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重组蛋白rSKY的原核表达、初步纯化及鉴定
摘 要：本文对先前构建的菌株E.coli BL21/pET30a-SKY进行鉴定，判断rSKY是否表达及表达方式。结果表明经过诱导，E.coli BL21/pET30a-SKY可成功表达rSKY，且为可溶性表达。将菌的蛋白粗品70℃加热20分钟，可除去大部分非目的蛋白，rSKY得到有效纯化。
关键词：rSKY 原核表达 鉴定

RSKY recombinant protein of the original nuclear expression,
preliminary purification and identification
Abstract:In this experiment, On previous strains of building up the E.coli BL21 / pET30a-SKY evaluations.then Judge whether rSKY express and expression.The results show that after the induction, E.c oli BL21 / pET30a-SKY can be successful rSKY expression, and to soluble expression.Will the bacteria protein crude products 70 ℃ heat 20 minutes,it can remove most of the nontarget protein, rSKY effectively purification.
Key words: rSKY original nuclear express identification

前言：SKY是一种耐热蛋白酶，实验室先前克隆到sky基因，构建了原核表达载体pET30a-SKY，测序正确后将其转化E.coli BL21感受态，并筛选了阳性克隆。本实验将对所构建质粒的表达情况及纯化方法进行进一步研究。
1材料与方法
1.1试剂与仪器
LB液体培养基：1L溶液中含10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl, pH7.3。
LB固体培养基：1L LB液体基本中加入15g琼脂。
提取缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH7.3。
试剂均为国产分析纯
E.coli BL21/pET30a-SKY为本实验室构建保存的菌株。
pH计为奥科隆产品
超洁净工作台为北京哈东联产品
超声波细胞破碎仪为宁波新芝产品
电泳仪及电泳槽为北京六一产品

1.2 实验方法
1.2.1重组蛋白rSKY的诱导表达
将E.coli BL21/pET30a-SKY在LB固体培养基平板上划线。挑取单菌落接种于5 ml LB培养液(含0.025 mg/ml Kan)中,37 ℃，200 rpm恒温震荡培养至OD600=0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L， 37 ℃继续培养4 h，8 000 rpm 离心10 min收集菌体。以E.coli BL21/pET30a作为对照组。
1.2.2 蛋白粗品的制备
将收集的菌体用0.5 mL提取缓冲液悬起，超声破碎后，12 000 rpm离心30 min，取上清。沉淀用6 mol/L尿素溶解。
1.2.3 重组蛋白rSKY的初步纯化
取0.025 mL1.2.2制备的上清于70 ℃水浴中加热20分钟，12 000 rpm离心30 min，取上清。
1.2.4 SDS-PAGE鉴定
SDS-PAGE参照Laemmli[1]的方法进行。浓缩胶浓度选用4%，分离胶浓度选用12.5%，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V，使用考马斯亮蓝R-250染色。
2 结果与讨论
2.1 E.coli BL21/pET30a表达蛋白的SDS-PAGE分析
1 2 3 4 5

前五道分别为 1. E.coli BL21/pET 30a表达的沉淀；2. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的沉淀；3. E.coli BL21/pET30a表达的上清；4. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的上清；5. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的上清70 ℃ 水浴中加热20分钟后的样品。
2.2 由E.coli BL21/pET30a-SKY比E.coli BL21/pET30a的上清明显多出一条带，判断rSKY在构建的菌株里有表达且为可溶性表达。
2.3 由加热后的上清中目的蛋白rSKY保留，杂蛋白很少，表明用加热的方法可对rSKY进行有效纯化。这种热稳定蛋白结构及功能上的特性赋子其良好的
热稳定性和内蛋白水解酶抗性，能够经过发芽、糖化及煮沸发酵等过程后仍然得以保存，成为决定啤酒的口感风味、泡沫及胶体稳定性等品质指标。[3]
2.4本实验成功构建了pET30a-SKY原核表达载体。表达载体在E.coli BL21中高效表达，获得rSKY重组蛋白。实验进一步证明该蛋白表达为可溶性表达。将菌的蛋白粗品70℃加热20分钟，可除去大部分非目的蛋白，rSKY得到有效纯化。在以后的研究中，我们可以继续将得到纯化的目的基因蛋白制备相应的多克隆抗体，为分析rSKY亚基组成及从蛋白表达水平和酶活性方面的研究奠定基础 [4] 。
2.5本次实验不仅是我学会了电泳仪及电泳槽在SDS-PAGE鉴定方面的使用，同
时，实验中，将团队协作与独立思考相结合，在以后的无论是理论课的学习还是实验课的操作，我们都要将团队意识融入其中，使效率最大化。

参考文献
[1] Laemmli U K, Favre M. Gel electrophoresis of proteins[J]. Mol.Biol, 1973, 80: 575-599；
[2]黄保英，王文玲等甲型流感病毒核蛋白在大肠杆菌中的可溶性高效表达与纯化，病毒学报2011年l月第1期；
[3]孙付保，陈霞等，国产主要东北大麦和华东大麦热稳定蛋白的比较，中国酿造，2010年第10期 总第223期；
[4]杨丽霞,等，花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备，亚热带植物科学-2010年4期。