重组质粒的构建(ppt版).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,重组质粒的构建,sunyat,基因克隆,gene cloning,应用酶学的方法，在体外将,目的基因,与,载体,DNA,结合成一具有自我复制能力的,DNA,分子（,重组体,），继而通过转化或转染宿主细菌或细胞、筛选出含有目的基因的转化子细菌或细胞，再进行扩增、提取获得大量同一,DNA,分子拷贝,。,核心技术：,DNA,重组技术,（,recombinant DNA technique,）,基因克隆的基本程序：,分,切,接,转,筛,PCR,酶切 连接 转化,&,转染 抗性或标记筛选,目的基因,DNA,片段的获得,外源,DNA,分子与载体,DNA,分子的体外重组,重组,DNA,分子转移到适当的受体菌或细胞,重组,DNA,分子克隆的筛选和鉴定,目的基因或其表达产物的纯化和鉴定,基因克隆技术的特点：,1.,可在体外人工的,有目的的,根据需要进行基因的重组、表达、测序、诱变、修复；,2.,方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。,基因克隆示意图,胰岛素,人生长激素,干扰素,白细胞介素,2,粒细胞集落刺激因子,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,红细胞生成素,EPO,组织纤溶酶原激活剂,生长激素,促生长素,抗血友病因子,脱氧核糖核酸酶,葡糖脑苷脂酶,鼠单克隆抗体,例：,干扰素是治疗癌症的重要物质，人血液中每升只能提取,0.05g,干扰素，因而其价格昂贵。但美国有一家公司用遗传工程方法合成了价格低廉、药性一样的干扰素，其具体做法是：,从人的淋巴细胞中提取能指导干扰素合成的基因，并使之与一种叫做质粒的,DNA,结合，然后移植到酵母菌内，从而用酵母菌来产生干扰素。,酵母菌能用出芽方式繁殖，速度很快，所以，能在较短的时间内大量生产干扰素。利用这种方法不仅产量高，并且成本也较低,。,DNA,重组操作过程,载体,外源,DNA,片段,外源,DNA,插入,剪切,引入宿主细胞,a,b,b,A,重组,A,b,抗性筛选,重组筛选,重组质粒构建：,目的,DNA,的,PCR,扩增,DNA,片段和载体的,酶切,片段,DNA,与载体的,连接,载体：,plasmid,（,primary,）,工具酶：限制性内切酶,连接酶,常见的基因工程载体,载体：,用于携带重组,DNA,，并且能够使外源,DNA,一起复制与表达的运载工具。,根据来源：,plasmid;phage;viral;BAC;YAC,根据用途分：克隆载体；原核生物表达载体；真核生物表达载体,根据与宿主的关系分：整合性载体、非整合性载体,基因工程中用得最多的是,plasmid,载体。下面介绍几种常见的载体。,载体的基本结构单元：,1.,复制起点,2.,克隆位点,3.,筛选标记,其他条件：,4.,适当大小,5.,易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。,质粒,(Plasmid),质粒是独立于宿主细胞（如细菌）染色体之外的可进行复制和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋,DNA,分子,。是一种环状的双链,DNA,分子，大小从,1K-200Kb,。,通常质粒含有某些染色体没有的基因，负责编码某些功能蛋白，这些功能并不是细菌生存所必需的，但在一定环境下，可对细菌宿主的生存有利。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性（,R,因子）、产生抗生素、降解复杂有机化合物、产生大肠杆菌素（大肠杆菌素因子,col）、,肠毒素及限制酶、修饰酶等。,质粒存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。,质粒,DNA,的特征,质粒复制依赖宿主细胞的复制机器，但可以独立复制。,（单拷贝或多拷贝：紧密型质粒和松弛型质粒）,严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；,松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有,10-200,份拷贝,不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。,质粒,DNA,所编码的基因产物赋予细菌某些性状特征。,质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质，可以在细菌间转移与丢失。,质粒可自行失去或经人工处理而消失,可有几种质粒同时共存在于一个细菌内，但同群质粒有不相容性（同群质粒具有同源性，可以产生相同的阻遏蛋白，故彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞）,（四）人工构建质粒的基本元件,启始复制子：使质粒在宿主细胞中能够复制,抗性基因：用于筛选阳性克隆。,多克隆位点：插入外源基因。,对于表达载体还需要启动子、多聚,A,尾等,.,易于操作：包括宿主、转化（或转染）、分离纯化、重组等等。,pBR322 plasmid,是一个克隆载体，作为一个克隆载体最基本的要求都具备：,复制起点,:Ori,克隆位点,:EcoR I;Hind III;Bam HI;Sal I,筛选标记,:Amp,r,。,T-vector PCR,产物亚克隆载体,T,Vector,是一种高效克隆,PCR,产物,(TA Cloning),的专用载体，由,pUC18,载体改建而成的。在,pUC18,载体的多克隆位点处的,Xba,I,和,Sal,I,识别位点之间插入了,Eco,R V,识别位点，用,Eco,R V,进行酶切反应后，再在两侧的,3,端添加,“,T,”,而成。因大部分耐热性,DNA,聚合酶反应时都有在,PCR,产物的,3,末端添加一个,“,A,”,的特性,所以用本制品可大大提高,PCR,产物的连接、克隆效率。,T-vector,克隆,PCR,产物时用高效连接液,Ligation Solution I,可以在极短的时间内,(30,分钟,1,小时,),完成连接反应，大大地方便了实验操作。,用途,克隆,PCR,产物。,对克隆后的,PCR,产物使用,M13 primers,进行,DNA,测序。,原核生物表达载体,Bacterial expression vector,复制起点,克隆位点,筛选标记,启动子,转录终止序列,核糖体结和位点：起始密码子,ATG,和,SD,序列（翻译识别）,原核生物表达载体的基本结构单元包括：,真核生物表达载体,（,mammalian expression vector),真核生物表达载体的结构单元,复制起点（真核和原核）,克隆位点,筛选标记,(,原核和真核标记）,增强子,/,启动子,PolyA,终止信号,Location of Features,PCMV IE:,CMV IE enhancer:1-659 CMV IE promoter:669-750,Intervening sequence(IVS):890-1022,T7 RNA polymerase promoter:1067-1085,Multiple cloning site:1085-1137,T3 RNA polymerase promoter:1158-1137,SV40 fragment containing polyadenylation signal:1167-1388,f1 origin of replication:1483-1938,EGFP expression cassette:2002-3455,SV40 enhancer/early promoter:2002-2420 EGFP structural gene:2449-3168 Kozak consensus translation initiation site:2442-2452 Start codon(ATG):2449-2451;Stop codon:3166-3168 Insertion of Val at position 2:2452-2454 GFPmut1 chromophore mutations(Phe-64 to Leu;Ser-65 to Thr):2731-2735 His-231 to Leu mutation(A-T):3143 Bovine growth hormone(BGH)gene fragment containing polyadenylation signal:3182-3455,SV40 origin of replication:2318,Ampicillin resistance(b-lactamase)gene:3449-4709,Start codon(ATG):3849-3451 Stop codon(TAA):4707-4709,噬菌体载体,噬菌体,(phage),外源,DNA,：,923kb,常用：,EMBL,系列、,gt,系列、,charon,系列,粘性质粒,(cosmid),：,DNA,的,cos,区,+,质粒，双链环状,DNA,，克隆容量：,4050kb,M13,噬菌体,噬菌体,(phage),特点：一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型为双链线状,DNA,分子，长度,48.5kb,分子两端各有一个,12bp,组成的粘性末端,感染大肠杆菌后,线状,DNA,通过粘性末端互补连接成环,连接处称,COS,位点。,1.,本身有复制体系,;,2.,中间,(J-N,间,),是,生长非必需区,可被其它外源,DNA,取代,;,3.DNA,在体外可包装成病毒颗粒,感染效率高,;,4.,载体容量大,可装入大片段外源,DNA,(20kb),;,5.,可人工加入多克隆位点,;,6.,筛选容易,噬菌斑筛选,;,7.,主要用于,DNA,文库构建,.,插入型载体,含单一的限制性酶切位点，可接受,10kb,以下的外源片段，可用于,cDNA,文库构建；,取代型载体,含某一限制性酶的两个切点，可接受,20kb,左右的外源片段，可用于基因组,DNA,文库构建。,粘性质粒,(cosmid),是一种人工改造的载体,双链环状,DNA,，含有,DNA,的,cos,区,+,质粒，克隆容量：,40 50kb 1.,-DNA,的,COS,位点,;2.,质粒的复制起点和抗药性标记,(,Amp,r,);3.,多种单一的酶切位点,.,cosmid,较小,约,4,6kb,可容纳,40-45kb,的外源,DNA,由于,噬菌体,DNA,包装时包装蛋白识别的只是,DNA,粘性末端附近的一小段顺序，因此只要一个质粒接上此粘性末端顺序，再加上外源,DNA,片段使其长度为野生型,DNA,大小的75105%，重组体可象噬菌体一样进行外壳装配,形成噬菌体颗粒,感染大肠杆菌效率比质粒高得多,进入宿主细胞后,只能象质粒一样扩增,并依赖抗药性被筛选,.,优缺点,:1.,克隆效率高,;2.,可利用质粒,DNA,的方式扩增,;3.,可克隆较大,DNA,片段,;,主要用于真核基因的克隆,基因组文库构建,4.,缺点,:,产生串联现象。,M13,噬菌体 一种丝状单链噬菌体，闭环正链,ssDNA,，全长,6.5kb,感染大肠杆菌后,ssDNA,转变为,dsDNA,可用作克隆载体,.,最大优点：产生单链,DNA,可制备单链,DNA,探针,.,构建基因文库的克隆载体,粘粒,(Cosmid),细菌人工染色体,(BAC),酵母人工染色体,(YAC),P1,噬菌体人工染色体,(PAC),P1,及,YAC,载体,酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达,200kb-1000kb,，含有酵母第,4,号染色体的着丝粒和自主复制序列,CEN4,、,ARS1,，作为端粒的,Tel,序列，选择性标志,URA3,、,TRP1,和,SUP4,，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组,DNA,文库构建。,一个典型的,YAC,系列载体,病毒载体,DNA,病毒在细胞中具有较高的拷贝数，并有较强的启动子，因而是基因工程载体的理想候选者。诸如：,SV40,（猴肾病毒）,Epstein-Barr,病毒(,EBV,病毒),牛乳头瘤病毒（,BPV）,昆虫杆状病毒（,baculovirus),由于存在容量小、宿主范围小等缺陷，天然,SV40,病毒作为载体很少被使用，多数载体为带有来自,SV40,中转录元件的质粒型载体,SV40,增强子、启动子和复制子，可以在哺乳动物细胞中产生高效的组成型表达。,SV40 polyA,信号，可以对转录产物进行加工，稳定转录产物的活性。,Zeocin,抗性基因，可作为大肠杆菌及哺乳动物细胞的选择标记。,Zeocin,抗性基因在大肠杆菌中的合成由,EM-7,启动子控制，在哺乳动物细胞中的表达由,CMV,启动子控制，既可用于瞬时表达，也可用于筛选稳定表达的细胞系。,f1,复制子，可产生单链,DNA。,ColE1,复制起始位点，使质粒可在大肠杆菌中复制扩增。,EB,病毒,EB,病毒,Epstein-Barr,病毒(,EBV,病毒)是人类疱疹病毒,可转化人的,B,淋巴细胞，在转化细胞中以染色体外附加体形式存在。,EBV,病毒的顺式作用因子,oriP,可以在带有,EBV DNA,并表达具有反式作用的,EBNA1,抗原的贴壁细胞中维持附加体,DNA,分子的存在，因而能作为构建表达载体的元件，该类载体也主要用于建立带有多拷贝外源基因的细胞系。可在多种细胞中表达，可表达基因组,DNA,和,cDNA,可为表达细胞系。,Comparison of,different cloning vectors,Vector type Length of cloned DNA,Plasmid 20 kb,Phage,25 kb,Cosmid 45 kb,P1 vector 100 kb,BAC 100 Kb,(bacterial artificial chromosome),YAC 1,000 kb,(yeast artificial chromosome),DNA,重组操作过程,载体,外源,DNA,片段,外源,DNA,插入,剪切,引入宿主细胞,a,b,b,A,重组,A,b,抗性筛选,重组筛选,一把特殊的剪刀,限制性内切酶,30,多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制,-,修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种,“,限制,”,病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源,DNA,的限制性内切酶。这些酶可在特定位点切开,DNA,，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。,阿尔伯,(Arber),、史密斯,(Smith),和内森斯,(Nathans),，获,1978,年诺贝尔生理学和医学奖,限制性内切酶的特点：,限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如,Pvu,II,（,157,个氨基酸），也可以比,1250,个氨基酸的,Cje,I,更大,除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现,在已纯化分类的,3000,种限制性内切酶中，已发现了超过,250,种的特异识别序列。,限制性内切酶的命名,限制性内切酶命名的次序如下：,A,用,3,个字母代表来源的生物，如大肠杆菌,（,Escherichia coli,）用,Eco,表示，流感嗜血菌（,Haemophilus influenzae,）用,Hin,表示。,B 1,个字母或阿拉伯数字代表菌株（,EcoR,、,Hind,）,C 1,个罗马字母代表发现或鉴定的次序（,EcoRI,、,Hind III,）,限制性内切酶的分类,按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素限制性内切酶可划分为三大类：,I,型限制性内切酶,II,型限制性内切酶,III,型限制性内切酶,I,型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。其特点是识别位点和切割位点不一致，没有固定切割位点。它们在识别位点很远的地方任意切割,DNA,链，不产生确定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备实用性。,III,型限制性内切酶也是兼有限制,-,修饰两种功能的酶。虽然有特异切割位点，但它们在识别位点之外切开,DNA,链，很少能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。,II,型限制性内切酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开,DNA,链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三种,限制性内切酶中,唯一用于,DNA,分析和克隆的一类,。,II,型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。,II,型限制性内切酶中最普遍的是象,Hha,I,、,Hind,III,和,Not,I,这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。,大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到,DNA,上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到,DNA,上，识别非对称序列。,一些酶识别连续的序列（如,EcoR,I,识别,GAATTC,）；而另一些识别不连续的序列（如,Bgl,I,识别,GCCNNNNNGGC,）。,限制性内切酶的切割后产生一个,3,羟基端和一个,5,磷酸基团。它们的活性要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要,S-,甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在,200-300,个氨基酸左右。,一些概念,粘末端和平末端,同尾酶,同裂酶,同识异切酶,消化,星号活力,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：,钝性末端,(blunt end),粘性末端,(sticky end),同尾酶,有时两种酶切割序列,不完全相同,，但却能产生,相同的粘性末端,，这类酶被称为,同尾酶,，可以通过,DNA,连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。,如,Xba,(TCTAGA),、,Nhe,(GCTAGC,）、,Spe,(ACTAGT),切割的,DNA,序列不同，但均给出相同的,“,CTAG,”,粘性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的,4,核苷酸的酶切位点，即,Bfa,（,CTAG),的酶切位点。,有时两种限制性内切酶的识别,核苷酸顺序和切割位置都相同,，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如,Hpa,和,Msp,的识别顺序都是,5,CCGG,3,，如果其中有,5,-,甲基胞嘧啶，则只有,Hpa,能够切割。这些有相同切点的酶称为,同裂酶（同切酶或异源同工酶）,。,同裂酶,限制性内切酶在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。,星号活性的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。因此,尽量采用规范的实验步骤,应用推荐的反应条件。,星号活力,克隆（有时与甲基化酶联用）,鉴定（基因片断大小、正反向）,检测突变（识别位点，限制酶切图谱的多态性,RFLP,）,制作,Marker,限制性内切酶的应用,限制性内切酶的使用,一个标准的酶切反应包含：,DNA,合适的酶缓冲液,蛋白酶,为了提高酶切效率，可加入,BSA,。,1,、建立一个标准的酶切反应,通常，,10,个单位的内切酶可以切割,1g,不同来源和纯度的,DNA,。一个,50l,的反应体系中，,1l,的酶在,1X Buffer,终浓度及相应温度条件下反应,1,小时即可降解,1g,已纯化好的,DNA,。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过,16,小时）也可完全反应。,一般说来，线性,DNA,比超螺旋,DNA,更易消化。比如，酶切,1ug lambdaDNA,，需要,1-2,单位的酶，而酶切,1ug,质粒,DNA,，需要,3-5,单位的酶。,应用中的注意点,2.,选择正确的酶,不言而喻，选择的酶在底物,DNA,上必须至少有一个相应的识别位点。内切酶的产物可以是粘端的（,3,或,5,突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接,3,、加酶,内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。,4,、,DNA,待切割的,DNA,应当已去除酚、氯仿、乙醇、,EDTA,、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。,DNA,的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素,5,、缓冲液,对于每一种酶都提供相应的最佳缓冲液，可保证酶活性。使用时的缓冲液浓度应为,1X,。有的酶要求,100g/ml,的,BSA,以实现最佳活性。不需要,BSA,的酶如果加了,BSA,也不会受太大影响,6,、反应体积,内切酶活力单位的定义是：,1,小时内，,50l,反应体积中，降解,1g,的底物,DNA,所需的酶为一个活力单位。因此酶：,DNA,的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在,5%,以下，要注意酶的体积不要超过总体积的,10%,（一般酶都贮存于,50%,的甘油中）,7,、混合,这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！,8,、反应温度,大部分酶的反应温度为,37,；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为,50-65,不等,9,、反应时间,1,酶活单位的定义时间为,1,小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全,10,、终止反应,如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。我们使用如下反应终止液：,50%,的甘油，,50mM EDTA,（,pH8.0,），和,0.05%,溴酚蓝（,10l/50l,反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（,65,或,85,，,20,分钟）。热失活并不能适用于所有的酶。此外，酚,/,氯仿抽提也可以用于终止反应。,11,、贮存,大部分酶应贮存于,-20,。少部分酶则须在,-70,长期保存。,10X BUFFER,和,100X BSA,于,-20,保存。,BSA,不能与,Buffer,混合后保存，否则将会出现,BSA,沉淀,12,、稳定性,大部分酶在推荐的保存缓冲液里在,-20,条件下十分稳定。高于,-20,条件下稳定性将有所降低,13,、对照反应,如果发现,DNA,底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：,将不加内切酶的底物,DNA,（待切底物）与加入了内切酶的对照,DNA,（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物,DNA,降解，则说明,DNA,在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物,DNA,保持完整，而对照,DNA,被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照,DNA,和待切底物,DNA,混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、,EDTA,或酚），则混合物里的对照,DNA,也无法被切开,使用限制性内切酶的一般步骤,A,）测试酶切,DNA,的量,B,）计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于,8%,，计算能加的酶量，最多能加终体积的,10%,（甘油的浓度为,5%,）。,C,）,10X,反应液的体积应为终体积的,1/10,；,10X,反应液的体积不应小于酶的体积。,D,）加入计算好的,DNA,，,10X,反应液，酶。,加入水到终体积（,20-50 ul,），轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为,37,o,C,，但有例外。应查讯分析说明。,举例,质粒,DNA,（,2ug/ul,）,5 ul,10,X,反应液,5 ul,内切酶,2ul,dH,2,O 38 ul,总体积,50 ul,37,o,C,保温,2-3,小时。,应最后加酶。,提高限制性核酸内切酶对低纯度,DNA,制剂的反应效率，可采用的方法,增加限制性核酸内切酶的用量，平均每微克底物,DNA,可高达,10,个活性单位甚至更多些。,扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释。,延长酶催化反应的保温时间。,能否在一次反应中用很多的限制性内切酶？,可以，一般而言，甘油浓度超过,8%,对酶切有抑制。有些酶在高的甘油浓度中会产生星号活力。限制性内切酶提供在,50%,的甘油中，故,10 ul,反应体积中不应加入超过,1.6 ul,的酶。,6.,双酶切：,根据重组的需要，有时需要用双酶切（单酶切：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体），这样重组效果会更好。,双酶切时要先分析两种酶且的条件，根据两种酶切的缓冲液要求，有三种情况,兼 容 性,处 理,完全兼容,同时加,2,种酶进行酶切,完全不兼容,先用一种酶切，沉淀洗盐，再用另一种酶切,相对兼容,（其中一种酶活性相对较低）,同时加,2,种酶进行酶切,只是盐离子浓度不同,先用低离子要求的酶切，再补加酶和盐。,7.,载体的酶切：,酶切条件与外源,DNA,没有区别。载体多位环状,DNA,如果只有一个酶切位点，用单酶切。目前商业化载体均有多克隆位点，含有多个酶切位点，可以进行多种选择和取舍。,酶切产物回收,离心柱回收纯化酶切产物,DNA,片段,纯化问题：纯化,PCR,产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，,PCR,产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。,数据库,限制性内切酶的数据库,TAKARA Fermentas,连接酶（,ligase),主要有两种：,T4,噬菌体,DNA,连接酶和大肠杆菌,DNA,连接酶。催化相邻,DNA,链的,5,-P,和,3,-OH,末端以磷酸二酯键结合。,E.coli,DNA,连接酶催化,DNA,分子连接的机理与,T4,噬菌体,DNA,连接酶基本相同，只是辅助因子不是,ATP,而是,NAD,+,。,T4,噬菌体,DNA,连接酶还有一种,E.coli DNA,连接酶没有的特性即将两个平末端的双链,DNA,分子连接起来的功能。对于这种连接反应的机理目前还不清楚，总的来说这种连接的效率比粘性末端的连接效率要低得多，可能是因为平末端,DNA,分子无法形成类似粘性末端分子那样的相对稳定的结构。,Weiss,单位（,Weiss,等,1968,），是指在,37,o,C,下,20,分钟内催化,1nM,32,P,从焦磷酸根置换到,-,32,P ATP,所需酶量；,（,NEB,公司，粘性末端）将,1,g,由,Hind,III,酶解的,DNA,的,12,碱基对粘性末端在,16,0,C,条件下、,30,分钟、,20,l,反应体系中连接,50,时所需酶量。,(Takara,公司,),在,20,l,的反应体系中，,6,g,的,DNA-,Hind,III,的分解物在,16,0,C,反应,30,分钟时，有,90,以上的,DNA,片段进行连接的酶的活性为,1U,。相当于,ATP-Ppi,交换反应中,0.008 Weiss U,。,对于,T4-,噬菌体,DNA,连接酶的活性测定至少有三种以上的方法：,DNA,重组,连接,DNA,的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。,相同末端：直接将外源,DNA,和载体片段加在一起，进行连接；,不同末端：需要将外源,DNA,和载体,DNA,的末端调整成一致。多数情况是变成平末端，这可通过,DNA,酶降解，或,DNA,聚合酶不平的方式解决。,单酶切：由于只有一种酶切，载体片段很容易相互粘连，形成空载体，通常用去磷酸化的方法以避免。对于表达载体构建时，还需识别其方向。,双酶切：直接连接，并且方向是确定的，所以选择这一方案时，要考虑其方向性。,连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是,37,，此时连接酶的活性最高。但,37,时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即,1216,。,DNA,的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。,一般外源片段较载体摩尔浓度高，,5,：,1,。有的加入聚乙二醇。可使反应速度加快。,连接反应：,H2O,补充使总体,10ul,ATP,（含在,buffer,中）,10XBuffer 1ul,外源,DNA 1ul,载体,DNA 3-4ul,T4DNA,连接酶,1ul,外源基因与载体的连接,粘性末端连接,