DB33∕T 2465-2022 蓝莓组培苗生产技术规程(浙江省).pdf

33 浙江省地方标准 DB33/T 24652022 蓝莓组培苗生产技术规程 Technical regulation for tissue culture plantlets production of blueberry 2022 -03 -25 发布 2022-04 -25 实施 浙江省市场监督管理局 发 布 ICS 67.080 CCS B 31 DB33/T 24652022 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由浙江省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由浙江省种植业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江省农业科学院、诸暨市经济特产站。 本标准主要起草人：张慧琴、周慧芬、柏德玟、古咸彬、张祖鹏、谢鸣、陆玲鸿、陈华江、任军凯。 DB33/T 24652022 1 蓝莓组培苗生产技术规程 1 范围 本标准规定了蓝莓组培苗生产的设施设备、外植体选取、培养基配制、外植体接种、组培苗培养、包装、标志、运输等内容。 本标准适用于兔眼类、高丛类蓝莓的组培苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过规范性文件的引用而构成本标准必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本标准； 不注日期的引用文件， 其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。 GB/T 8321.10 农药合理使用准则(十) GB 15569 农业植物调运检疫规程 DB33/T 179.2 林业育苗技术规程 第2部分：林业容器育苗 DB33/T 752 植物种苗组培快繁技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 外植体 explant 用于无菌培养的植物活体，包括完整植株、胚胎或从植物上切取的器官、组织等一切材料。 3.2 初代培养 primary culture 将灭菌后的外植体接种在无菌培养基中进行的第一代培养。 3.3 继代培养 subculture 初代培养获得的材料在继代培养基中不断长出新的芽或新的组培苗的培养过程。 3.4 组培穴盘苗 tissue culture hole dish plantlets 移栽在穴盘中经过一段时间培育后的组培生根苗。 3.5 组培容器苗 tissue culture container plantlets 从穴盘移栽至容器进一步培育的苗。 4 设施设备要求 DB33/T 24652022 2 拥有交通方便、环境清洁、空气干燥的实验室，主要包括，化学实验室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室等；生产所需的生产设备，主要包括高压蒸汽灭菌器、超净工作台、电子天平、解剖镜、空调、培养架、加温器、培养瓶等，以及各类化学试剂；有可供品种试验的试验地、组培苗驯化区、组培苗移栽大棚。组培苗生产所需基本设施设备要求见附录A。 5 外植体的选取 5.1 时间 取材宜选择蓝莓两次生长高峰时期，在温暖、晴朗的天气取材，避免在冬季低温阴雨天气取材。 5.2 取材 从具有品种典型性状的健康植株上选择长势旺盛、健壮的半木质化枝条，取带芽茎段作为外植体，未能及时接种的茎段可保湿贮藏在4 冰箱中，所取的茎段应在3天内完成接种。 6 培养基的配制 6.1 母液的配制 6.1.1 基本培养基 WPM 的母液配制 采用木本植物用培养基（woody plant medium，WPM）作为基本培养基，将其中所含的化学成份按大量元素、 钙盐、 铁盐、 微量元素、有机物等五大类分别用蒸馏水溶解后配制成质量比为110、110、11 000、1100、1100的母液，装入广口瓶后置于4 冰箱保存。 6.1.2 生长激素的配制 将生产所需的玉米素(zeatin，ZT)、萘乙酸(1-naphtahaleneacetin acid，NAA)、吲哚丁酸(indole-3-butyric，IBA)用1摩尔/升盐酸或95 %酒精溶解，再用蒸馏水稀释后分别配制成200毫克/升的母液，装入广口瓶中，置于4 冰箱保存。 以上所用药品均为分析纯级别。 6.2 培养基的配制 6.2.1 琼脂融化 按所需容量的70 %加去离子水，再加入0.7 %的琼脂，加热搅拌融化琼脂。 6.2.2 糖溶解 琼脂融化后，加入3 %蔗糖或食用蔗糖，稍加热使其溶解。 6.2.3 加母液 糖溶解后，按培养基的配方及所需数量，依次加入基本培养基WPM的大量元素、钙盐、微量元素、铁盐、有机物及生长激素母液，并充分搅拌。 6.2.4 定容 搅拌均匀后，加去离子水至所需体积。 6.2.5 pH 值测定 DB33/T 24652022 3 充分搅拌后，用pH计或pH试纸测pH值，用0.1摩尔/升的盐酸或0.1摩尔/升的氢氧化钠调节pH至5.20.1。 6.2.6 分装 根据不同需要定量分装，如250毫升的培养瓶，每升分装25瓶30瓶，每瓶分装33毫升40毫升。分装时勿将培养基沾到瓶口。 6.2.7 封口 盖好瓶盖，或用封口膜封口，扎绳需紧。 6.2.8 灭菌 灭菌操作按DB33/T 752规定执行。 6.2.9 贮存 灭菌后培养基贮存按DB33/T 752规定执行。 7 外植体的接种 7.1 预处理 将外植体去除所有叶片，自来水冲洗干净，切取第310节茎段，在流水下冲洗30分钟60分钟。 7.2 灭菌 在超净工作台上将外植体置于70 %乙醇中30秒，再用0.5 %新洁尔灭消毒10分钟，后放于0.1 %升汞中处理6分钟8分钟，轻摇，灭菌结束后倒出灭菌液，用无菌水冲洗3次5次后备用。 7.3 接种 在超净工作台上将已灭菌的茎段置于无菌垫纸上， 用已灭菌的剪刀、 镊子将外植体切成长0.5厘米1.0厘米带腋芽茎段，接种于准备好的诱导培养基中。基部切口插入培养基内。 8 培养 8.1 初代培养 8.1.1 培养基配方 WPM2.0毫克/升3.0毫克/升玉米素30克/升蔗糖7克/升琼脂，pH值为5.20.1。 8.1.2 培养方法 培养温度25 2 ，光照时间12小时/天16小时/天，光照强度1 500勒克斯2 000勒克斯，培养20天30天，诱导出幼芽。 8.2 继代培养 8.2.1 培养基配方 DB33/T 24652022 4 WPM1.0毫克/升1.5毫克/升玉米素0.01毫克/升0.03毫克/升萘乙酸30克/升蔗糖7克/升琼脂，pH值为5.20.1。 8.2.2 培养方法 培养温度25 2 ，光照时间12小时/天16小时/天，光照强度3 000勒克斯4 000勒克斯。剪取丛生苗，剪成1.0厘米1.5厘米茎段，插入继代培养基内。每20天30天继代增殖1次。继代次数宜控制在10代以内，不超过15代。 8.2.3 无根瓶苗培养 WPM0.01毫克/升萘乙酸30克/升蔗糖7克/升琼脂，pH值为5.20.1。剪取丛生苗，插入培养基内。在相同条件下培养20天30天，培养成株高3厘米5厘米的无根壮苗，其质量指标见表B.1。 8.3 穴盘苗培育 8.3.1 生根培养 将无根壮苗蘸取0.5毫克/升吲哚丁酸0.5毫克/升萘乙酸的生根剂后插入穴盘基质中，基质为苔藓，或泥炭土、珍珠岩和蛭石等体积混合基质。30天40天长出完整根系。培养温度为15 28 ，前10天相对湿度控制在80 %90 %、 光照强度3 000勒克斯5 000勒克斯； 此后相对湿度控制在60 %80 %、光照强度5 000勒克斯10 000勒克斯。 8.3.2 管理 30天后可用喷淋浇水。抽生2片新叶后，可每隔10天15天叶面喷施1次0.1 %复合肥（15-15-15）。经常检查新叶的生长情况，保持通风。农药品种、使用次数和安全间隔期应按GB/T 8321.10要求执行。 8.3.3 质量指标 见表B.2。 8.4 容器苗培育 8.4.1 栽培管理 将生长健壮的穴盘苗移入到直径为10厘米12厘米的容器中， 可采用泥炭土、 蛭石和珍珠岩体积比为532的混合基质。其他管理参照DB33/T 179.2。 8.4.2 出圃 符合出圃规格的苗于9月至次年3月期间均可出圃，出圃规格见表B.3。 9 包装、标志、检疫、运输 9.1 包装 9.1.1 瓶苗包装 瓶苗放入泡沫箱或周转箱，箱外再用纸箱包装。 9.1.2 穴盘苗包装 DB33/T 24652022 5 穴盆装在相应规格的纸板箱内。 9.1.3 容器苗包装 将容器苗按数量装入相应规格的纸板箱内。 9.2 标志 每箱应贴上标签，注明品种、等级、数量、产地、出苗日期等。 9.3 检疫 参照GB 15569要求执行。 9.4 运输 装车时切勿倒置，用有蓬车辆运输以避免日晒、雨淋，瓶苗、生根组培苗在高温和严寒季节运输时选择冷藏车，运输途中温度保持20 25 ，60 %80 %的相对湿度，5天内到达目的地。 10 生产档案 生产过程中投入品使用、自然灾害、重大技术措施及产品进出库等记录存档，保存时间不少于2年。 11 模式图 蓝莓组培苗标准化生产技术模式图参见附录C。 DB33/T 24652022 6 附 录 A （资料性） 蓝莓组培苗生产所需设施及仪器设备 表A.1表A.2给出了蓝莓组培苗生产所需设施及仪器设备。 表A.1给出了蓝莓组培苗生产所需基本配套设施。 表 A.1 基本配套设施 序号 设施名称 设施要求 1 组培车间 自动检测和喷淋的消防系统 1.1 洗涤室 通风、干燥，室内要有上、下水设施，地面防潮防滑并便于清洗，大水槽若干。 1.2 培养瓶晾干室 通风、干燥、整洁，内装空调和通风装置。 1.3 药品室 (称量室) 清洁、干燥、通风，能终年保持相对较低的温度，避免阳光直照；放置天平的实验台要平整稳固。 1.4 培养基配制室 通风、干燥，配备大容量用电专用线路，上下水道畅通。 1.5 培养基灭菌室 地面与墙壁应能够忍受高湿状态，地面防滑、白瓷砖墙面，配备大容量用电线路等。 1.6 培养基储存室 低温、干燥、整洁，避免光照，洁净度要高，配置空调、通风装置、紫外灯等。 1.7 更衣室 通风、干燥、整洁，避免光照，紧连接种室，配置衣柜、鞋柜、洗手盆等。 1.8 接种室 (无菌操作室) 控温 25 2 、控湿(相对湿度 75 %以下)、干净、整齐、通风、光线好，内墙白色光滑，配置空调、超净工作台等。 1.9 培养室 控温 25 2 、控湿(相对湿度 70 %75 %)、干净、整洁、光线好，内墙白色光滑，配置空调、通风装置、日光灯、培养架、自动控光设备等。洁净度要高。设置专线和配电设备。 1.10 出苗室 控温、干净、通风、光线好，内墙白色光滑，上下水道畅通。 1.11 贮物室 通风、干燥，贮存组培用的洗涤用品等低值品耗、以及存放无菌水、酒精等。 2 温室或大棚 控温、控湿、控光、防虫，适当遮阳。 3 组培苗移栽圃 控温、控湿、控光、防虫，能采用自然光照。 4 辅助用房 包括控制间、物料间、包装间等。 5 办公生活区 5.1 办公室 办公桌、电话、传真机、电脑、打印机等办公设备。 5.2 工作人员室 洗手盆、急救箱、储物柜等，可加装饮水机、冰箱、微波炉、休息台凳等。 5.3 其它生活空间 包括洗手间、楼道等。 DB33/T 24652022 7 表A.2给出了组培苗生产所需仪器设备。 表 A.2 所需的仪器设备 序号 仪器设备名称 用途说明 1 高压灭菌器 培养基灭菌 2 电热干燥箱 玻璃器皿干燥 3 紫外灯 房间消毒 4 臭氧机 房间消毒 5 超净工作台 组培接种用 6 接种器具电热杀菌器 组培接种用 7 石英玻璃珠 杀菌器专用 8 枪状镊子 组培接种用 9 手术刀柄 组培接种用 10 刀片 组培接种用 11 剪刀 组培接种用 12 器具搁置架 组培接种用 13 切割碟子 组培接种用 14 光照培养箱 组培试验用 15 调速振荡器 组培培养用 16 空调 培养室控温 17 培养架(包括日光灯) 放置培养瓶 18 放置培养瓶晾瓶架 培养瓶存放 19 组培专用托盘 放置培养瓶 20 培养瓶 组培用瓶 21 试管 初代培养用 DB33/T 24652022 8 附 录 B （资料性） 育苗质量指标 B.1 无根瓶苗质量指标 无根瓶苗质量指标见表B.1。 表 B.1 无根瓶苗质量指标 项目 要求 其他 苗高 苗高适中，3 厘米。 苗有活力、粗壮、挺直，叶片大小协调、色泽正常，具原品种特性，无玻璃化；培养基无污染。 叶片数 具有适宜和正常的叶片数，5 片。 整齐度 90 %以上的苗达到上述要求。 B.2 穴盘苗质量指标 穴盘苗质量指标见表B.2。 表 B.2 穴盘苗质量指标 项目 要求 其他 根系 具有完整而发达的根系，形成根团。 苗健壮、挺拔和新鲜，形态完整、叶片大小协调，叶色具原品种特性、有光泽。 苗高 苗壮实，高度 8 厘米10 厘米。 整齐度 90 %以上的苗达到上述要求。 病虫害 无检疫性病虫害。 B.3 容器苗出圃规格 容器苗出圃规格见表B.3。 表 B.3 容器苗出圃规格 项目 级别 其他要求 1 级 2 级 苗高 40 厘米 30 厘米 a)品种纯正； b)生长健壮，芽饱满； c)无检疫性病虫； d)根系发达，分布均匀，布满容器。 分枝数 3 个5 个 2 个3 个 DB33/T 24652022 9 附 录 C （资料性） 蓝莓组培苗标准化生产技术模式图 蓝莓组培苗标准化生产技术模式图见图C.1。 主要流程 外植体选取 培养基配置 外植体接种 初代培养 继代培养 无根瓶苗培养 穴盘苗培育 容器苗培育 包装、运输、出售 操作要点 从具有品种典型性状的健康植株上选择长势旺盛、健壮的半木质化枝条，取带芽茎段作为外植体。 基本培养基 WPM、生长激素按配方配制成母液，置于4 冰箱保存；按配方配制各类培养基备用。 外植体经流水冲洗后在超净工作台上经乙醇，升汞灭菌处理，切成带腋芽茎段，接种至诱导培养基中。 在无菌条件下将外植体接入初代培养基中进行培养。外植体初代培养 20 天30 天后，可诱导出幼芽。 将丛生苗基部剪除，剪成 1厘米1.5 厘米茎段插入继代培养基内继代增殖培养。 剪取丛生芽到壮苗培养基中，培养 20 天30 天，培养成株高 3 厘米5 厘米的无根壮苗。 将无根壮苗蘸取生根剂后插入穴盘基质中， 基质为苔藓，或泥炭土、珍珠岩和蛭石等体积混合基质。 容器直径为 10 厘米12 厘米，可采用泥炭土、蛭石和珍珠岩体积比为 532 的混合基质。 瓶苗、 穴盘苗和容器苗装入相应规格包装箱内， 检疫， 贴上标签运输、 出售。 穴盘苗 管理要点 生根后穴盘苗相对湿度控制在60 %80 %、光照强度5 000勒克斯10 000勒克斯。30天后可用喷淋浇水。抽生2片新叶后，可每隔10天15天叶面喷施1次0.1 %复合肥（15-15-15）。经常检查新叶的生长情况，保持通风。农药品种、使用次数和安全间隔期应按GB/T 8321.10要求执行。 培养 培养基或基质配方 培养条件 改良 WPM 基本培养基母液配方 初代 培养 WPM2.0毫克/升3.0毫克/升玉米素30克/升蔗糖7克/升琼脂，pH 值为 5.20.1。 培养温度 25 2 ，光照时间 12 小时/天16 小时/天， 光照强度 1 500 勒克斯2 000 勒克斯。 大量元素(10 倍) MgSO47H2O 9.25 克/升 KH2PO4 4.25 克/升 (NH4)2SO4 10 克/升 K2SO4 22.5 克/升 穴盘苗 质量指标 苗健壮、挺拔和新鲜，形态完整、叶片大小协调，叶色具原品种特性、有光泽。具有完整而发达的根系，形成根团；苗壮实，苗高 8 厘米10 厘米；整齐度高，90 %以上的苗高达到上述要求；无检疫性病虫害。 继代 培养 WPM1.0毫克/升1.5毫克/升玉米素0.01毫克/升0.03毫克/升萘乙酸30 克/升蔗糖7克/升琼脂，pH 值为 5.20.1。 培养温度 25 2 ，光照时间 12 小时/天16 小时/天， 光照强度 3 000 勒克斯4 000 勒克斯。 微量元(100 倍) MnSO44H2O 2.25 克/升 ZnSO47H2O 0.86 克/升 H3BO3 0.62 克/升 Na2MoO42H2O 0.025 克/升 无根瓶苗培养 WPM0.01 毫克/升萘乙酸30克/升蔗糖7 克/升琼脂，pH 值为 5.20.1。 培养温度 25 2 ，光照时间 12 小时/天16 小时/天， 光照强度 3 000 勒克斯4 000 勒克斯。 CuSO45H2O 0.025 克/升 容器苗 管理要点 将生长健壮的穴盘苗移入到直径为 10 厘米12 厘米的容器中，可采用泥炭土、蛭石和珍珠岩体积比为 532的混合基质。其他管理参照 DB33/T 179.2。 符合出圃规格的苗于 9 月至次年 3 月期间均可出圃。 钙盐(10 倍) CaCl22H2O 4.84 克/升 Ca(NO3)24H2O 27.8 克/升 铁盐(1 000 倍) FeSO47H2O 2.78 克/升 生根 培养 生根剂： 0.5 毫克/升吲哚丁酸0.5 毫克/升萘乙酸； 基质：苔藓，或泥炭土、珍珠岩和蛭石等体积混合基质。 培养温度为 15 28 ， 相对湿度控制在 80 %90 %、光照强度3 000 勒克斯5 000 勒克斯。 Na2-EDTA 3.73 克/升 容器苗 出圃规格 品种纯正，生长健壮，芽饱满，无检疫性病虫，根系发达，分布均匀，布满营养钵，其中一级苗苗高40 厘米，分枝数有 3 个5 个；二级苗苗高30 厘米，分枝数有 2 个3 个。 有机物(100 倍) 盐酸硫胺素 0.1 克/升 盐酸吡哆素 0.1 克/升 烟酸 0.1 克/升 肌醇 10 克/升 甘氨酸 0.2 克/升 图 C.1 蓝莓组培苗标准化生产技术模式图 _