘 要：目的：研究阳春砂、草豆蔻 2 种南药不同部位的挥发油对 3 种常见菌株（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）的抑菌效果，为其抑菌作用研究开发及应用提供参考。方法：参照 中国药典 挥发油测定法甲法，提取阳春砂阴干叶片和果实、草豆蔻阴干叶片和种子团的挥发油，采用滤纸片扩散法测定大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌对所提取挥发油的药物敏感性。结果：阳春砂阴干叶片及果实的挥发油提取率分别为 0.40%和 2.52%，叶片及果实挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为 8.3 mm、8.0 mm、18.7 mm 和 10.0 mm、26.7 mm、28.7 mm；草豆蔻阴干叶片和种子团挥发油提取率分别是 0.14%和 0.73%，叶片及种子团挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别为 10.0 mm、12.7mm、21.3 mm 和 10.0 mm、13.3 mm、15.7 mm。结论：阳春砂、草豆蔻叶片和果实挥发油对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌效果，本研究对阳春砂和草豆蔻的抑菌活性提供了基础数据，为研发天然、绿色抗生素提供一定的理论基础及研究思路。关键词：阳春砂；草豆蔻；挥发油；抑菌活性中图分类号：R282.6 文献标识码：AResearchonAntibacterialActivityofVolatileOilfromAmomum villosumLourandAlpinia katsumadaiHayataWEI Jieshu,HU Jinshan,HONG Qunhua,QIU Yuanqi,LIU Yuchen,LUO Yuwen,ZHANG Suzhong*(Guangzhou Xinhua University,Guangzhou 510520,China)Abstract:Objective:To study the bacteriostatic effect of volatile oil from different parts of two Southern Medicines,Amomum villosum and Alpinia katsumadai,on three common strains(Escherichia coli,Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus).To provide reference for the research,development and application of its antibacterial effect.Methods:According to the method A for determination of volatile oil in Chinese Pharmacopoeia,extract the volatile oil from the dried leaves and fruits of A.villosum,extract volatile oil from the dried leaves and seeds of A.katsumadai,and determine the drug sensitivity of Escherichia coli,Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus to the extracted volatile oil by filter paper diffusion method.Results:The extraction efficiency of volatile oil from dried leaves and fruits of A.villosum are 0.40%and 2.52%,and the diameter of inhibition zone to Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis are 8.3 mm,8.0 mm,18.7 mm and 10.0 mm,26.7 mm,28.7 mm,respectively.The extraction efficiency of volatile oil from dried leaves and seeds of A.katsumadai are 0.14%and 0.73%,and the diameter of inhibition zone to Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis are 10.0 mm,12.7 mm,21.3 mm and 10.0mm,13.3mm,15.7 mm,respectively.Conclusion:The volatile oil from the leaves and fruits of A.villosum and A.katsumadai have an antibacterial effect on Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis.This study provides a basic study on the antibacterial activity of A.villosum and A.katsumadai,and provides a theoretical basis and research ideas for the 基金项目：广州新华学院大学生创新创业训练计划项目（202113902127）；广州新华学院科产教融合实践教学基地（2022KCJ002）。作者简介：魏洁书（1987），女，广东汕头人，硕士，副教授，研究方向为中药萜类代谢。通信作者：张素中（1969），女，广东梅州人，硕士，教授，研究方向为中药新剂型及中药质量评价。E-mail：。46生物化工2023 年南药，是指我国秦岭以南地区生产的药材，常指生长于南方五岭山脉以南的广东、广西、海南 3 省（区）的陆地和海岛的中药1。南药是中药资源的重要组成部分，资源种类繁多，含有多种有效成分，且大多具有挥发油成分2。多数南药中的挥发油成分具有抗菌作用，如砂仁、肉豆蔻、八角茴香等3-5。阳春砂和草豆蔻均为著名南药。阳春砂为姜科（Zingiberaceae）植 物 阳 春 砂（Amomum villosum Lour.）的干燥成熟果实，能化湿开胃，温脾止泻，理气安胎。草豆蔻为姜科植物草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata.）的干燥近成熟种子，能燥湿行气、温中止呕。挥发油是阳春砂和草豆蔻发挥药效的主要成分6。目前，阳春砂果实与叶片中所含有挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌抑菌活性的差异性尚不明确，草豆蔻果实及叶片挥发油的抑菌活性鲜有报道。本文拟提取阳春砂、草豆蔻 2 种南药不同部位的挥发油进行体外抗菌药效实验，初步研究 2 种南药对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种常见菌株的抑菌效果，为其抑菌活性在食品、药品研究中的开发及应用提供参考，同时为阳春砂和草豆蔻非药用部位的开发利用提供理论依据。1 材料与方法1.1 试剂与仪器阳春砂（Amomum villosum Lour.）、草豆蔻（Alpinia katsumadai Hayata.）植株采自广州新华学院广州校区药用植物园，干燥成熟果实购自广州集芝宝中药有限公司，由广州新华学院药学院张素中教授鉴定。菌种：大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）来自广东环凯微生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BNCC109047），来自北京北纳创联生物技术研究院。LB 琼脂培养基、营养琼脂培养基，广东环凯微生物科技有限公司；链霉素（C014）和青霉素（C001），杭州滨河微生物试剂有限公司。BHC-1300 A/B 生物洁净安全柜，上海苏净实业有限公司；GF54DA 立式自动压力蒸汽灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；GSP-9160MBE 电热恒温培养箱（隔水式），上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DMF-20A 摇摆式高速中药粉碎机，浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司；YP60IN 电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TC-15 套式恒温器，近湖镇教学仪器厂。1.2 挥发油提取1.2.1 阳春砂、草豆蔻阴干叶片挥发油提取（1）摘取阳春砂新鲜叶片，洗净、阴干，用摇摆式高速中药粉碎机适当粉碎后按1.013.3（gmL）的投料比加入蒸馏水，于挥发油提取器中回流提取 7 h，获得挥发油。用无水硫酸钠干燥，得到具有刺激性气味的无色透明液体，装于合适的 EP 管中密封保存备用。（2）草豆蔻阴干叶片同理操作，投料比为 1.0 12.5（g mL），回流提取时间为 6 h，得到具有刺激性气味的浅黄色液体，保存备用。1.2.2 阳春砂果实、草豆蔻种子团挥发油提取（1）用粉碎机适当粉碎阳春砂果实，按投料比1.0 12.5（g mL）加入蒸馏水，用挥发油提取器回流提取 6 h 得挥发油，用无水硫酸钠干燥，得到具有刺激性气味的黄色或浅黄色液体，装于合适的 EP管中密封保存备用。（2）草豆蔻种子团同理操作，投料比为 1.0 6.67（g mL），回流提取 6 h，得到具有刺激性气味的黄色或浅黄色液体，保存备用。1.2.3 挥发油提取率挥发油提取率按照公式（1）计算。=100%mTm油药（1）其中，T 为挥发油提取率，m油和 m药分别为挥发油质量和药材质量，g。实验重复3次，计算平均值。development of natural and green antibiotics.Keywords:Amomum villosum;Alpinia katsumadai;volatile oil;bacteriostatic activity第 3 期47魏洁书等：南药阳春砂、草豆蔻挥发油抑菌活性研究1.3 抑菌实验1.3.1 制备培养基称取和量取比例为 1 30（g mL）的营养琼脂培养基粉末和无菌蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，用牛皮纸包扎，在高压蒸汽灭菌锅灭菌，倒入培养皿里，约 5 mm 的高度，冷却后备用，以上操作均在生物安全柜进行。1.3.2 制备菌悬液参考文献 7 制备菌悬液。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌 3 种供试菌分别接种到新鲜斜面培养基上活化，第二天用无菌接种环从斜面培养基上分别挑取各供试菌接种到 LB 液体培养基中，于恒温培养箱培养 24 h 后吸取 200 L 各供试菌的菌悬液，用无菌蒸馏水分别稀释 10、102、103、104、105、106、107、108倍，再分别吸取各供试菌稀释液 200 L 均匀涂到营养琼脂平板上，于恒温培养箱 37 倒置培养 24 h。每个浓度重复三次，通过平板计数法确定菌液的稀释度，使最后菌悬液含量为106 107/mL，待用。1.3.3 抑菌圈测定分别吸取三种菌液 200 L 到上述配制好培养基的平板中，使用涂布器将菌悬液供试菌种涂抹均匀。用灭菌的镊子夹取已灭菌的空白药敏片，浸泡在阳春砂、草豆蔻阴干叶子和果实提取得到的挥发油中，浸泡 20 min 之后取出，稍微晾干，贴在已经分别涂布了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的平板里，每个平板分别贴三片药敏片，分别是阳性对照、空白对照和供试品挥发油，呈正三角形。大肠杆菌抑菌实验以链霉素（10 L/片）作为阳性对照，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑菌实验以青霉素（10 L/片）作为阳性对照。空白对照以空白药敏片作为对照。实验重复操作 3 次。于电热恒温培养箱（隔水式）37 倒置培养 24 h，测量抑菌圈的直径大小，取平均值进行分析。判定标准如表 1。表 1 抑菌效果判定标准8抑菌圈直径/mm抑菌效果 15高度敏感10 15中度敏感7 9低度敏感0不敏感2 结果与分析2.1 挥发油提取率计算得到阳春砂阴干叶片及果实的挥发油提取率分别为 0.40%和 2.52%，草豆蔻阴干叶片和种子团挥发油提取效率分别为 0.14%和 0.73%，两种南药果实均具有较高的含油量。2.2 阳春砂不同部位挥发油抑菌效果由表 2 可知，阳春砂叶片和果实的挥发油对三种菌株均具有抑菌效果，其中对枯草芽孢杆菌的抑菌效果均强于其余两种菌株，抑菌圈直径分别达到 18.67 mm 和 28.67 mm，为高度敏感；阳春砂果实对金黄色葡萄球菌也有抑菌效果，抑菌圈直径达到 26.67 mm，为高度敏感；对大肠杆菌的抑菌效果均较弱。空白对照结果均无抑菌圈。阳春砂叶片和果实对 3 种菌株的抑菌效果分别见图 1 和图 2。2.3 草豆蔻不同提取部位挥发油抑菌效果由表 3 可知，草豆蔻叶片和种子团挥发油对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径分别达到21.33 mm 和 15.67 mm，为高度敏感；叶片和种子团对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相当，抑菌圈直径分别为12.67 mm 和 13.33 mm，具有一定的抑菌效果，为中度敏感；对大肠杆菌的抑菌效果均较弱，为偏弱的中度敏感。空白对照均无抑菌圈。草豆蔻阴干叶片和种子对三种菌株的抑菌效果分别见图 3 和图 4。3 讨论多数南药中的挥发油成分具有抗菌作用，如八角茴香挥发油对多种革兰氏阳性菌和阴性菌具有抗菌效果，如金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念球菌等。紫苏叶挥发油对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都 表 2 阳春砂不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（xs，n=3）（单位：mm）提取部位大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌供试品阳性对照供试品阳性对照供试品阳性对照叶片8.330.4720.330.948.000.8237.005.7218.671.7021.333.86果实10.000.0020.000.0026.672.3641.672.3628.675.7335.005.7248生物化工2023 年 （a）大肠杆菌 （b）金黄色葡萄球菌 （c）枯草芽孢杆菌图 1 阳春砂阴干叶片对 3 种菌株的抑菌效果注：图中 A、B、C 分别为阴干叶片/果实挥发油、空白对照和阳性对照。下同。（a）大肠杆菌 （b）金黄色葡萄球菌 （c）枯草芽孢杆菌图 2 阳春砂果实对 3 种菌株的抑菌效果 表 3 草豆蔻不同提取部位挥发油对三种菌株的抑菌效果（xs，n=3）（单位：mm）提取部位大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌供试品阳性对照供试品阳性对照供试品阳性对照叶片11.331.8922.002.1612.670.4743.000.0021.330.9424.000.00果实9.330.8220.670.4713.331.8944.700.9415.671.2524.330.94 （a）大肠杆菌 （b）金黄色葡萄球菌 （c）枯草芽孢杆菌图 3 草豆蔻阴干叶片对 3 种菌株的抑菌效果 （a）大肠杆菌 （b）金黄色葡萄球菌 （c）枯草芽孢杆菌图 4 草豆蔻种子团对 3 种菌株的抑菌效果有较强的抗菌作用9。肉豆蔻挥发油可以抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等，是一种天然的广谱抗菌药。此外，广藿香、丁香、姜黄等南药中挥发油成分也具有此方面的药理作用10-12。第 3 期49魏洁书等：南药阳春砂、草豆蔻挥发油抑菌活性研究阳春砂和草豆蔻是著名的南药，其挥发油含量较高。本研究发现，阳春砂和草豆蔻药用部位（果实/种子团）及非药用部位（叶片）提取的挥发油均对枯草芽孢杆菌表现出较强的抑菌效果，阳春砂果实对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较叶片明显，草豆蔻叶片和种子团对金黄色葡萄球菌都有一定的抑菌效果，2 种南药挥发油对大肠杆菌的抑菌效果均不明显。由于挥发油在水中溶解度低，故在培养基中不易扩散，同时挥发油的挥发也降低了其在滤纸表面的浓度，故阳春砂和草豆蔻挥发油的实际抑菌作用可能更强。有研究表明，阳春砂果实挥发油对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌表现出显著的抑制活性13。本研究中，阳春砂果实和叶片挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均表现出一定的抑菌效果，其中果实挥发油的抑菌效果更优。研究表明，阳春砂果实挥发油中主要含有乙酸龙脑脂、樟脑和乌药醇，叶片挥发油中主要含有-蒎烯、-蒎烯和柠檬烯14-15。乙酸龙脑酯作为阳春砂果实的主要药效成分，有显著的抑菌效果，因而果实挥发油抑菌效果更优。阳春砂叶片中的-蒎烯是植物中广泛分布的挥发性萜类16，-蒎烯、-蒎烯、柠檬烯同样具有抑菌杀菌作用17-20。草豆蔻果实及叶片挥发油主要含有法尼醇和桉叶油素21-22，其中法尼醇具有杀菌作用23。研究表明，挥发油的整体抑菌活性优于其中若干化学成分的组合，整体抑菌活性与其化学成分之间的协同作用有密切关系24-26，微量成分与主要成分更有可能形成协同抑菌作用。基于阳春砂和草豆蔻挥发油中含有的主要化学成分，可认为阳春砂挥发油抑菌活性可能是乙酸龙脑酯、樟脑与其他成分协同作用的结果，草豆蔻挥发油的抑菌活性可能是法尼醇、桉叶油素与其他成分协同作用的结果。4 结论本研究表明，阳春砂叶片和果实、草豆蔻叶片和种子团的挥发油对枯草芽孢杆菌均有明显的抑菌效果，对金黄色葡萄球菌表现出一定的抑菌活性。阳春砂果实对金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌效果。本研究初步探讨了南药阳春砂和草豆蔻的抑菌活性，为其抑菌活性在食品、药品研究中的开发及应用提供了参考，同时为阳春砂和草豆蔻非药用部位的开发利用提供了理论依据。参考文献1 陈蔚文,徐鸿华.岭南道地药材研究 M.广州:广东科技出版社,2007.2 张利芳,罗春,王晖.常见南药中挥发油药理作用研究进展 J.广东药学院学报,2014,30(1):115-117.3 曹冠华,张雪,陈月月,等.阳春砂仁叶和杆乙醇提取物抑菌作用的比较 J.中成药,2020,42(7):1914-1917.4 DE M,DE A.K,SEN P,et al.Antimicrobial properties of star anise(Illicium verum Hook f)J.Phytother 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