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特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF )是一种病因不明，以弥 漫性肺泡炎、肺泡结构紊乱，最终肺间质纤维化为特征的疾病，其临床表现为进 行性呼吸困难，限制性通气障碍，最终呼吸衰竭导致死亡。目前临床上主要采用 非特异性激素、抗炎和抗氧化类药物对其进行治疗，但疗效差，患者发病后中位 生存期仅为3年。特别值得关注的是IPF除高死亡率外，其患者后期因呼吸困难 而极度痛苦，频死感强，凸显对该疾病缺乏有效干预措施的窘境，对患者本人及 其身边人员造成强烈心理冲击，医生与病人对治疗现状均极度失望。IPF是一种 老年性疾病，目前我国每年发病人数超过20万。随着中国人口老龄化的快速形 成和开展，IPF的发病将呈明显上升趋势。因此探寻IPF发病的分子机制，开展 肺纤维化有效的干预靶点和治疗措施，成为当今医学界亟待解决的紧迫课题之一, 具有重要社会需求。
2012-2016年，在国家自然科学基金委的支持下，本课题组开展了“调控Wnt 信号通路对特发性肺纤维化发生开展影响的研究”(81170054),以及“Hedgehog- Wnt信号通路参与特发性肺纤维化发病的分子机制探讨及疾病”(81570059)。干 预IPF的基础研究取得了以下重要研究进展：1.确认Wnt/p-catenin信号通路参 与肺间质干细胞向成纤维细胞分化，证明激活Wnt/p-catenin信号通路促进肺间 质干细胞向成纤维细胞分化；2.抑制Wnt/0-catenin信号通路能够有效抑制成纤维 细胞的活化，促进成纤维细胞的凋亡；3.在IPF动物模型中证明了 Wnt/0-catenin 信号通路处于过度激活状态，给予动物Wnt/p-catenin信号通路广谱抑制剂，阻 断Wnt/p-catenin信号通路，能够抑制肺纤维化的发生开展。
然而，我们在抑制肺间质干细胞向成纤维细胞分化，以及干预IPF发生开展 的研究过程中发现，仅仅通过采用Wnt/p-catenin信号通路抑制剂，不能够完全 抑制Wnt/p-catenin信号通路的过度激活，恢复Wnt/p-catenin信号通路到正常活 力水平(Ref.)o因此我们猜想是否存在一条的途径，能够激活Wnt/%catenin信 号通路；能否通过这两条通路的共同抑制，而到达对Wnt/*catenin信号通路更 好的抑制效果，从而抑制干细胞向成纤维细胞肺分化、成纤维细胞的活化、最终 到达干预IPF的发生开展。
组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator, tPA),是一种糖蛋白，含526个氨基酸。它可通过其赖氨酸残基与纤维蛋白结合，并激活与纤维 蛋白结合的纤溶酶原转变为纤溶酶。tPA能够选择性地激活与纤维蛋白结合的纤 溶酶原，因而不产生应用链激酶时常见的出血并发症。用于急性心肌梗死和肺栓 塞的治疗。于此同时我们课题组研究发现，tPA是具有多重功能的分子，除了能 作为纤溶酶原激活剂也能够作为一种细胞因子，通过与细胞膜上受体LRP-1 （the LDL receptor-related protein-1）结合从而介导下游信号通路的传导。我们在肾脏 纤维化的研究中发现，tPA能够促进肾成纤维细胞的活化为肌成纤维母细胞并促 进肾成纤维细胞的增殖（Ref.）,迁移（Ref.）抗凋亡（Ref.）。
(B)
Genistein /
Tyrosine mutation
Ad. Mek1
tPA
*■
2PD98059
*
। nn [ i_^LLRP-1 knockout LNL7I -LRP-1 siRNA
Erk1/2
旦]
P90RSK 吵 RSKsiRNA
GSK3p
吵
mutant GSK3p Cyclin D1
调控生长
fibroblast proliferation
我课题组最新研究报道：在肾脏纤维化发生开展过程中，tPA通过与细胞膜 上LRP-1受体结合激活生长凋亡相关信号通路,其中包括Wnt、integrin、NF-kB、 p90RSK（Ref.）。值得我们注意的是，tPA能够通过p90RSK信号通路，促进GSK- 30的磷酸化，从而导致细胞质中0-catenin的积累，激活Wnt/0-catenin通路，上 调下游基因cyclin, mmp-9的表达（Ref.）。由此我们推测tPA信号通路可能通过 激活Wnt/p-catenin信号通路促进肺成纤维细胞的活化，决定肺纤维化的发生发 展，即：在特定的病理条件下，tPA与肺成纤维细胞上受体LRP4结合，激活tPA信号通路，促进GSK-30磷酸化，造成细胞质内％catenin的积累，进而过
度激活Wnt/0・cateniii信号通路，促使肺成纤维细胞活化，最终导致肺纤维化的 发生开展。
最新研究报道，IPF发生开展是受多因素影响的，其中成纤维细胞活化和聚 集是促进IPF发生开展的最直接的原因（Ref.）。肺泡上皮细胞受损后，肺组织启 动损伤修复机制，成纤维细胞被激活并聚集到肺间质，病理状态下过度修复进而 引起肺组织结构破坏，造成呼吸困难（Ref.）。这些过多的成纤维细胞主要来自于: 肺泡上皮细胞间充质细胞转化（Epithelial-MesenchymalTransition, EMT）；血液 中成纤维细胞的招募；以及肺组织内源性间质干细胞的分化。进而成纤维细胞可 以通过进一步活化成为具有更强促组织现为变形能力的肌成纤维母细胞（Ref.）。
与健康人肺成纤维细胞相比，IPF患者肺成纤维细胞高度活化，表现为增殖 加快、ECM分泌增多、细胞运动能力增强（Ref.）；活化的成纤维细胞进一步损 伤肺跑上皮细胞并诱发其凋亡，进而会诱导更多的成纤维细胞活化和聚集，促进 IPF的发生开展（Ref.）。因此，深入探究在IPF过程中促进肺成纤维细胞活化的 分子机制，有利于加深对肺纤维化发病机制的了解，进而发现成纤维细胞为靶向 的治疗方法。
基于以上研究，在后期实验中我们将探明tPA信号通路在IPF发生开展过程 中对肺成纤维细胞活化作用的分子机制，尝试采用Wnt/p-catenin信号通路与tPA 信号通路联合抑制，降低肺成纤维细胞中Wnt/p-catenin信号通路的活性，抑制 成纤维细胞的活化，从而干预肺纤维化的发生开展。
综上所述，我们提出以下假说，即：在特定的病理条件下，tPA与肺成纤维 细胞上受体LRP-1结合，激活tPA信号通路，促进GSK-39磷酸化，造成细胞 质内p-catenin的积累，进而过度激活Wnt/0-catenin信号通路，促使肺成纤维 细胞活化，加速纤维灶的形成，促进纤维化的发生开展。运用LRP-1受体缺失 的MEF-1成纤维细胞系，体外探究同时抑制tPA信号通路以及Wnt/p-catenin 信号通路对成纤维细胞活化的分子机制。进而采用tPA敲除小鼠，构建博来霉 素诱导IPF动物模型，在肺纤维化发生开展过程中，同时抑制tPA信号通路以 及Wnt/0-catenin信号通路，能够抑制成纤维细胞的活化，进而抑制肺纤维化的 发生开展。
为了验证以上假说，本研究将在前期工作基础上，开展以下研究：
1.证明在IPF发生开展过程中，tPA信号通路以及Wnt/p-catenin信号通路过度 激活。
(1)在博来霉素诱导的C57B/L6小鼠模型中，通过IHC, WB检测tPA信号 通路关键蛋白tPA, LRP-1, Erk的表达，证明在IPF发生开展过程中tPA 信号通路处于高表达激活状态。
(2)取IPF模型小鼠谀组织进行消化，别离纯化体外培养小鼠肺成纤维细胞。 同时采用流式细胞仪技术检测成纤维细胞与肌成纤维母细胞在IPF发生 开展过程中数量的变化。
(3)在IPF模型中，通过IHC, WB, IF检测Wnt/p-catenin信号通路关键蛋 白 P-catenin、GSK-30、Pif-catenin、Pi-GSK-3P 的表达，以及下游基因 cyclin, mmp-9的表达。证明在IPF发生开展过程中，Wnt/p-catenin信 号通路处于高表达激活状态。
2 .证明tPA信号通路以及Wnt/p-catenin信号通路参与了肺成纤维细胞的活化。
(1)别离纯化、体外培养小鼠原代肺成纤维细胞，采用TGF-p作为诱导剂, 诱导其向肌成纤维母细胞分化，通过WB, IF检测活化过程中肌成纤维 母细胞特异性蛋白Collagen、a-SMA的表达。确认TGF-。能够诱导肺成 纤维细胞的活化。
(2)通过WB, IF检测，肺成纤维细胞活化过程中，tPA信号通路关键蛋白 tPA, LRP-1, Erk的表达；以及 Wnt/p-catenin信号通路关键蛋白p-catenin> GSK-3。、Pi-p-catenin> Pi-GSK-3P的表达。证明在肺成纤维细胞活化过 程中，tPA信号通路以及Wnt/p-catenin信号通路处于高表达激活状态。
3 .证明激活Wnt/p-catenin信号通路能够促进肺成纤维细胞的活化。
(1)采用Wnt/p-catenin信号通路激活剂Wnt3a处理原代小鼠肺成纤维细胞, 检测肺成纤维细胞增殖、凋亡、活化、ROS释放，以及迁移能力。
⑵ 采用DKK-1,小分子抑制齐I」，Gil阻断剂等，多点位抑制Wnt/p-catenin
信号通路检测肺成纤维细胞增殖、凋亡、活化、ROS释放，以及迁移能 力。
4 .证明tPA信号通路能够通过Wnt/p-catenin信号通路促进成纤维细胞的活化。
(1)采用不同浓度tPA (5nM、10nM、20nM)处理小鼠原代肺成纤维细胞， 通过CCK-8、MTT法检测细胞活力。
(2)选择适当浓度tPA处理小鼠原代肺成纤维细胞，分别检测细胞增殖、凋 亡、活化、ROS释放，以及迁移能力。
(3)检测tPA信号通路激活过程中，小鼠原代肺成纤维细胞内Wntp-catenin 信号通路关键蛋白 p-catenin、GSK-3B、Pi-B-catenin、Pi-GSK-3p 的表达， 以及下游基因cyclin, mmp-9的表达。
(4)在激活tPA信号通路过程中，采用tPA信号通路抑制剂，检测小鼠原代 肺成纤维细胞增殖、凋亡、活化、ROS释放，以及迁移能力。
5 .证明阻断tPA信号通路并抑制Wnt/|3-catenin信号通路能够抑制肺成纤维细胞 的活化。
(1)采用Wnt/p-catenin信号通路激活剂Wnt3a处理LRP-1受体缺失的成纤 维细胞系MEF-1,检测肺成纤维细胞增殖、凋亡、活化、ROS释放，以 及迁移能力。
(2)采用MEF-1成纤维细胞系，通过DKK-1,小分子抑制齐(J, Gil阻断剂等， 多点位抑制Wnt/p-catenin信号通路检测肺成纤维细胞增殖、凋亡、活化、 ROS释放，以及迁移能力。
6 .证明阻断tPA信号通路并抑制Wnt/p-catenin信号通路能够有效干预IPF的发 生开展。
(1)采用博来霉素诱导tPA“敲除小鼠建立IPF模型，野生型C57作为对照 组，检测小鼠生存率、肺组织病理学检测、血气分析、肺功能鉴定。
(2)给予IPF模型数Wnt/p-catenin信号通路抑制剂,DKK-1,小分子抑制剂， Gil阻断剂等，多点位抑制Wnt/B-catenin信号通路的激活，检测小鼠生存率、肺组织病理学检测、血气分析、肺功能鉴定。
研究目标：
1 .确认在IPF发生开展过程中，tPA信号通路以及Wnt/0-catenin信号通路的过 度激活，能够促进肺成纤维细胞的活化。
2 .探究tPA信号通路以及Wnt/p-catenin信号通路促进肺成纤维细胞活化的分子 机制。
3 .阻断tPA信号通路并抑制Wnt/p-catenin信号通路能够抑制肺成纤维细胞的 活化。
4 .阻断tPA信号通路并抑制Wnt/p-catenin信号通路能够有效干预IPF的发生发 展。