南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶LacHa蛋白对小麦面包品质的影响.pdf

第 29 卷 第 4 期2023 年 8 月（自然科学版）JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)Vol.29 No.4Aug.2023DOI:10.12066/j.issn.1007-2861.2516生物与食品科学南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响王晶晶,周鹏,白涵,张然,方雪,张雁(合肥师范学院 生命科学学院,安徽 合肥 230601)摘摘摘要要要:以南极碱盐单胞菌中的漆酶为研究材料,将该漆酶基因在大肠杆菌中进行异源表达,获得重组漆酶的分子量为 68.5 kDa,酶活为 224.5 U/L.进一步将该漆酶用于小麦面包的制作,以不添加漆酶的空白组为对照,实验组漆酶添加量分别为 1、2、3、4、5 和 6 U.研究结果表明,小麦面包的比容值在漆酶添加量为 5 U 时达到最大.在此条件下,小麦面包的硬度、黏着性、咀嚼性均有极显著下降的趋势(p 0.01).随着储藏天数的增加,小麦面包品质有所下降,但漆酶添加量为 5 U 的实验组在第 3 天的硬度、黏着性仍极显著优于对照组.可见,细菌漆酶作为一种面粉改良剂,在烘焙食品的制作中具有较大的开发潜力,在食品加工领域有着较为广阔的应用前景.关关关键键键词词词:漆酶;异源表达;小麦面包;面包品质中中中图图图分分分类类类号号号:TS 20文文文献献献标标标志志志码码码:A文文文章章章编编编号号号:1007-2861(2023)04-0615-13Effect of a bacterial laccase LacHa protein fromHalomonas alkaliantartica on the quality ofwheat breadWANG Jingjing,ZHOU Peng,BAI Han,ZHANG Ran,FANG Xue,ZHANG Yan(School of Life Sciences,Hefei Normal University,Hefei 230601,Anhui,China)Abstract:In this study,the laccase from Halomonas alkaliantartica was used as theresearch material.The laccase gene was heterolytically expressed in Escherichia coli;arecombinant laccase was obtained with a molecular weight of 68.5 kDa and an enzymeactivity of 224.5 U/L.This enzyme was then used in the production of wheat bread,witha blank group of bread produced without laccase as the control.To create the variousexperimental groups,laccase was added in amounts of 1,2,3,4,5,or 6 U.Compared withthe blank group,the specific volume of the wheat bread was the largest in the 5 U laccasegroup.Under this condition,the hardness,adhesion,and chewability of the wheat breadsignificantly decreased(p 0.01).As storage duration increased,the quality of the breaddecreased,but the hardness and stickiness of the experimental bread(5 U laccase)were收稿日期:2023-04-25基金项目:国家自然科学基金资助项目(31800049);安徽省高校自然科学重点项目(2022AH052156,2022AH052166)通信作者:张雁(1984),男,副教授,博士,研究方向为微生物的资源开发与利用.E-mail:616（自然科学版）第 29 卷still better than those of the control group on the third day.This study shows that laccase,as a flour improver,has considerable potential for use in the preparation of baked foodsand broad application prospects in the field of food processing.Key words:laccase;heterologous expression;wheat bread;bread quality小麦是 3 大主要农作物之一,含有丰富的淀粉.由于生长环境存在差异,故在干旱地区的小麦颗粒质地较硬,具有良好的韧性和筋度.另外,小麦淀粉可广泛应用于烘焙食品行业及生产胶粘剂1.小麦面包作为一种最古老的食品加工产品之一,有较好的饱腹性和营养价值2.由于各种因素如生长环境、运输贮藏方式、生产工艺等的限制,有些小麦面粉出现面筋品质不好、形成的面团弹性不足等问题.随着生活质量的提高,人们对小麦面包的品质要求也在提高,研究人员开始利用改良剂来改善面包品质.在众多的食品添加剂中,酶制剂由于其高度的专一性、高效性以及绿色安全性等优势脱颖而出.漆酶(laccase,Lac)(EC 1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化酶3,铜离子是漆酶氧化的活性部位,利用铜离子的氧化能力氧化还原性基质,将电子传递给氧,再将氧还原为水4,其产物对环境友好.漆酶催化的底物应用范围广泛,在造纸、废水处理、染整加工和食品加工等领域发挥重要作用,其中在食品加工领域优势更显著.另外,漆酶易提取,广泛存在于植物和微生物中.漆酶在焙烤过程中具有促进蛋白交联的特性,可将面团中的巯基氧化为二硫键,使得二硫键的数量增多,从而增强面筋的强度,对面包品质有显著的改善作用.酶的交联作用在食品加工中的应用被广泛认为是一种绿色加工技术5.据报道,谷氨酰胺转胺酶可以加强面筋蛋白形成的网络并改善中式面条的机械加工能力6.同时,酪氨酸酶和漆酶已被用于改性无麸质燕麦面团和无麸质面粉7.本工作将来自于南极碱盐单胞菌(Halomonas alkaliantartica)中的漆酶 LacHa 蛋白在大肠杆菌中进行异源表达,用纯化获得的酶制作小麦面包,以此来研究该酶对面包品质的影响.通过对小麦面包的比容、质构特性、储藏性的数据进行测定与分析,结合面团的扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)的观察结果,发现 LacHa 蛋白作为面粉改良剂,对小麦面包的性质有较为显著的影响,并且加入 LacHa 蛋白能减缓面包的老化,延长小麦面包的储藏期.1材料与方法1.1材料1.1.1材料与试剂蛋白胨、酵母提取物和琼脂糖,上海生工生物工程有限公司;大肠杆菌(Escherichia coliBL21),北京全式金生物技术有限公司;全蛋液,合肥蛋总管蛋业有限公司;pET-22b 表达载体,由本实验室自主保存;Ni2+柱,金斯瑞生物科技有限公司;丁香醛连氮(syringaldazine),上海西格玛高技术有限公司;十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、氨苄(ampicillin)、考马斯亮蓝 R250,上海生工生物工程有限公司;面包粉,新乡良润全谷物食品有限公司;高活性酵母,安琪酵母股份有限公司;白砂糖,新乡良润全谷物食品有限公司;食用盐,中盐东兴盐化股份有限公司;食用油,山东西王食品有限公司.1.1.2实验仪器智城恒温培养振荡器,上海智城分析仪器制造有限公司;JY92-II 超声波细胞粉碎机,宁波江南仪器有限公司;EPS-100 电泳仪,上海天能科技有限公司;手动单道可调移液枪、移液器,杭州驰成医药科技有限公司;AlpHa1500 紫外可见分光光度计,上海谱元仪器有限公司;第 4 期王晶晶,等:南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响617MDF-U3386S 冰箱,北京伯辉生物科技有限公司;PL602-L 电子天平,上海速展计量仪器有限公司;苏泊尔 SDHCB45-210 电磁炉,浙江苏泊尔股份有限公司;电热恒温培养箱,南京凯乐仪器科技有限公司;商用大容量电烤箱,广东乐创电器有限公司;XT.P1us 质构分析仪,超技仪器有限公司;冷场发射扫描电子显微镜,日本日立有限公司.1.2实验方法1.2.1LacHa 基因的异源表达1.2.1.1LacHa 基因重组表达载体的构建根 据 NCBI 基 因 数 据 库 中 已 公 布 的 H.alkaliantartica 漆 酶 的 基 因 序 列(编 号:NZ AYOZ01000034.1),设计特异性引物(上游:50-ATGAACCCCTGGGGCCGCAGC-30;下游:50-AGAAACCTGAACAACGCGGA-30)对目的基因进行扩增;基因表达载体 pET-22b 购于上海生工生物工程有限公司,使用连接酶将目的基因序列与载体连接构建成重组表达载体.选择 E.coli BL21 作为宿主细胞,将构建好的重组表达载体转化到细胞中重组表达,同时对目的序列进行序列测定.1.2.1.2大肠杆菌 LacHa 基因转化与蛋白分离纯化挑取培养皿中的单菌落,接种到含有 0.1%的氨苄青霉素的 2 mL LB 试管内,在150 r/min、37C 摇床中培养过夜;吸取 1 mL 菌液加入到含有 100 mL LB 培养基的锥形瓶(250 mL)中,置于 150 r/min、37C 摇床中培养至 OD600为 0.50.8.加入 50 L IPTG诱导,继续置于 150 r/min、16C 摇床内培养 3 h.将菌液离心收集,用缓冲液重悬,然后用超声破碎法破碎细胞,将破碎后的细胞全液倒入10 mL EP 管内,放入 4C 离心机 12 000 r/min 离心 40 min,收集菌体(离心后上清留样);按照 1Elute 6 mL、纯水 6 mL、1Strip 6 mL、1Charge 6 mL 顺序清洗 Ni2+柱,取离心后上清液过 Ni2+柱(离心后沉淀留样),待上清液全部过滤完后按照顺序用 5、20、40、60、80、100和 200 mmol/L 咪唑各 10 mL 洗脱 Ni2+柱,并用 1.5 mL 离心管接取滤液并按照顺序标记.1.2.1.3LacHa 蛋白的 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)检测及活性测定取各浓度梯度洗脱液 100 L、试管菌液 100 L、破碎细胞全液 100 L、离心上清 100 L、沉淀用纯水重悬悬液 100 L、酶液 100 L,各加入 2 上样缓冲液 100 L 100C 煮沸 10 min.取各样品 15 L 点样,在 80 V 电压电泳至样品过浓缩胶改成 100 V 电压,一段时间后改成120 V 至电泳结束.将电泳后的胶放入染色液中,微波炉加热 3 min,回收染色液;用脱色液没过胶,微波炉加热 10 min,多次脱色,直到条带清晰可见.选择 1 mL 的丁香醛连氮的反应体系(纯酶液 50 L,Cu2+(10 mmol/L)10 L,底物(10 mmol/L)10 L,磷酸盐缓冲液 930 L),将粗酶液和纯酶液分别在 45C、pH 为 7.5 的条件下反应 5 min,测定 3 组 OD525值并取平均值;酶活定义为一个酶活单位为 1 min 氧化1 mol 底物所需的酶;丁香醛连氮作为氧化物时,漆酶酶活可计算为E(U/mL)=OD525/(6.5 105(V 106).1.2.2小麦面包烘焙每个小麦面包以 50 g 小麦面粉、0.5 g 酵母、10 g 鸡蛋液、0.5 g 盐、8 g 糖、1 g 植物油为原料,以分别加入不同添加量的 LacHa 为实验组.随机选取 2 份设为对照组,2 份对照组均不添加漆酶,其中一份加入等量纯水,另一份加入等量磷酸盐缓冲液.将所有配料混合均匀,揉成面团,让面团在室温下自然发酵 30 min.发酵结束后开始揉面,揉出手套膜(注:尽可能在 20 min 内揉出手套膜,防止面团揉搓过度而变硬);将揉好的面团,置于恒温箱中醒发 2 h618（自然科学版）第 29 卷(温度 30C,湿度 80%);取出面团后,对面团进行排气、分割、整形处理,放入模具并附上一层保鲜膜,再次醒发 1 h(温度 37C,湿度 85%);取出醒发好的面团放入高温烤箱中烘烤(上火 160C,下火 180C)18 min,取出面包样品,冷却至室温,放入包装袋.根据前期实验数据,确定实验组 LacHa 的添加量分别为 1、2、3、4、5 和 6 U.1.2.3小麦面包性质的测定1.2.3.1小麦面包比容测定本工作采用小米体积置换法测定小麦面包的比容8.在一个大烧杯中装满小米,烧杯中小米的体积记录为 V1,烤制完成晾凉后的面包称重记录为 m.将杯中小米倒出,留少许小米在杯底(厚度约为 3 cm).将待测样品放入杯中,接着将刚刚倒出的小米装入杯中,填满(注:不要留有空隙).收集剩余的小米,测其体积记录为 V2,测定面包的比容 (mL/g)为=V1 V2m.1.2.3.2小麦面包质构特性的测定对实验组和空白对照组的小麦面包进行质构分析,能更准确地探究 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响.本实验使用的仪器为 XT.P1us 质构分析仪,对小麦面包进行质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)模式全质构特性分析,测定小麦面包的硬度、咀嚼性、黏着性、弹性、回复性等质构参数,数据客观,具有重要的参考价值.将烤制后的小麦面包晾凉,对小麦面包样品进行简单的整形处理,去除小麦面包表面的外皮,用面包刀将小麦面包切成长度 50 mm、宽度 30 mm、高度 30 mm 大小的小麦面包样品;将处理好的小麦面包放在质构仪的测试平台上进行测试(TPA 模式,探头 P/36R,测试前速度1.0 mm/s,测试速度 2.0 mm/s,触发点负载 5.0 g,行变量 50%,间隔时间 30 s),循环 2 次进行质构分析,每个样品测 3 次后取平均值.1.2.3.3感官评价法参照 GB/T 358692018 制定的标准,选取 20 名感官评定人员组成评价小组.将小麦面包在室温下冷却后,放入食品袋储存;然后分别从面包体积、面包外观、包芯色泽、包芯质地和包芯纹理结构 5 个方面对小麦面包外部和内部特征进行感官评定.满分 100 分,其中面包体积(45 分)、面包外观(5 分)、面包芯色泽(5 分)、面包芯质地(10 分)和面包芯纹理结构(35分),具体评分细则参照如下面包烘焙品质评分标准.以面包体积、面包外观、面包芯色泽、面包芯质地和面包芯纹理结构为因素集,以优、良、中、差为评语集.根据感官评定结果,建立 5 个单因素评价矩阵,用模糊数学评定方法进行分析.方法如下:(1)因素集 U=面包体积,面包外观,面包芯色泽,面包芯质地,面包芯纹理结构;(2)评语集 X=优,良,中,差;(3)权重集 Y=0.45,0.05,0.05,0.10,0.35,即面包体积(45 分)、面包外观(5 分)、面包芯色泽(5 分)、面包芯质地(10 分)和面包芯纹理结构(35 分);(4)模糊关系综合评判集 A=Y Z,其中 Y 为权重集,Z 为模糊矩阵;(5)整理专家评定小组的评价结果;(6)确定模糊矩阵.1.2.3.4统计学分析将上述感官评价与仪器分析的各项指标分别作为独立性因素,应用 SPSS 23.0 软件对数据进行单因素方差分析(one-way analysis of variance(ANOVA),n=3),用 表示达到显著第 4 期王晶晶,等:南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响619差异(p 0.05),表示达到极显著差异(p 0.01).1.2.3.5面包储藏特性的测定将烘焙好的小麦面包自然晾凉后,密封保存,测定储藏期前后面包的水分质量分数,进行质构分析、观察储藏期内小麦面包硬度的变化.每隔 24 h 后用质构仪检测面包的硬度、弹性、回复性、黏着性、咀嚼性等数据值,测量 3 次,结果取平均值,连续 3 d(通常未添加任何成分的面包保质期为 3 d).1.2.4面团微观结构的观察参照 Bonet 等9的方法稍作修改.将冻干处理后的待测面团切开,刮下待测样品内部粉末通过导电胶布固定在载物台上(未被完全固定上的粉末用洗耳球吹去),通过离子溅射仪对待测样品表面进行 2 次约 6 min 的镀金处理后,将载物台取出放置于蔡司扫描电镜载物腔内抽真空加压,以 200 倍放大倍数对样品的横断面进行观察.2结果与讨论2.1LacHa 基因序列的扩增以及阳性转化子的验证通过 Primer 3.0 设计目的基因的上下游引物后进行聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)扩增,目的片段为 1 737 bp,与扩增结果得到的目标条带位置相当(见图 1(a),对其进行切胶回收,回收后将片段送至上海生工生物工程有限公司进行测序,结果确认无误,可以进行后续操作.对含有目的基因的重组载体进行转化后,挑取阳性转化子,进行菌落 PCR验证,结果显示条带 1 的序列长度与目的基因的片段相当(见图 1(b),将其送往生物公司测序证明序列的正确性.5 0003 0001 737 bpM1MMaker;1LacHa?M12 0001 0007505002501001 5005 0003 0001 737 bp2 0001 0007505002501001 500(b)?PCR?(a)?LacHa?PCR?/bp?/bp图 1 LacHa 基因序列 PCR 琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 PCR electrophoresis map of LacHa gene sequence2.2LacHa 蛋白的异源表达通过镍柱纯化,获得了 50 mL 的 LacHa 纯蛋白,其分子量约为 68.5 kDa.以丁香醛连氮为底物,检测 LacHa 蛋白的酶活为 224.5 U/L,总酶活为 10.8 U.620（自然科学版）第 29 卷图 2 为 SDS-PAGE 凝胶电泳图.1116.0?/kDa66.245.035.025.018.011.4234561Maker;2未诱导细胞溶液;3诱导后的细胞全液;4破碎细胞的上清溶液;5破碎细胞的沉淀;6镍柱纯化的漆酶LacHa 蛋白.图 2 SDS-PAGE 凝胶电泳Fig.2 SDS-PAGE gelelectrophoresis目前,食品烘焙中使用的大多数漆酶来自真菌,如米曲霉(Aspergillus oryzae)、云芝等(Trametes hirsute)(见表 1).虽然催化反应相似,但真菌漆酶和细菌漆酶的性质还是存在较大差异.与真菌漆酶相比,细菌漆酶表现出相当低的氧化还原潜力16;使用氧化还原介质,细菌漆酶可以降解具有比真菌漆酶更高氧化还原电位的难降解底物17.前期表明,当漆酶与其他物质混合时,可以进一步改善面团的性质,并加强面团内部蛋白质的相互联系,如酪氨酸酶和漆酶的组合,以及漆酶和木聚糖酶的相互作用13,18.在本工作中,单独且较低量的 LacHa 蛋白(4 U/100 g 面粉)也能提高小麦面包的质量,这一结果为细菌漆酶在食品加工行业中的应用打下了一定的理论和实践基础.表 1 漆酶在食品加工领域的应用Table 1 Laccase applications in food processing来源菌株酶的活性/(Umg1)最适 pH分子量/kDaTrametes hirsute7,10149.904.5Trametes versicolor11-120.505.545Aspergillus oryzae13800.004.556Myceliophthora thermophila143.134.5140Aspergillus oryzae1530.005.0582.3小麦面包比容的测定含有 LacHa 蛋白实验组的小麦面包体积与对照组面包的体积有明显差异.LacHa 蛋白处理后的面包体积增大,比容相较于对照组普遍提升.小麦面包的比容在 LacHa 蛋白添加时有增大的趋势.结果显示:LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,小麦面包比容最大,与对照组的第 4 期王晶晶,等:南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响6212.51 mL/g 相比,添加量为 5 U 时比容达到 3.45 mL/g,增幅 0.94 mL/g;但是当 LacHa 蛋白添加量为 6 U 时,比容值减小到 3.05 mL/g(见图 3).此外,2 个对照组中,添加磷酸盐缓冲液相较于添加纯水的小麦面包,比容明显增大,这可能与磷酸盐缓冲液可以稳定面包结构相关.根据统计学分析,只有在 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,其和对照组 C1 之间存在极显著差异(见图 3).图 3 中,C1 为对照组,小麦蒸馏水;C2 为对照组,小麦+缓冲液;1U6U 分别为含有 LacHa 蛋白添加量为 1、2、3、4、5 和 6 U 漆酶反应体系的实验组;表示在 0.01 水平上显著差异.C14.03.53.02.52.01.51.00.50C21U2U*3U4U5U6U?/(mLg1)图 3 小麦面包比容测定结果Fig.3 Measurement results of wheat bread specific volume小麦面包的比容经常被用来衡量小麦面包的品质,小麦面包的比容越大代表面筋的强度越大,面团的醒发力也越大,从而能使烘焙后的小麦面包越不容易塌陷.比容值可以表示小麦面包的膨胀程度,小麦面包体积增大,一方面是因为微生物的产气,另一方面漆酶也可以促进面团的面筋蛋白发生交联聚合反应,使烘焙后的小麦面包更为蓬松19,小麦面包的体积增大,比容也随之增大.研究显示,在小麦面团中加入漆酶可以使面团的强度增大,进而使面团的体积明显增大12.小麦面包中添加漆酶,发现漆酶处理组的面团交联度随着漆酶的浓度上升而增大,且漆酶处理组的小麦面包的体积也要明显大于对照组7.而本研究结果证明了加入 5 U的漆酶会使小麦面包的体积有极显著增大.另外,漆酶水解淀粉产生的麦芽糖能够促进酵母的发酵,产生二氧化碳,从而使小麦面包蓬松19;但当漆酶添加到一定量时,淀粉过度水解造成面团的弹性和延展性下降,小麦面包蓬松性降低,从而体积减小.为了验证本方法的精确性,对待测面包进行了长、宽、高的测量,每个样品测量 3 次,最终结果取平均值,再与运用小米体积置换法得到的数据进行比较(见图 4).比较结果表明,小米置换体积法数据与小麦面包实际体积接近,精确度较高,实验方法可靠.2.4小麦面包的感官评价对空白对照组和添加不同剂量 LacHa 蛋白的小麦面包进行感官评定,对小麦面包的体积、外观、色泽、质地和纹理结构进行打分,结果如图 5 所示.随着 LacHa 蛋白添加量的增大,感官评价结果的数值越大,但 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时的数值比添加量为 6 U 时大,这表明小麦面包在 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,小麦面包品质最优且实验组结果显著.2.5小麦面包的质构仪检测图 6 为小麦面包硬度、黏着性、咀嚼性的测定数据.可以看出:随着 LacHa 蛋白添加量的增大,小麦面包的品质并非逐渐提升;小麦面包的硬度、黏着性和咀嚼性在 LacHa 蛋622（自然科学版）第 29 卷C1120100806040200C21U2U3U4U5U6U?图 4 小麦面包长、宽、高测定数据Fig.4 Measurement data of wheat bread length,width and height109876543C1C21U2U3U4U5U6U?图 5 感官评价综合分析表Fig.5 Comprehensive analysis table of sensory evaluation白添加量为 5 U 时分别连续下降到 309.318 g、289.546 和 75.177 g,弹性和回复性分别达到了最大值 0.880 和 0.408;LacHa 蛋白添加量为 6 U 时,硬度、黏着性和咀嚼性反而上升到982.568 g、1048.284 和 639.291 g,弹性和回复性下降到 0.850 和 0.339.因此,在 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时小麦面包品质达到最优水平,在此条件下硬度、黏着性和咀嚼性相比对照组显著降低,降幅达到 46 倍.此外,2 个对照组中,添加磷酸盐缓冲液相较于添加纯水的小麦面包,黏着性降低,弹性明显增大,硬度、咀嚼性和弹性没有太大差异,小麦面包的品质有所提升,进一步说明磷酸盐缓冲液可以稳定面包的结构.统计学分析结果显示,漆酶添加量为 5 U和 6 U 时,小麦面包的硬度、黏着性、咀嚼性均与 2 个对照组有显著差异.小麦面包的硬度、黏着性以及咀嚼性与小麦面包成品的品质呈负相关关系.小麦面包的硬度越大,小麦面包越缺少弹性,品尝的口感不佳;咀嚼性越大,则表明小麦面包咀嚼起来越费劲,反映出的小麦面包品质就更差;黏着性越小,面包的口感就越绵软、爽口.据报道,漆酶在烘烤中增强了蛋白的交联性,能将面团中的巯基氧化成二硫键,使得面团的弹性和硬度均有所第 4 期王晶晶,等:南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响623C1C21U2U3U4U5U6U*0.05?*?3 0002 5002 0001 5001 0005000?C1C21U2U3U4U5U6U?1.00.80.60.40.20?(b)?(a)?图 6 小麦面包硬度、黏着性、咀嚼性的测定数据Fig.6 Measurement data of hardness,adhesion and chewiness of wheat bread改善,该方法可以有效地增大小麦面包的体积,提高小麦面包的均匀度,同时还能让面团中的阿魏酸氧化,从而增强小麦面包的弹性,使小麦面包的味道更加浓郁20.研究显示,较高剂量的漆酶20或与木聚糖酶组合可观察到小麦面包的软化,这可能是由于多酚或阿拉伯木聚糖的过度氧化21.但本实验采用的 LacHa 蛋白,在添加量较少的情况下便可达到较明显的实验效果,减少了漆酶的使用量,也能更为经济地将其应用到实际生产中.从图 5 的感官评价结果可以发现,当 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,综合评分最高,这意味着小麦面包的体积、外观、色泽、质地和纹理结构在此时均为最佳.小麦面包的比容、质构特性与小麦面包的感官评价有直接的关系,比容大的小麦面包蓬松可口,完整饱满;硬度、咀嚼性、黏着性小的小麦面包绵软爽口;弹性大的面包更有筋道且外表更加美观诱人,并且口感也更佳.因此,综合小麦面包体积、外观、色泽、质地和纹理结构的评分,可得出在 LacHa 蛋白添加量逐渐增大的条件下,小麦面包的感官评定综合分布呈现出先升高后下降的趋势,与小麦面包的比容及质构特性的变化趋势一致(见表 2).由此可见,在 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,小麦面包的品质最佳.这可能是由于 LacHa 蛋白与面团中面筋蛋白相互作用,增强了面筋的筋性、弹性和延展性,同时 LacHa 蛋白促进了酵母的发酵,产生的二氧化碳使面包更蓬松、绵软,进一步提高了小麦面包的外观、质地和纹理结构20.表 2 感官评价和仪器分析结果相关性分析Table 2 Correlation analysis of sensory evaluation and instrumental analysis results评价指标硬度/g弹性黏着性回复性咀嚼性/g体积0.7830.3810.6550.5310.655外观0.6740.0260.5940.4730.664色泽0.6720.1200.6340.4230.654质地0.4660.1100.3300.1980.373纹理结构0.8000.3650.7170.6400.719注:n=8;表示在 0.05 水平上显著差异;表示在 0.01 水平上极显著差异.624（自然科学版）第 29 卷2.6小麦面包的储存性将小麦面包置于室温 20C 左右、干燥阴凉的环境下(相对湿度在 50%左右)储藏 3 d.分别测定不添加以及添加不同剂量 LacHa 蛋白的小麦面包的硬度、黏着性、咀嚼性、弹性和回复性(见图 7).结果显示,各组的硬度、黏着性和咀嚼性在第 1 天或第 2 天达到最小值;随着时间推移,数据整体上表现出上升的趋势,弹性和回复性整体表现出下降的趋势(见图 7).第 1 天实验组小麦面包的硬度极显著低于对照组数值,添加酶量为 5 U 和 6 U 的实验组的黏C1C21U2U3U4U5U6U?3 5003 0002 5002 0001 5001 0005000?/g1d2d3d(a)?C1C21U2U3U4U5U6U?2 0001 5001 0005000?1d2d3d(b)?C1C21U2U3U4U5U6U?1 8001 6001 4001 2001 0008006004002000?/g1d2d3d(c)?C1C21U2U3U4U5U6U?0.50.40.30.20.10?1d2d3d*(e)?C1C21U2U3U4U5U6U?1.00.80.60.40.20?1d2d3d(d)?图 7 各组样品的质构特性随贮藏时间的变化Fig.7 Variation of texture characteristics of each group with storage time第 4 期王晶晶,等:南极碱盐单胞菌来源的细菌漆酶 LacHa 蛋白对小麦面包品质的影响625着性和咀嚼性极显著低于实验组数据;当 LacHa 蛋白添加量为 5 U 时,小麦面包第 3 天的硬度、黏着性和咀嚼性分别上升到 1 922.501 g、1 187.779 和 984.508 g,其中硬度和黏着性仍极显著小于 2 个对照组第 1 天的数值(见图 7(a)(c),说明添加 LacHa 蛋白可以减缓小麦面包老化的速度,延长其货架期.Caballero 等22发现,形状更好的小麦面包对应于韧性更高、延展性更低的面团.这种关系表现为韧性和延展性显示出的最佳相关系数.经添加 LacHa 蛋白处理后,小麦面包的品质变化相较于对照组来说较慢,这是因为添加漆酶后,小麦面包的硬度会降低而弹性会增大,且最大保水性和持水性也较大改善.本实验添加 LacHa 蛋白所制得的小麦面包老化速度减缓,可认为 LacHa 蛋白能达到延长小麦面包的储藏性,改善保质期的效果.2.7小麦面团的微观结构观察利用 SEM 观察有无添加 LacHa 蛋白的面团在 200 倍放大倍数下的微观结构(见图 8).图 8(a)和(b)中显示,在无 LacHa 蛋白添加的对照组面团中,对照样品表面粗糙,淀粉颗粒外露(白色箭头突出),裂缝较大(蓝色箭头突出).淀粉颗粒聚集成团,并且其在面筋网络结构中分散不均匀,导致形成大量的面筋断裂和缝隙,结构不连续.而在添加 LacHa 蛋白后(见图8(c),面团微观结构得到有效改善,内部孔洞减少,面团结构逐渐变得更加连续均匀,可清晰观察到面团结构变得更加紧密,反映出蛋白的交联程度更高.与本研究结果相似,通过 SEM的观察,发现漆酶的添加可以促进黑麦面条内部蛋白的交联15,进一步证明了漆酶对面团中蛋白质的相互交联具有促进作用.200 m200 m200 m(c)LacHa?5 U(a)?+?(b)?+?图 8 小麦面团的 SEM 图Fig.8 SEM images of wheat dough3结 束 语本工作以来自于南极碱盐单胞菌的漆酶 LacHa 蛋白为材料,将其在大肠杆菌中进行异源表达而获得纯酶液,用于制作小麦面包,以此来研究该酶对面包品质的影响.研究结果显示,626（自然科学版）第 29 卷LacHa 蛋白作为面粉改良剂,对小麦面包的性质有着显著影响.大部分添加 LacHa 蛋白的实验组,小麦面包的硬度、黏着性和咀嚼性都相较于对照组有显著降低(p 0.05),使得小麦面包的口感更加致密.小麦面包的最适漆酶 LacHa 蛋白添加量为 5 U,在此条件下小麦面包的性质达到最优,实验组面团微观结构得到有效改善.此外,添加 LacHa 蛋白后,小麦面包老化速度降低,在一定程度上能够延长小麦面包储藏时间.可见,LacHa 蛋白在食品行业,特别是小麦面包加工和延长小麦面包货架期方面有较大的应用潜力.参参参考考考文文文献献献:1 戴双,訾妍,巨伟,等.面条、面包优质兼用小麦研究进展 J.中国粮油学报,2021,36(2):172-179.2 VegaO,Marco R D,Risio C D.Physical and sensory properties of fresh bread with additionof the enzymes laccase,xylanase,and lipase J.Revista Eia,2015,12(24):87-100.3 Giardina P,Faraco V,Pezzella C,et al.Laccases:a never-ending story J.Cellular andMolecular Life Sciences,2010,67(3):369-385.4 游月丽,梁秀贤.漆酶在食品领域的研究进展 J.中国食品,2021(18):124-125.5 Wee M S M,Henry C J.Effects of transglutaminase on the protein network and in vitrostarch digestibility of asian wheat noodles J.Foods,2019,8(12):607.6 Bellido G G,Hatcher D W.Effects of a cross-linking enzyme on the protein composition,mechanical properties,and microstructure of Chinese-style noodles J.Food Chemistry,2011,125(3):813-822.7 Flander L,Holopainen U,Kruus K,et al.Effects of tyrosinase and laccase on oat proteinsand quality parameters of gluten-free oat breads J.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(15):8385-8390.8 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