放射性配体与受体结合分析实验(RBA)方法.ppt

放射性配体与受体结合分析实验放射性配体与受体结合分析实验（RBA）方法）方法刘星华刘星华2011-5-13药理室讲座药理室讲座内容内容实验定义与原理实验定义与原理实验材料与仪器实验材料与仪器实验方法实验方法Scatchard方程与作图（饱和与竞争实验）方程与作图（饱和与竞争实验）RBA的安全问题的安全问题实验举例实验举例实验定义与原理实验定义与原理定义定义定义定义放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析放射性配基与受体结合分析简称为受体放射分析（radioassay of receptorsradioassay of receptors），它是应用放射性核），它是应用放射性核），它是应用放射性核），它是应用放射性核素标记配基与特异受体相结合，研究素标记配基与特异受体相结合，研究素标记配基与特异受体相结合，研究素标记配基与特异受体相结合，研究受体的亲和受体的亲和受体的亲和受体的亲和力力力力和和和和受体的数量受体的数量受体的数量受体的数量，以及研究，以及研究，以及研究，以及研究受体亚型受体亚型受体亚型受体亚型的常用方法。的常用方法。的常用方法。的常用方法。原理原理原理原理 放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细放射性标记配基（激动剂或拮抗剂）和组织、细胞，或含有受体的制剂一起胞，或含有受体的制剂一起胞，或含有受体的制剂一起胞，或含有受体的制剂一起温育温育温育温育，使受体和配基，使受体和配基，使受体和配基，使受体和配基充分结合，形成充分结合，形成充分结合，形成充分结合，形成受体受体受体受体-配基复合物配基复合物配基复合物配基复合物，终止反应后，终止反应后，终止反应后，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基定滤膜或沉淀物中的放射性，即可计算出和配基结合的受体的量。结合的受体的量。结合的受体的量。结合的受体的量。RBARBA的分类的分类 RBA RBA RBA RBA用放射性核素来标记配基，与相应的受体用放射性核素来标记配基，与相应的受体用放射性核素来标记配基，与相应的受体用放射性核素来标记配基，与相应的受体进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性进行特异性结合反应，可对受体的性质进行定性和定量的分析。和定量的分析。和定量的分析。和定量的分析。1 1 1 1、定性、定性、定性、定性RBARBARBARBA：是通过反应的量效关系的变化：是通过反应的量效关系的变化：是通过反应的量效关系的变化：是通过反应的量效关系的变化来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及来判断受体的类型，单位点或多位点结合式，及受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性受体与配体结合的特点，反应的可逆性、协作性等。等。等。等。2 2 2 2、定量、定量、定量、定量RBARBARBARBA：是在已知配体与受体反应性质：是在已知配体与受体反应性质：是在已知配体与受体反应性质：是在已知配体与受体反应性质的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或的基础上，通过结合反应，给出一定量的组织或细胞中能与该放射性配体结合的细胞中能与该放射性配体结合的细胞中能与该放射性配体结合的细胞中能与该放射性配体结合的受体数受体数受体数受体数及结合的及结合的及结合的及结合的平衡解离常数平衡解离常数平衡解离常数平衡解离常数或或或或结合位点数结合位点数结合位点数结合位点数（最大结合容量）。（最大结合容量）。（最大结合容量）。（最大结合容量）。实验材料与仪器实验材料与仪器实验材料实验材料动物组织（皮层、海马、纹状体等）动物组织（皮层、海马、纹状体等）仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温仪器（组织匀浆机、旋涡混合器、低温高速离心机、电热恒温水温箱、高速离心机、电热恒温水温箱、-80冰冰箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）箱、制冰机、抽虑瓶、液闪仪等）材料（材料（2ml/6ml分离管、分离管、10ul/200ul/1ml枪头、微纤维滤纸等）枪头、微纤维滤纸等）药品（放射性配基、各种非标计化合物药品（放射性配基、各种非标计化合物等）等）实验仪器实验仪器组织匀浆机组织匀浆机组织匀浆机组织匀浆机IKAIKA，T10B S25 T10B S25 漩涡混合器漩涡混合器漩涡混合器漩涡混合器WH-2WH-2低温高速离心机低温高速离心机低温高速离心机低温高速离心机凯达，凯达，凯达，凯达，TGL20MTGL20M超低温冰箱超低温冰箱超低温冰箱超低温冰箱海尔海尔海尔海尔数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅数显恒温水浴锅金燕，金燕，金燕，金燕，HH-S26SHH-S26S制冰机制冰机制冰机制冰机GELINGELIN型号型号型号型号IMS-50 automatic IMS-50 automatic ice flakesice flakes电热恒温水温箱电热恒温水温箱循环水式多用真空泵循环水式多用真空泵循环水式多用真空泵循环水式多用真空泵液闪测定计数仪液闪测定计数仪液闪测定计数仪液闪测定计数仪HIDEXHIDEX，425-034425-034型型型型实验材料实验材料2ml2ml离心管离心管离心管离心管6ml6ml一次性软试管一次性软试管一次性软试管一次性软试管枪头枪头1ml10ul200ulTrisTrisPPOPPO与与与与POPOPPOPOP过滤装置过滤装置砂芯过滤装置（抽滤砂芯过滤装置（抽滤砂芯过滤装置（抽滤砂芯过滤装置（抽滤瓶）瓶）瓶）瓶）1000ml1000mlWhatman GF/CWhatman GF/C玻璃玻璃玻璃玻璃微纤维滤纸微纤维滤纸微纤维滤纸微纤维滤纸 40mm40mm放射性化合物放射性化合物放射性配体放射性配体放射性配体放射性配体低温保存低温保存低温保存低温保存实验方法流程实验方法流程实验方法流程实验方法流程1 1、制备受体样品；、制备受体样品；2 2、加样、温育进行结合反应；、加样、温育进行结合反应；3 3、终止反应，分离结合物与游离物、终止反应，分离结合物与游离物4 4、测定结合物的放射性；、测定结合物的放射性；5 5、数据处理。、数据处理。实验具体操作（实验具体操作（D1、D2、5-HT）1 1、配制各种缓冲液及试剂、配制各种缓冲液及试剂、配制各种缓冲液及试剂、配制各种缓冲液及试剂 按处方配比配制各种缓冲液贮备液按处方配比配制各种缓冲液贮备液按处方配比配制各种缓冲液贮备液按处方配比配制各种缓冲液贮备液配制各种非标记配体溶液配制各种非标记配体溶液配制各种非标记配体溶液配制各种非标记配体溶液配制各种受试药物溶液配制各种受试药物溶液配制各种受试药物溶液配制各种受试药物溶液注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、仪器：分析天平、移液枪、烧杯、量筒、容量瓶、试管、试管、试管、试管、EPEP管等管等管等管等试剂：无水乙醇、超纯水、试剂：无水乙醇、超纯水、试剂：无水乙醇、超纯水、试剂：无水乙醇、超纯水、Tris Tris、抗血酸、优降、抗血酸、优降、抗血酸、优降、抗血酸、优降宁、宁、宁、宁、HCl HCl、NaClNaCl、KClKCl、CaCl2CaCl2、MgCl2 MgCl2、DMSO DMSO、甲苯、甲苯、甲苯、甲苯、PPO PPO、POPOPPOPOP、Methysergide Methysergide、ButaclamolButaclamol及及及及5HT 5HT 等等等等 2、制备膜受体、制备膜受体 大鼠断头取脑大鼠断头取脑大鼠断头取脑大鼠断头取脑 分离出目标组织分离出目标组织分离出目标组织分离出目标组织 加加加加1010倍体积（倍体积（倍体积（倍体积（V/WV/W）冰冷的缓冲液）冰冷的缓冲液）冰冷的缓冲液）冰冷的缓冲液 用组织匀浆机匀浆用组织匀浆机匀浆用组织匀浆机匀浆用组织匀浆机匀浆3 3次，每次数秒钟，制成组织匀浆液次，每次数秒钟，制成组织匀浆液次，每次数秒钟，制成组织匀浆液次，每次数秒钟，制成组织匀浆液 组织匀浆液用低温高超离心机离心（组织匀浆液用低温高超离心机离心（组织匀浆液用低温高超离心机离心（组织匀浆液用低温高超离心机离心（1200012000转转转转/分）分）分）分）3 3次，每次，每次，每次，每次次次次2020分钟分钟分钟分钟 弃上清液，沉淀（膜受体）放弃上清液，沉淀（膜受体）放弃上清液，沉淀（膜受体）放弃上清液，沉淀（膜受体）放-80-80度超低温冰箱保存备用度超低温冰箱保存备用度超低温冰箱保存备用度超低温冰箱保存备用 注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低仪器：手术器械、组织匀浆机、制冰机、超低温冰箱、低温高超离心机温高超离心机温高超离心机温高超离心机 试剂：超纯水试剂：超纯水试剂：超纯水试剂：超纯水3、加样、加样 取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定取出膜受体，加入一定体积的冰冷的缓冲液，混匀，使成一定浓度的膜受体溶液。浓度的膜受体溶液。浓度的膜受体溶液。浓度的膜受体溶液。取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度取放射性配体母液，用无水乙醇稀释成实验所需浓度 按以下顺序及比例加入各种反应液。按以下顺序及比例加入各种反应液。按以下顺序及比例加入各种反应液。按以下顺序及比例加入各种反应液。（1 1）总结合管：）总结合管：）总结合管：）总结合管：100ul100ul膜受体膜受体膜受体膜受体 +200ul+200ul缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 +10 ul+10 ul 放射性配体放射性配体放射性配体放射性配体（2 2）非特异管：）非特异管：）非特异管：）非特异管：100ul100ul膜受体膜受体膜受体膜受体 +100ul+100ul缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 +100ul+100ul非标记配体非标记配体非标记配体非标记配体 +10 ul+10 ul 放射性配体放射性配体放射性配体放射性配体（3 3）受试物管：）受试物管：）受试物管：）受试物管：100ul100ul膜受体膜受体膜受体膜受体 +100ul+100ul缓冲液缓冲液缓冲液缓冲液 +100ul+100ul药物溶液药物溶液药物溶液药物溶液 +10 ul+10 ul 放射性配体放射性配体放射性配体放射性配体 注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器 仪器：移液枪、烧杯、量筒、仪器：移液枪、烧杯、量筒、仪器：移液枪、烧杯、量筒、仪器：移液枪、烧杯、量筒、EPEP管等管等管等管等 试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液试剂：超纯水、无水乙醇、放射性配体母液 4、受体配体结合反应受体配体结合反应以上各管在加完放射性配体后，立即放入以上各管在加完放射性配体后，立即放入37度的水浴锅中，孵育度的水浴锅中，孵育20分钟。分钟。20分钟后分钟后把各管放入冰中终止反应。把各管放入冰中终止反应。注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：恒温水浴锅，制冰机仪器：恒温水浴锅，制冰机 试剂：无试剂：无 5、分离游离及结合的放射性配体、分离游离及结合的放射性配体上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤上述各管在反应结束后，分别倒入抽滤装置进行过滤，并用装置进行过滤，并用5-10ml冰冷的缓冲冰冷的缓冲液冲洗滤膜液冲洗滤膜2次。滤膜放入次。滤膜放入85度烘箱中烘度烘箱中烘干，随后放入测试管中，关加入一定体干，随后放入测试管中，关加入一定体积的闪烁液，浸泡过夜。积的闪烁液，浸泡过夜。注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：仪器：抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、抽滤器、烘箱、滤纸、移液枪、液闪杯液闪杯试剂：试剂：甲苯、甲苯、PPO、POPOP6、测定结合型放射配体每分钟放射计测定结合型放射配体每分钟放射计数数采用放射性计数仪，测定各测试管中结采用放射性计数仪，测定各测试管中结合型放射配体每分钟放射计数合型放射配体每分钟放射计数注意：该项操作所需试剂或仪器注意：该项操作所需试剂或仪器仪器：仪器：液闪仪液闪仪试剂：试剂：无无7、数据处理、数据处理按以下公式计算各化合物对同位素配基按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：结合的抑制率百分率：抑制率抑制率抑制率抑制率(I%)=(I%)=（总结合管（总结合管（总结合管（总结合管cpmcpm化合物化合物化合物化合物cpmcpm）/（总结合管（总结合管（总结合管（总结合管cpmcpm非特异结合管非特异结合管非特异结合管非特异结合管cpmcpm）100%100%化合物每次实验做两复管，进行两次单化合物每次实验做两复管，进行两次单独实验。独实验。8、各种指标、各种指标IC50：半数抑制浓度：半数抑制浓度KD：平衡解离常数（：平衡解离常数（mol/L），物理意），物理意义为受体有一半结合配基时所需要的配义为受体有一半结合配基时所需要的配基浓度。基浓度。Bmax：受体最大结合容量（：受体最大结合容量（fmol/mg蛋蛋白质）白质）nH：Hill系数系数Scatchard方程与作图方程与作图（饱和实验）（饱和实验）Scatchard方程与作图方程与作图简单单位点系统受体和配体结合反应（简单单位点系统受体和配体结合反应（简单单位点系统受体和配体结合反应（简单单位点系统受体和配体结合反应（ClarkClark模型）模型）模型）模型）条件：条件：条件：条件：（1 1）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；）配基与受体结合反应为可逆双分子反应；（2 2）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同）所有受体都是等效和独立的，同一受体的不同分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分分子对配基的亲和力都相等，而且不受邻近受体分子结合配基与否的影响；子结合配基与否的影响；子结合配基与否的影响；子结合配基与否的影响；（3 3）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；）配体本身不代谢，也不与其它位置结合；（4 4）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。）生物效应的强度与浓度近似于总配基浓度。饱和曲线饱和曲线固定的受体数量，固定数量的非标和不同固定的受体数量，固定数量的非标和不同浓度体积的放射性配体浓度体积的放射性配体 饱和曲线饱和曲线饱和曲线饱和曲线(saturation curve)(saturation curve)1 1）饱和曲线）饱和曲线）饱和曲线）饱和曲线 受体数量一定受体数量一定受体数量一定受体数量一定，当配体（一般是不同浓度体积的放射当配体（一般是不同浓度体积的放射当配体（一般是不同浓度体积的放射当配体（一般是不同浓度体积的放射性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成性配体与固定数量的非标）的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。的复合物也逐渐增多。的复合物也逐渐增多。的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反但由于受体数量有限，又是可逆反但由于受体数量有限，又是可逆反但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此应，因此应，因此应，因此RLRL（受体配体复合物）的增加不是直线上升，（受体配体复合物）的增加不是直线上升，（受体配体复合物）的增加不是直线上升，（受体配体复合物）的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，结合时，结合时，结合时，RLRL的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线饱和了，此即饱和曲线饱和了，此即饱和曲线饱和了，此即饱和曲线 。#饱和曲线的作用？饱和曲线的作用？饱和曲线的作用？饱和曲线的作用？ScatchardScatchard作图，求得作图，求得作图，求得作图，求得KDKD与与与与BmaxBmax 2 2 2 2）曲线的高度取决于）曲线的高度取决于）曲线的高度取决于）曲线的高度取决于RTRTRTRT。在曲线起始段，曲线上升的。在曲线起始段，曲线上升的。在曲线起始段，曲线上升的。在曲线起始段，曲线上升的快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，快慢即曲线的斜率取决于配基与受体的亲和力，所以，KDKDKDKD越小越小越小越小 (亲和力越大亲和力越大亲和力越大亲和力越大)，饱和曲线上升越快，饱和曲线上升越快，饱和曲线上升越快，饱和曲线上升越快，KDKDKDKD越大越大越大越大 (亲和亲和亲和亲和力越小力越小力越小力越小)，饱和曲线上升越慢。，饱和曲线上升越慢。，饱和曲线上升越慢。，饱和曲线上升越慢。（即：亲和力越大，受体（即：亲和力越大，受体（即：亲和力越大，受体（即：亲和力越大，受体与配件结合速度越快，时间越短）与配件结合速度越快，时间越短）与配件结合速度越快，时间越短）与配件结合速度越快，时间越短）k1,v1k1,v1k1,v1k1,v1 R+L R+L R+L R+L RL RL RL RL k2,v2 k2,v2 k2,v2 k2,v2 KD KDKK2 2/K/K1 1=RL/RL=RL/RL 饱和曲线的形状和饱和曲线的形状和饱和曲线的形状和饱和曲线的形状和KDKD有关（如图有关（如图有关（如图有关（如图1 1）。）。）。）。图图1 KD对饱和曲线的影响对饱和曲线的影响 饱和曲线曲线的高度取决于饱和曲线曲线的高度取决于饱和曲线曲线的高度取决于饱和曲线曲线的高度取决于RTRT（如图（如图（如图（如图2 2）。）。）。）。图图2 RT对饱和曲对饱和曲线影响线影响 质量作用定律质量作用定律质量作用定律质量作用定律 (Mass action law)(Mass action law)(Mass action law)(Mass action law)：受体和配基的结合反应服从可逆反应的质受体和配基的结合反应服从可逆反应的质受体和配基的结合反应服从可逆反应的质受体和配基的结合反应服从可逆反应的质量作用定律，可用下式表示量作用定律，可用下式表示量作用定律，可用下式表示量作用定律，可用下式表示:k1,v1 k1,v1 k1,v1 k1,v1 R+L R+L R+L R+L RL RL RL RL （1 1 1 1）k2,v2k2,v2k2,v2k2,v2 上式中，上式中，上式中，上式中，RRRR和和和和L L L L 为游离受体和游离配基的浓度，为游离受体和游离配基的浓度，为游离受体和游离配基的浓度，为游离受体和游离配基的浓度，RLRLRLRL为复合物为复合物为复合物为复合物浓度，浓度，浓度，浓度，v1v1v1v1和和和和v2v2v2v2为结合速率和解离速率，为结合速率和解离速率，为结合速率和解离速率，为结合速率和解离速率，k1k1k1k1和和和和k2k2k2k2为结合速率常数为结合速率常数为结合速率常数为结合速率常数 (association rate constant)(association rate constant)(association rate constant)(association rate constant)和解离速率常数和解离速率常数和解离速率常数和解离速率常数 (dissociation rate(dissociation rate(dissociation rate(dissociation rate constant)constant)constant)constant)。数学表达数学表达根据质量作用定律：根据质量作用定律：v1=k1 R L；v2=k2 RL当反应达到平衡后，当反应达到平衡后，v1 =v2,即即:k1 RL=k2 RL,则则平衡解离常数（平衡解离常数（KD）的数学表达式为：）的数学表达式为：KDK2/K1=RL/RL （2）Scatchard作图作图 设设设设LTLT为配体的初始浓度，为配体的初始浓度，为配体的初始浓度，为配体的初始浓度，RTRT为受体的初始浓度（即为受体的初始浓度（即为受体的初始浓度（即为受体的初始浓度（即受体总量受体总量受体总量受体总量），则有：），则有：），则有：），则有：L L=LTLT RLRL R R=RTRT RLRL 由式（由式（由式（由式（2 2）整理可得：）整理可得：）整理可得：）整理可得：KD KD RT-RLLRT-RLL RL RL 将上式整理可得：将上式整理可得：将上式整理可得：将上式整理可得：RLRL=RTRT 1_1_ RL RL （Scatchard Scatchard 方程）方程）方程）方程）L KD KD L KD KD 变形：变形：变形：变形：RLRL为受体与配基特异结合的量，换成为受体与配基特异结合的量，换成为受体与配基特异结合的量，换成为受体与配基特异结合的量，换成BB表示，表示，表示，表示，LL为自由配基的量，换成为自由配基的量，换成为自由配基的量，换成为自由配基的量，换成FF表表表表示，示，示，示，RTRT为受体总量，也即受体最大结合量，换成为受体总量，也即受体最大结合量，换成为受体总量，也即受体最大结合量，换成为受体总量，也即受体最大结合量，换成BmaxBmax表示，则上式方程变为表示，则上式方程变为表示，则上式方程变为表示，则上式方程变为 B/F=Bmax/KD-B/KDB/F=Bmax/KD-B/KD（RT RT 为受体总量，等于为受体总量，等于为受体总量，等于为受体总量，等于RR和和和和RLRL之和，也是最大结合量之和，也是最大结合量之和，也是最大结合量之和，也是最大结合量B Bmaxmax）以复合物浓度以复合物浓度以复合物浓度以复合物浓度RLRL为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值RL/LRL/L为纵坐为纵坐为纵坐为纵坐标作图，即为标作图，即为标作图，即为标作图，即为ScatchardScatchard作图。作图。作图。作图。图图3 简单单位点系统简单单位点系统RBA的的Scatchard作图作图简单单位点系统简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜率为作图为一条直线，斜率为-（1/KD），），横轴截距为横轴截距为RT，纵轴截距为，纵轴截距为RT/KD（见图（见图3）。）。由此求得KD与BmaxHill方程与作图方程与作图 当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是当一个受体分子可以结合一个以上的配基时，配基受体结合反应不是简单的双分子反应，而是简单的双分子反应，而是简单的双分子反应，而是简单的双分子反应，而是 k1,v1k1,v1k1,v1k1,v1 R+nL R+nL R+nL R+nL nRL nRL nRL nRL，根据质量作用定律推导出，根据质量作用定律推导出，根据质量作用定律推导出，根据质量作用定律推导出HillHillHillHill方程：方程：方程：方程：k2,v2k2,v2k2,v2k2,v2经过变形得其中n为hill系数，以结合分数B/Bmax对游离配基L作图，得Hill作图（如右）。（3）将（将（将（将（3 3）式两边取对数）式两边取对数）式两边取对数）式两边取对数 非特异性结合非特异性结合非特异性结合非特异性结合(non-specific binding(non-specific binding，NSB)NSB)NSBNSB 在在RBA系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。NSBNSB的特点的特点的特点的特点 亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体亲和力小而结合容量大，不易被饱和，随反应系统内配体浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图浓度增加而线性增大，而且这种结合与生物效应无关（见图4 4）。）。）。）。图图4 饱和曲线实验中饱和曲线实验中TB、SB和和NSB的关系的关系在在RBA的数据处理时，测得的总结合的放射性的数据处理时，测得的总结合的放射性(total binding，TB)，必须减去必须减去NSB，才能得到特异性结合，才能得到特异性结合(specific binding，SB)的数据。的数据。竞争曲线竞争曲线固定的放射性配基浓度，一定量的受体和固定的放射性配基浓度，一定量的受体和不同浓度的未标记化合物不同浓度的未标记化合物数学表达数学表达 此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受此实验用于测定非标计药物与放射性配基竞争结合同一受体的能力。通常用体的能力。通常用体的能力。通常用体的能力。通常用ICIC5050和和和和KKi i来表示。来表示。来表示。来表示。闪烁液闪烁液 包括溶剂、闪烁剂和添加包括溶剂、闪烁剂和添加包括溶剂、闪烁剂和添加包括溶剂、闪烁剂和添加剂剂剂剂 溶剂：溶解闪烁剂和放射溶剂：溶解闪烁剂和放射溶剂：溶解闪烁剂和放射溶剂：溶解闪烁剂和放射性样品，吸收和传递射线性样品，吸收和传递射线性样品，吸收和传递射线性样品，吸收和传递射线能量。能量。能量。能量。闪烁剂：第一闪烁剂（吸闪烁剂：第一闪烁剂（吸闪烁剂：第一闪烁剂（吸闪烁剂：第一闪烁剂（吸收受激溶剂能量，退激发收受激溶剂能量，退激发收受激溶剂能量，退激发收受激溶剂能量，退激发光）、第二闪烁剂（波长光）、第二闪烁剂（波长光）、第二闪烁剂（波长光）、第二闪烁剂（波长转移，匹配光电倍增管光转移，匹配光电倍增管光转移，匹配光电倍增管光转移，匹配光电倍增管光谱；提高淬灭耐受）谱；提高淬灭耐受）谱；提高淬灭耐受）谱；提高淬灭耐受）添加剂：助溶剂、抗淬灭添加剂：助溶剂、抗淬灭添加剂：助溶剂、抗淬灭添加剂：助溶剂、抗淬灭剂剂剂剂各受体的非标与同位素各受体的非标与同位素受体非标放射性配基受体组织5-HT1A 5-HT(serotonin)3H-8-OH-DPAT大鼠纹状体/皮层5-HT2AMethysergide3H-Ketanserin大鼠纹状体/皮层D2Butaclamol3H-Spiperone大鼠纹状体1Prazosin3H-prazosin大鼠皮层2Rauwolscine3H-Rauwolscine大鼠皮层M阿托品3H-QNB（毕兹）大鼠脑去小脑/回肠心得舒3H-DHA鸭红细胞/大鼠脑RBA的安全问题的安全问题射线射线放射型物质发出的射线有三种：放射型物质发出的射线有三种：天然放射现象三种射线三种射线射线射线射线射线 射线射线 射线射线根根根根据据据据射射射射线线线线的的的的偏偏偏偏转转转转方方方方向向向向和和和和磁磁磁磁场场场场方方方方向向向向的的的的关关关关系系系系可可可可以以以以确确确确定定定定，偏偏偏偏转转转转较较较较小小小小的的的的一一一一束束束束由由由由带带带带正正正正电电电电荷荷荷荷的的的的粒粒粒粒子子子子组组组组成成成成，我我我我们们们们把把把把它它它它叫叫叫叫做做做做 射射射射线线线线，射射射射线线线线由由由由带带带带正正正正电电电电的的的的 粒粒粒粒子子子子组组组组成成成成.科科科科学学学学家家家家们们们们研研研研究究究究发发发发现现现现每每每每个个个个 粒粒粒粒子子子子带带带带的的的的正正正正电电电电荷荷荷荷是是是是电电电电子子子子电电电电荷荷荷荷的的的的2 2倍倍倍倍，粒粒粒粒子子子子质质质质量量量量大大大大约约约约等等等等于于于于氦氦氦氦原原原原子子子子的的的的质质质质量量量量.进进进进一一一一步步步步研研研研究究究究表表表表明明明明 粒粒粒粒子子子子就就就就是是是是氦氦氦氦原原原原子子子子核核核核.由由由由于于于于 粒粒粒粒子子子子的的的的质质质质量量量量较较较较大大大大，所所所所以以以以 射射射射线线线线的的的的穿穿穿穿透透透透本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住本领最小，我们用一张厚纸就能把它挡住.射线射线与与射射线线偏偏转转方方向向相相反反的的那那束束射射线线带带负负电电荷荷，我我们们把把它它叫叫做做射射线线.研研究究发发现现射射线线由由带带负负电电的的粒粒子子（粒粒子子）组组成成.进进一一步研究表明步研究表明粒子就是电子粒子就是电子.射线的穿透本领较强，很容易穿透射线的穿透本领较强，很容易穿透黑纸，还能穿透几厘米厚的铝板黑纸，还能穿透几厘米厚的铝板.射线射线 中中间间不不发发生生偏偏转转的的那那束束射射线线叫叫做做射射线线，研研究究表表明明，射射线线的的实实质质是是一一种种波波长长极短的极短的电磁波电磁波，它不带电，是中性的，它不带电，是中性的.射线的穿透本领极强，一般薄金属射线的穿透本领极强，一般薄金属板都挡不住它，它能穿透几十厘米厚的板都挡不住它，它能穿透几十厘米厚的水泥墙和几厘米厚的铅板水泥墙和几厘米厚的铅板.射线射线在在在在某某某某种种种种核核核核反反反反应应应应中中中中，一一一一个个个个中中中中子子子子变变变变成成成成一一一一个个个个电电电电子子子子和和和和一一一一个个个个质质质质子子子子.这这这这就就就就是是是是原原原原子子子子核核核核内内内内没没没没有有有有电电电电子子子子，又又又又会会会会放放放放出出出出电电电电子，这就是产生子，这就是产生子，这就是产生子，这就是产生 射线的原因射线的原因射线的原因射线的原因.射线是一种带负射线是一种带负射线是一种带负射线是一种带负电荷电荷电荷电荷的、高速运行、从的、高速运行、从的、高速运行、从的、高速运行、从核素核素核素核素放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于放射性衰变中释放出的粒子。人类受到来源于人造或自然界人造或自然界人造或自然界人造或自然界(氚，氚，氚，氚，C C1414等等等等)射线的照射，射线的照射，射线的照射，射线的照射，射线比射线比射线比射线比 射线射线射线射线更具有穿透力，但在穿过同样距更具有穿透力，但在穿过同样距更具有穿透力，但在穿过同样距更具有穿透力，但在穿过同样距离，其引起的损伤更小。一些离，其引起的损伤更小。一些离，其引起的损伤更小。一些离，其引起的损伤更小。一些 射线能穿透皮射线能穿透皮射线能穿透皮射线能穿透皮肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引肤，引起放射性伤害。但是它一旦进入体内引起的危害更大。起的危害更大。起的危害更大。起的危害更大。粒子能被体外衣服消减、阻粒子能被体外衣服消减、阻粒子能被体外衣服消减、阻粒子能被体外衣服消减、阻挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。挡或一张几毫米厚的铝箔完全阻挡。放射防护措施放射防护措施外照防护措施外照防护措施时间防护：尽量减少受照射时间。时间防护：尽量减少受照射时间。距离防护：距离越远，辐射能量越低。距离防护：距离越远，辐射能量越低。屏蔽防护：屏蔽防护：射线注意防止内照射；射线注意防止内照射；射射线可用铝、有机玻璃、塑料等原子序数线可用铝、有机玻璃、塑料等原子序数较低的物质；较低的物质；射线可用铅、铁、混凝土射线可用铅、铁、混凝土等高原子序数物质。等高原子序数物质。内照射防护措施内照射防护措施围封隔离防扩散：围封隔离防扩散：“三区配置三区配置”法，即法，即清洁区、中间区、活性区；通风良好、清洁区、中间区、活性区；通风良好、独立的下水处理系统；遵守独立的下水处理系统；遵守SOP。除污保洁防污染除污保洁防污染个人防护侵入：穿戴适当的个人保护衣个人防护侵入：穿戴适当的个人保护衣具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不准具，如工作服、口罩、鞋、帽等。不准在工作场所进食、吸烟。工作结束后进在工作场所进食、吸烟。工作结束后进行卫生清洗，并作污染检测。行卫生清洗，并作污染检测。放射性放射性“三废三废”处理处理基本方法：放置衰变、浓缩储存、稀释基本方法：放置衰变、浓缩储存、稀释排放排放固体：一般用放置法（半衰期短）、固体：一般用放置法（半衰期短）、焚焚化法（废气的处理）、埋藏法（不可燃化法（废气的处理）、埋藏法（不可燃/焚化残渣）焚化残渣）液体：一般用放置法（半衰期短）、稀液体：一般用放置法（半衰期短）、稀释法（量少浓度低）、浓集法（富集掩释法（量少浓度低）、浓集法（富集掩埋）埋）气体：大气排放（低浓度气体：大气排放（低浓度/气溶胶）、过气溶胶）、过滤器或液体吸收（高浓度）滤器或液体吸收（高浓度）表面放射性污染的处理表面放射性污染的处理皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，皮肤：轻度，大量清水和肥皂清洗；严重，10%EDTA10%EDTA或或或或6.5%6.5%高锰酸钾浸泡清洗高锰酸钾浸泡清洗高锰酸钾浸泡清洗高锰酸钾浸泡清洗工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；工作场所表面：轻度，大量清水或洗涤剂清洗；严重，挖去再填充或覆盖油漆严重，挖去再填充或覆盖油漆严重，挖去再填充或覆盖油漆严重，挖去再填充或覆盖油漆/塑料板塑料板塑料板塑料板工作服：轻度，肥皂水；严重，工作服：