YY∕T 1805.2-2021 组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第2部分：I型胶原蛋白分子量检测-十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法[医药].pdf

ICS11.040.30CCSC30YY中华人民共和国医药行业标准YY/T1805.22021组织工程医疗器械产品胶原蛋白第2部分：I型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法TissueengineeringmedicaldeviceproductsCollagenproteinPart2:DeterminationofmolecularweightoftypeIcollagenSodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis2022-09-01实施2021-09-06发布国家药品监督管理局发布库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021次回前言in引言IV1范围2规 范 性 引 用 文 件3术 语 和 定 义4缩 略 语5原 理6试剂及其配制7仪 器 和 设 备8操 作 方 法9结 果1 0可 接 受 准 则222345库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021前言本文件按照GB/T1.1一2020标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件是YY/T1805组织工程医疗器械产品以下部分：胶原蛋白的第2部分。YY/T1805已经发布了第2部分：I型胶原蛋白分子ft检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。清注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由国家药品监督管理局提出。本文件由全国外科植入物和矫形器械标准化技术委员会组织工程医疗器械产品分技术委员会(SAC/TC110/SC3)归口。本文件起草单位：中国科学院过程工程研究所、四川省食品药品检验检测院、中国食品药品检定研究院。本文件主要起草人：张贵锋、刘兴兰、髙建萍、张乐、邢芳毓、胥彬、髙小艳、范行良。ID库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021引言用于再生医疗的胶原蛋白类材料包括组织提取的胶原蛋白提取物和基因重组的胶原蛋白肽。其中，I型胶原蛋白被广泛应用于各种医疗器械产品的研发。胶原蛋白类材料具有不同的特性，如：分子M的大小、纯度、种属及型别差异、三螺旋结构、细胞黏附特性等，这些性能直接关系着胶原蛋d的质量和使用性能。“YY/T1805组织工程医疗器械产品胶原蛋白”旨在建立胶原蛋白某些特殊性能的检测和表征方法，拟由4个部分构成。第1部分:术语和定义。目的在于制定包括组织提取的胶原蛋fi和基因重组胶原蛋白肽的各种术语和定义。第2部分：1型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法。目的在于提供可用于胶原蛋白分子fi检测的具体方法。第3部分:胶原蛋白含量检测液相色谱-质谱法。目的在于给岀可用于胶原蛋白含量的定量检测，以及种属来源和型别鉴别的方法。第4部分:胶原蛋白三螺旋结构表征方法。目的在于建立胶原蛋白三螺旋结构的表征方法，用于评价其三螺旋结构的有无及其完整性。IV库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021组织工程医疗器械产品胶原蛋白第2部分：I型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法1范围本文件规定了用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE)测定I型胶原蛋白分子M的方法。本文件适用于组织提取的I型胶原蛋白（原材料）分子ft的测定。注：其他类型胶原蛋白或重组胶原蛋白，如果有对照品可参考本方法进行其分子M测定。2规 范 性 引 用 文 件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适川于本文件。YY/T14532016组织工程医疗器械产品I型胶原蛋白表征方法3术 语 和 定 义YY/T1453-2016界定的及下列术语和定义适用于本文件。3.1十二焼基硫酸钠聚丙嫌K胺凝胶电泳sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectriophoresis；SDS-PAGE一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使所带负电荷远远超过天然蛋白质本身原有电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子量大小分离。4缩 略 语下列缩略语适用于本文件。Gly甘氨酸（Glycine);盐酸（Hydrochloricacid);Marker分子il标准品（Molecularweightstandard)；N，N-亚甲基双丙錄酸胺（N，N-Methylenebisacrylamide)NaOH氢氧化钠（Sodiumhydroxide);十二烧基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate)TEMED四甲基乙二胺（N，N，N，N-Tetramethylethylenediamine)TrisTris-HClHC1MBASDSi三轻甲基氨基甲烧Tris(hydroxymethyl)methylaminomethane；三轻甲基氣基甲烧盐酸Tri(Hydroxymethyl)AminoMethaneHydrochloride,库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.220215原理SD&PAGE分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使所带负电荷远远超过天然蛋白质本身原有电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子景大小分离。根据蛋白质分子位标准品在电泳中的迁移距离和其相对分子质ffl的对数值成正比的关系拟合标准曲线，根据样品的迁移率可计算出样品相对分子质fl的近似值。6试 剂 及 其 配 制6 . 1试 剂 要 求所用试剂均应符合以下要求：a)所用试剂均为分析纯及以上；b)纯化水电阻率不低于18.2Mf2.cm;c)I型胶原蛋白对照品建议用闻家标准品；d)Marker的分子景范围应涵盖供试品的分子量。注：山于动物种厲不同，其组织提取的胶原蛋白分子量存在差异，宜根据拟测试样品的动物种域不同选择相同种M动物组织来源的I型胶原蛋白对照品（如牛I型、猪I型）。6 . 2试 剂 及 试 剂 配 制所用试剂均为分析纯，试剂配制方法如下：a)30%丙烯酰胺（A液）：精确称取丙烯酰胺29.2g和MBA0.8g溶于60mL水中，置37V溶解，加水定容至100mL,2X：8X：避光保存；b)1mol/LTris-HCl溶液（pH6.8，B液）：精确称取Tris12.1g加水溶解，用HC1调pH值至6.8,加水定容至100mL，2X：8X：保存；c)1mol/LTris-HCl溶液（pH8.8,C液）：精确称取Tris12.1g，加水溶解，用HC1调pH值至8.8,加水定容至100mL,2_C8X：保存；d)10%SDS溶液(D液）：精确称取SDS1.0g加水5mL溶解，加水定容至10mL，2C8X：保存，一周内使用；e)10%过硫酸铵（E液）：柏确称取过硫酸铵1.0g加水5mL溶解，加水定容至10mL，临用前配制f)甘氨酸电泳缓冲液（5X).精确称取Tris15.1g，Gly94.0g,SDS5.0g,加水溶解，加水定容至1000mL，室温保存，临用时做5倍稀释；g)SDS样品缓冲液（5X):取b)溶液0.6mL，d)溶液2mL,溴酚蓝0.01g,丙三醇2.5mL,水4.4mL,临用前加p-巯基乙醇500混匀；h)染色液：精确称取考马斯亮蓝R-2500.5g,加人乙醇225mL、水225mL、冰醋酸50mL，混匀；i)脱色液：量取乙醇800mL、水100mL、冰乙酸100mL混匀。注：以上试剂也可用市售成品.7仪 器 和 设 备所用仪器和设备规格参照以下要求:2库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021a)分析天平(0.0001g)b)电泳仪；c)电泳槽；d)微M注射器，5ML、10pLe)离心机0水浴锅g)凝 胶 影 像 分 析 系 统。J8操 作 方 法8.1样 品 变 性 处 理8.1.1固 体 样 品称取供试品适董（胶原蛋白含M约5mg)加水8mL，SDS样品缓冲液（5X)2mL，混合后于100_C水浴加热5min10min使蛋白质变性，离心(650g，5min10min);8.1.2液 体 样 品取液体样品适量(胶原蛋白含量约5mg),加水至终体积为8mL，SDS样 品 缓 冲 液（5X)2mL，混合后于100C水浴加热5min10min使蛋白质变性，离心(650g5min10min)注：如果样品溶解后的pH值非中性时需要在加SDS样品缓冲液之前用NaOH或HC1调整pH值至屮性.8.2电泳凝胶制备8.2.1凝 胶 溶 液 组 成不同凝胶的组成见表1。表1凝 胶 溶 液 组 成凝胶种类试液分离胶溶液7.5%/mL浓缩胶溶液5%)/mL水2.12.82A液0.51.5C液2.28B液0.38D液0.030.06E液0.030.06TEMED0.0050.008注：以上试剂也可用市售凝胶成品或凝胶瑢液，凝胶中丙烯酰胺5%15%,分离胶和浓缩胶比例为推荐条件,可进行适当调整.8.2.2分 离 胶 制 备根据表1配制分离胶溶液，灌人凝胶板内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室溫不同，聚合时间3库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.22021不同）。8.2.3浓缩胶制备根据表1配制浓缩胶溶液，待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入浓缩胶溶液(用前加TEMED)插入样品梳，注意避免气泡出现。8 . 3加 样待浓缩胶溶液聚合后小心拔出样品梳，将电极缓冲液注满电泳槽的前后槽，在加样孔中加人蛋白Marker5pLI型胶原蛋白对照品10pL和待测样品10pL8.4电泳将电泳缓冲液加人电泳槽内，安装好凝胶板，可采用恒压或者恒流电泳模式。参考电泳条件为：推荐采用恒压电泳，初始电压为80V,进入分离胶时调至120V150V;恒电流模式推荐条件为：以恒流10mA条件下开始电泳，至供试品溶液进人分离胶后将电流调至20mA,直至电泳结束a注：可根据不同电泳仪设置不同参数.电泳结束时电泳前沿不能离开分离胶.8 . 5染 色电泳完毕后取出胶片，置染色液中轻轻晃动条件下染色1h2h,或能看到蓝色清晰条带时取出。8 . 6脱 色染色后的凝胶先用水冲洗表面的多余染料，再用脱色液沒泡脱色。更换脱色液，至凝胶背景透明为止。9结果9 . 1电 泳 图 谱利用凝胶电泳成像仪拍照，示意图见图UP链al链a2链条带序号说明ABCDEFGHI泜胶原蛋白对照品，进样最5pL;I型胶原蛋白对照品，进样量10pU图1I型胶原蛋白对照品电泳图谱库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载YY/T1805.220219 . 2分子置计算a)迁 移 率用卡尺或用凝胶影像分析系统测M溴酚蓝指示剂和蛋白迁移距离。每条谱带距分离胶顶部的距离为迁移距离，将每条蛋白质谱带的迁移距离除以染料前沿的迁移距离，即为蛋白的相对迁移率。按式1)计算迁移率：Rrm=DP/D(1)式中：相对迁移率；蛋白迁移距离；DB溴酚蓝指示剂迁移距离。供试品主要成分迁移率应与I型胶原蛋白对照品迁移率一致。注：凝胶胶片的厚度不一样，可能会导致条带的移行距离出现差异，建议胶的厚度为1.0mm1.2b)标 准 曲 线以为横坐标，Marker各条带相对分子fi(kDa)的对数值为纵坐标，拟合线性冋归方程，绘制标准曲线，给出标准曲线方程的公式(2)。RDPlogM=aRfm+byRz(2)式中：logM蛋白Markei分子ft(kDa)的对数值常数常数b相对迁移率；标准曲线回归常数。R2c)分子M计算将供试品蛋白相对迁移率代人公式计算，由Marker的标准曲线求得供试品的单个条带分子ttI型胶原蛋白分子量kDa)按式(3)计算:M=2Mal+M.2(3)式中：MI型胶原蛋白分子量；Malal链分子量；M.2a2链分子景。示例：牛I型胶原蛋白完整全链长分子ft约为406.93kDa419.64kDa螺旋区分子贵约为282.76kDa293.80kDa.1 0可 接 受 准 则a)用于绘制标准曲线的Marker,其电泳图谱应包括不少于5个条带，并应符合说明书提供的谱带图示，在泳道中从上至下的分布范围与其标准蛋白分子fi致；b)待测样品的分子量应包含在分子tt标准梯度范围内，电泳图谱应给出完整的分离胶图像及必要的浓缩胶图像c)标准曲线回归常数尺20.95;d)供试品主成分相对迁移率应与对照品相对迁移率一致，两者相对迁移率偏差应不超过5%。库七七 w w w .k q q w .c o m 标准下载中 华 人 民 共 和 国 医 药行业标准组织工程医疗器械产品胶原蛋白第2部分：I型胶原蛋白分子置检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法YY/T1805.22021中 国 标 准 出 版 社 出 版 发 行北京市朝阳区和平里西街甲2号100029)北京市西城区三里河北街16号100045)网址总编室：[phone]发行中心：010)51780238读者服务部：[phone]中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷各地新华书店经销开本880X12301/16印张0.75字 数1 8千 字2021年9月第一版2021年9月第一次印刷书号：155066-2-35900定价18.00元如有印装差错由本社发行中心调换版 权 专 有 侵 权 必 究举报电话：[phone]YY/T805.2-2021码 上O扫 正 版K务 到lCSJ0CSJlCSJln08lH/AA