发酵过程染菌的防止.pdf

第1章发酵过程 染菌的防止抗生素发酵的消毒灭菌是抗生素生产过程中的重要环节,而发酵的染菌则 直接威胁和影响抗生素的产量和质量6同时，消毒灭菌后的培养基质量，不仅关 系到是否染菌，还影响产生菌的代谢和发酵工艺控制的F常进行。因此，消灭染 菌以及消灭染菌方法的探讨和研究是发酵生产工艺中直需要认真解决的重要 课题。造成发酵染菌的原因有很多，人为的操作因素仅仅是一个方面。发醉染菌 的原因还包括：设备结构的不合理,工艺管线的不合理安装，设备存在的泄漏及 死角，消灭染菌管理工作的不严格等。为了消灭染菌,着重抓好以上各项工作是 远远不够的,需要强调的是9为彻底解决发醋的染菌问题，必须从建厂初期的基 本设计抓起，这就要做到“发解设备、工艺管线的零染的率设计”。这个问题将在 以后的章节里重点论述。作为发酵岗位的消毒工，应该具有严格的工作责任心和较高的操作技能,但 是仅此是不够的。因为发醉染菌的原因极多，有人为的操作问题，有设备的泄漏 和死角，也有管理上的不当和混乱。在错综复杂的染菌原因面前，消毒工必须充 实自己的专业知识,在努力提高专业知识的同时,提高操作技能和分析解决问题 的能力；除不断认真总结染菌的教训外，还应当认真学习微生物学的基础知识,掌握微生物的生长生存条件以及致死条件;还应当掌握发醉设备的知识，懂得设 备的结构和原理，避免设备消毒中死角的形成。只有提高了技术理论水平和实 际操作水平，才能做到分析问题准确,采取措施得力，消灭染菌有成效。发酵罐一旦染菌，会造成很大的经济损失。从这个意义匕讲,我们是以经济 代价的付HI而换取教训的6因此重视分析Fl己及别人的染菌原因，教训互补尤 为重要。发酵的消灭染菌是从实践中产生的科学，足总结提高到理论，再回到实践中 去解决问题的小学科。官来可得半点便假，否则染的就会狠狠地教训我们。Tnis is trial version 2第1章 发酵过程染菌的防止因此实践一认识一再实践一再认识”是消灭染菌工作的座右铭，我们应该牢牢 记住这个真理C1.1 与消毒灭菌相关的名词解释微生物:是对所有形体微小，单细胞或个体结构为简单多细胞，甚至没有细 胞结构的低等生物的通称。发酹:指微生物活细胞在一定的培养环境中，分解、利用各类有机物质，生物 合成抗生素的过程。其主要特点是，单一微生物的培养过程,不允许任何杂菌的 污染。染菌:指发酵生产过程中污染了其他杂菌，破坏r单一微生物生长培养的 环境。培养基:是人工配制的用于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质。革兰氏染色法J884年丹麦微生物学者革兰姆(Christian Cram)发明的一 种细菌鉴别染色法。其过程为:涂片一干燥一固定一草酸铉结晶紫初染-碘液 媒染一95%乙醇脱色一蕃红复染-水洗燥，最后镜检。如常体呈深紫色，称 革止氏阳性菌(G+);如菌体呈红色，称革,纸阴性菌(G-)。真核细胞型微生物,其细胞内的细胞核分化较高，有核膜、核仁和染色体，细 胞内有完整的细胞器。主要指真菌中的酵母菌、霉菌、原生动物和单细胞藻类。原核细胞型微生物:这类生物的细胞中仅有原始的细胞核,没有核膜与核仁 的分化，缺乏细胞器。主要指细菌、放线幽，产甲烷细菌、蓝细的、支原体、衣原 体、立克次氏体和螺旋体等。非细胞型微生物:这类生物个体极小，不具备细胞结构，为蛋白质和核酸，只 能活在细胞内复制。如植物病毒、动物病毒、人类病毒和噬菌体等。芽泡:某些细菌在其生长一定阶段，在细胞内形成个圆形、椭圆形或圆柱 形结构，对不良环境及条件有较强抵抗性的休眠体。这种休眠体叫做芽洵。菌落.细菌在固体培养基匕生长繁殖，由于受国体表面或深层的限制而形成 肉眼可见的细菌群体称菌落。消毒:用物理和化学的方法杀灭物体上的病原微生物,使之不能成为传染源 即为消毒。消毒的概念来自于书生工作，指餐具、用具的消毒，环境的消毒等。换言之，消毒的作剧晕毁灭九起感集的病厚微生物，而不-定能毁灭一切微生物Tnis is trial version L1与消毒灭菌相关的名词解释 3和抱子口灭菌:用物理和化学的方法，杀灭和除去所右微生物的繁殖体和芽胞，使之 完仝无菌即为灭菌。换言之，灭菌的作用是指杀灭一切微生物及其抱子。杀菌:用物理和化学的方法，对微生物在短时间内起杀灭作用即为杀菌Q抑菌:指抑制微生物繁殖体的生长及繁殖，使其处于代谢抑制状态,遇适宜 环境还可恢复其生命活动。无菌试验;在纯种发醉过程中，检杏和发现有无杂菌污染，并鉴别杂菌类型，以便及时采取有效措施的,种方法。细菌的致死时间：指在一定温度下.杀死细菌所需要的最短时间。细菌的致死温度:指在一定时间内，杀死细菌所需要的最低温度。化学灭菌法:使用化学药剂进行杀菌的方法即为化学灭菌法。它的特点是 杀菌效果好Ml在使用时必须充分注意,化学药剂的适当浓度，合适的处理时间，微生物对化学药剂的敏感性以及对外界环境的影响。物理灭菌法:利用物理因素如高温加热、辎射射线、介质除滤或过滤、燥等 方法进行灭菌的一种方法。干热灭菌法:利用火焰及热空气杀菌的方法即为F热灭菌法。它的特点是 简单有效,但局限性大。适用于玻璃器皿、金属用具的灭菌。湿热灭菌法:根据灭菌物品的性质不同,选择不同温度的湿热蒸汽进行灭菌 的一种方法。原理是通过蒸汽加热，温度上升到细菌的致死温度,使菌体蛋白质 及酶类变性,凝固而死亡。汽化潜热：当被灭菌物体的温度比蒸汽温度低时，蒸汽在物体表面上凝结为 水，同时放出的热量为潜热，它能迅速提高灭菌物体的温度。消毒灭菌安全系数:以杀灭芽胞杆菌的致死时间为依据，在此基础上再增加 50%的余量，就等于消毒灭菌的保温时间。湿饱和蒸汽:在蒸汽输送过程中，由于一部分热量损失形成无数细微的水滴 混悬在蒸汽之中，称之湿饱和蒸汽。它的特点是热含量低，穿透力弱,灭菌效 果差。饱和蒸汽，饱和蒸汽的温度与水的沸点相当，当压力达到平衡时，此时蒸汽 中不含有微细的水滴。它的特点是热含量高，穿透力强，灭菌效果好过热蒸汽:蒸汽中的水分完全蒸发后，再继续加热，即成为过热蒸汽。其特 点是热含量高，曾帚鹊辎川4 第1章 发酵过程染菌的防止热对流:依靠液体或气体本身的流动而实现的热传递的过程叫做热对流。热传导:沿物体内部或物体与物体接触部分发生的热传递叫做热传导。辐射:能星通过空间传递称为辐射表压:管道内或容器内介质的压强在仪表上的反映。压强:作用于单位面积上的垂直力叫做压强。公式：p=F/A式中P压强；F法向力（垂直力），A面积。大气压：相当于760毫米汞柱所产生的压强，为一个标准大气压。以 0,1 MPa 表示。绝对压强：点压叮大气压之和为绝对压强。夕渔=H+p*它常用于工程的设计和计算。死角：在消毒灭菌过程中蒸汽高温所达不到或消不透的部位称死角，主要指 设备结构上的死角和人在操作中构成的死角两大类。物料流速：当物体在管路里流动时，在单位时间内从某一截面流过的距离,称为物料流速。物料流量:当物体在管路里流动时，在单位时间内从某一截面流过的体积,称为物料流量。介质除透:利用填充介质的密度拦截或捕集空气中微小尘埃及微生物的一 种方法。绝对过谑:过滤介质的空隙小于被滤除微生物或颗粒的直径,流体经过过滤 介质时微生物或颗粒被滤除，称为绝对过滤。相对湿度:在一定温度下,空气中水蒸气的绝对湿度与同一温度时水的饱和 蒸气压之比，叫做空气的相对湿度。通常相对湿度用百分数表示,若用力表示空 气的绝对湿度，用热和表示同温度下水的饱和蒸气压/表示相对湿度，则：中=立他和X100%绝对湿度:布林中有一部分盘水蒸午的压强,大气中水蒸气的分压就叫做Tms is trial 1.2灭菌方法的选择 5空气的绝对湿度。落点:降低空气的温度，可使空气中的水蒸气接近饱和。空气中水蒸气达到 饱和时的温度叫做麻点。介质的虚重度：即为填装介质的装易,可称填装重度6介质的实重度:即为填装介质的相对密度。介质填装系数:空气过滤器介质填装系数=填装虚升度/介质的实重度。过滤效率:被捕集的尘埃颗粒数与空气中原有的颗粒数之比。实罐消毒灭菌三要素：(1)需灭菌的没备、阀门及管路无泄獭，无堵塞，无死角(2)发酢罐冷却部位的冷水彻底汽化排除。(3)进发酵罐的蒸汽要分主、次。连续消毒灭菌三要素：(1)连消系统管路及阀门无泄漏,无堵塞，无死角。(2)严格控制打料流速,尤其是开泵吊5 min内的流速。(3)注意冷水开启时间，防止倒抽。以上与消毒灭菌相关的名词是从事发酵工艺及消毒灭菌操作的有关人员必 须掌握的基础知识，应当牢记。1.2 灭菌方法的选择发酵过程的消毒灭菌，是要辘固微生物细胞内的蛋白质，钝化其酶系统，造 成细胞及其微生物的死亡，而达到有目的地培养单一微生物的良好条件。换句 话讲,发酢过程的消毒灭菌，既是发醉工艺的首要选择，又是发酵消毒上的最基 本工作职责。消毒灭菌属于工艺操作的科学范畴，它既有基础理论知识，又包含着丰富的 实践经验，两者的有机结合是使这一专业知识升华、提高的根本。常用的消毒火 菌方法有两大类，一类是化学灭菌法，另一类是物理灭菌法。关于这两大类方法 阐述如下。L2.1化学灭菌法化学灭菌丐般胆鬻母剂法)6手册8#是可以杀死致病和 6第1章 发酵过程染菌的防止其他有害的微生物的化学药品，均称为化学消毒剂。在使用化学制剂杀菌的时候，必须充分考虑以下:个要素。(1)药剂的浓度。适当的药剂浓度可以杀菌，低浓度的药剂是抑菌剂，高浓 度的药剂则能凝固细胞膜表层，或其周围的蛋白质，从而影响渗入微生物体内的 能力达不到灭落的目的。(2)处理时间的长短。一般药剂作用时间越长,杀菌效果越好。但在停止 药剂消毒，开始无菌操作后,则受到时间的限制。工作时间越长，带人杂菌的可 能件也就越多。3)细菌的敏感性”不同的微生物对各种消毒剂有不同的敏感性，这主要 与微生物的细胞结构有关。在发醉工业生产中，常用的化学消毒剂有以F几种：石炭酸。2%5%的溶液是常用的消毒剂，用于器械和环境的喷雾消毒。来苏尔比石炭酸对皮肤的刺激性小,2%的溶液用于皮肤消毒。乙醇。乙醇的杀菌力和浓度有关，常用70%的乙醇作为皮肤消毒用。浓度 过高，会使菌体表面形成一层膜，影响乙醇进入细胞体内,达不到灭菌的效果。甲醛(福尔马林)。主要是气体杀菌。在发酵生产中常用于染菌罐的处理和 发解厂房内部环境的定期消毒灭菌上。一般每立方米空间可用10 mL甲醛。因为甲醛有强烈的刺激气味，同时乂有凝固蛋向质的作用,所以使用时要特别注 意安全，尤其防止甲醛溅人眼睛。新洁尔灭。只有在稀释浓度小的时候才有杀菌作用。一般5%原液使用时 稀释为0.25%的水溶液,在发酹生产中常用于无菌室的喷雾消毒和皮肤、器械 的表面消毒。漂白粉。10 mL漂白粉加水100 mL配制成的10%溶液，常用于环境及发 酵车间内的下水道、地沟等污染源地段的消毒。由于化学药剂在使用上受到三要素的约束，所以化学灭菌法就直接涉及灭 菌的区域性和灭菌的彻底性，并且化学药剂价格较昂贵，因此化学药剂灭菌法在 发醉的工业生产中,只能用于无菌室或实验室的净化消毒灭菌，或用于发酵车间 的环境消毒灭菌,而不能应用于发醉工业生产的设备和物料的消毒灭菌.1.2.2物理灭菌法物理因素指阳曷辐射、干燥、4滤Q温厚等方面。用这些方法进行消毒灭菌Tnis islnal version 1.2灭菌方法的选择7就是物理灭菌法。辐射 能量的空间传递称为轿射,与微生物学有关的射线是可见光、紫外 线,X射线、了射线。利用辐射杀菌的原理是:大多数微生物除光合细菌外，均不 需要光线，它们在黑暗中上长良好。太阳光直射能杀死许多细菌，紫外线有较强 的杀菌作用q紫外线的波长范围是150390 nm,其中波氏为260 nm左右的紫 外线杀菌作用最强。由于紫外线的穿透力差，容易被固形物吸收，不能透过普通 的玻璃,并且对深层、内部的微生物灭菌效果很差，因此紫外线一般用于无菌室 的环境空间及表面的消毒，它是种简单易行的灭菌方法。干燥 微生物正常生活需要水分，细胞失水将降低代谢活动，同时细胞内 盐分浓度增高或蛋白质变性，从而导致牛命活动的降低和死亡。微生物在干 燥条件下，代谢处于抑制状态而并未死亡c 一般干燥方法普遍应用于食品的 保存。过滤 在发酵生产中使用过滤的方法只能吸附、拦截细菌，不能灭菌。如空 气过滤器中的颗粒活性炭和超细纤维纸以及高效膜滤芯等过滤介质，只能起到 吸附、拦截细菌的作用。在这些过滤介质中，当尘埃和微生物积累达到饱和的时 候，必须使用蒸汽对过滤介质进行定期消毒灭菌，以达到吸附、拦截不失效果的 目的。温度 温度对微生物的生长代谢影响极大。适当的温度能促进微生物代谢 及生长，而低温起到抑制微生物生长的作用，高温起到杀菌的作用。在高温杀菌 过程中分为两种方法，即干热灭菌法和湿热灭菌法。干热灭菌法它是利用火焰和热空气进行灭菌的一种方法。直接可以在火 焰上烧灼灭菌的有金属接种针、钩，试管口，二角瓶口等。在发酥生产中，种子罐 的接种普遍采用火焰保护开口式接种法。不能直接利用火焰进行烧灼的有棉塞 和玻璃器皿，这些可以放入烤箱，利用热空气进行杀菌。干热灭菌法简单有效,但局限性很大，所以不能用于发酵生产的消毒灭菌。湿热灭菌法 它是根据灭菌物品的性质不同，选择不同温度的湿热蒸汽进 行灭菌的一种方法。湿热灭菌的原理是,通过蒸汽加热，温度上升到微生物致死 范围，菌体蛋向质和酶类变性、凝固而死亡。在同一温度下，湿热比干热灭菌效果好.这是因为在湿热条件下，菌体吸收 水分，蛋白质容易在高温F凝固。凝固蛋白质所需要的温度与蛋白质的含水量 有关，如表1-1所示。This is trial version 8第1章 发酵过程染菌的昉止表1-1蛋白质含水量和凝固温度关系蛋白质含水量/%30 min内凝冏温度/。50562574 801880-906145016gl70由及 1-1可以看出，蛋白质含水分越多越不耐热;在同一温度下，湿热灭菌 使菌丝及蛋白质易于凝固。同时，湿热蒸汽的穿透力要比一热蒸汽的穿透力强得多，如表1-2所示。表1-2干热与湿热的穿透力比较温度/X时间,/h透过布层温度八：20层4。层100层干热130-1404857270以下湿热105.331011011 101.55由表1-2可以看出，湿热要比干热的穿透力强得多，主要表现在温度上几 乎不因层次的多少而受到影响。同时，湿热蒸汽制取简便，获得量大，成本低廉。总而言之，我们可以得出这样的结论，湿热蒸汽布较强的穿透力，能够杀死 各种细菌包括耐热的芽泡杆菌，而11来源经济、方便，所以在发酵生产的设备、物 料消毒灭菌操作中被广泛地采用。1.3消毒灭菌工艺控制点选择的依据发酵生产过程中的消毒灭菌之控制点，指的是发醉设备、物料及相关的消 毒灭菌的温度、压力、时间的控制，以及与此相关的特定操作方法的选择。作为 i名消毒工要清楚地知道，消毒灭菌工艺控制点的产生，是全面考虑了发酵过程 的各方面因素和长期实践经验的积累而作出的规定。那么，消毒灭菌工艺控制 点是怎样选择的，依据是什么呢？首先应该关注以下几个问题:被消毒灭菌物料 的性质,消毒灭坪物备及特殊易消毒珞菌物料的体积，细菌的致死温度和致Tms is trial version L3消毒灭菌工艺控制点选择的依据9死时间，总蒸汽的质景和压力以及消毒灭菌后营养成分的破坏。下面就以上六个问题逐一进行阐述。1.3.1 被消毒灭菌物料的性质微生物发酵是通过菌种在消毒灭菌后的培养基中生长代谢的一个过程，不 同菌种的发醛布着不同的培养基原材料成分的内容。综合培养基的成分不外乎 碳源(C)物质、氮源(N)物质、无机制类、前体以及微量元素.因此，不同的培养 基原材料，就应当使用不同的灭菌方法。培养基中的送门质含量越高，微中物被杀死的速度越慢。因为，蛋白质在加 热时，凝固在菌体外面形成层膜，增强了菌体对外界不良环境及条件的抵御 力c所以，在发酵培养基消毒灭菌中，凡含氨量较高的物质，如玉米浆，熬质粉、萩质水、花生饼粉、黄豆饼粉、蛋白陈等原材料，均要特别注意控制消毒的温度、时间、压力。在培养基基础料和中间补料液消毒过程中，往往会遇到两种情况，-种是易 于消透的物料，另一种是难于消透的物料c比如，发酵工艺上为了获得较好的发 酵效果，往往在培养基配比和配方I二采用高糖、高氮、高浓度的丰富培养基。这 种丰富培养基在消毒灭菌过程中，不可以采用高温、高压、长时间，否则营养成分 会受到极大的破坏。但是,如果按照相对纯净的物料进行灭菌，丰富培养基中的 大量细菌是不会彻底杀灭的。丰富培养基中的玉:米浆、萩质粉等物料本身就含 有大量的蛋白质并且寄生大量的杂菌，尤其是芽花杆菌。所以，在消毒灭菌这类 物料的时候，一方面要照顾到营养成分的最少破坏，另一方面还要充分考虑细菌 的致死温度及致死时间，以此制定消毒灭菌的温度、时间和压力，从而取得无菌 的效果“以实罐消毒为例，以上这样的物料，加热升温40 min,控制125 0.12 MPa压力，保温30 min就可以了.消毒灭菌易于挥发的物料，如尿素、硫酸铉等，这些物料本身相对比较纯净,物料本身含杂的相对较少；同时，高温灭菌又会破坏以L物料本身的成分。所 以，当消毒以上物料时，应以较低温度、压力和较短时间为宜。仅以实罐消毒为 例,就可以控制加热升温20 minJ05七110匕,0.05 MPa压力，保温10 min 就足够了。对于一般葡萄糖、淀粉、花生饼粉、无机盐类的培养基,一般配制后浓度比较 小，物料本身和鬻鬻比酣都毒这种物料时，以10第1章发酵过程染菌的防止实罐消毒为例，只要加热升温40 min,控制120,0.100.12 MPa压力，保温 20 min就可以了 c再比如，对空气过滤设备进行消徐火菌，空气过滤器中的基本介质以活性 炭、棉花、跛璃棉或者超细纤维纸为主，这些介质本身具有吸附、拦截尘埃和微生 物的作用，当容生量达到饱和数址时，容易产生拦截失效.所以,定期对过滤设 备进行消毒,是非常必要的，而且空气过滤器长时间处于无菌空气的压力之下,对空气过滤器的消毒一般控制在0.12 MPa J20 X：,30 min。对高效膜过滤器的消毒，更应当慎重选择火菌控制点。因为,高效膜的材质 大部分采用聚四氟乙烯(PTFE)制造，这些材质本身遇热后易变形。所以，在对 高效膜过滤器消毒时，采用0.10 MPa,115 t,30 min就可以了。综上所述，不同性质的原材料，不同的培养基及介质内容，应当选择不同的 消毒灭菌控制点，千万不可生搬硬套i个模式、一个方法，同时-一定要避免自目 地使用高温、高压、长时间消毒灭菌的方法。1.3.2 消毒灭菌的设备及特殊点消毒灭菌的设备，在这里泛指发酵的设备及-切管路。特殊点指的是设备 结构上不容易消透或容易产生死角的地方，另外还包括设备的严密度和设备的 维修。消毒灭菌前要充分考虑发酵设备的具体结构。比如，发酥罐容积的大小，罐 体内的不同结构,发醋罐各种管路的接管形式，罐内的管路连接,各管路的蒸汽 连接及蒸汽量的保证，都是制定消毒灭菌工艺点应当充分考虑的部位。更应当强调指出的是，发醉罐的夹层和蛇形管内的积水是否彻底排除干净,是制定消毒灭菌开始加热时间的关键所在.许多工厂，为r增加产量，使发酵罐 容积增大，随之罐内冷却面积也增加，由此带来冷却设备内的大量积水无法排 除干净的问题。在制定消毒灭菌工艺控制点时要考虑这一点，在设备改造方面 也要充分注意这一点。同样，连续消旗系统设备以及物料连消，一定要充分考虑设备内易于结垢形 成的死角，即要充分考虑连消设备的席式。比如，连消塔及维持罐在连续高温状 态下易于构成焦化物，它同时乂构成染菌的威胁.另外，连消塔及维持罐设备的 结构形式、径高比例、管径及接管方式都同时存在着染菌的威胁。因此,适当地 控制连消时的物闱葆展和物料温度,是在制定消毒灭菌工艺点上着重考虑的。This is trial version 1.3消毒灭菌工艺控制点选择的依据 11发酵设备平时的正常维修是消毒灭菌过程中必须考虑的基本点，比如，阀门 的更换，填加密封填料，更新罐内外配件设备及管路等等，都需要适当地提高消 毒灭菌的安全系数。1.3.3 消毒灭菌物料的体积消毒灭菌物料的体积指的是培养基配制后的物料体积Q本节研究不同物料 体积在饱和蒸汽灭菌时的升温、升压及时间控制的关系C不同的物料体积有着不同的升温时间，如发1-3所示，表1-3培养基物料体积和升温时间关系物料体积/mL502005001 0002 000升温121 2所需要的时间/min1381220表1-3是在蒸汽压力为1 kgf/cm?时所做的摇瓶试验数据。在工业生产 中，蒸汽压力要大于1 kgf/cm?,而物料体积也远远大于以上的摇瓶装量，所以衣 中数据仅供参考。但根据段中试验结果可以说明培养基物料体积与升温的一般 关系，在发醉设备中进行消毒灭圜,就应当充分考虑物料体积。如，实罐消毒灭 常要考虑实消物料体积的升温过程，以及假压力是否彻底排除的时间；而连续消 毒灭菌的过程则要充分考虑物料消毒的流速控制，以此确立消毒灭菌的匚艺控 制点。1.3.4 细菌的致死温度和致死时间利用温度杀死微生物需要一定的标准厂,般采用致死温度和致死时间为 标准。致死温度是在一定的时间内，杀死细菌所需要的最低温度.致死时间是在 一定温度下，杀死细菌所需要的最短时间。致死温度和致死时间表示在杀死细胞的作用中，温度和时间的关系。利用 温度杀死细菌时必须知道微生物的致死温度和致死时间，检验某一微生物的致 死温度时，还应当充分考虑它的生K环境和生长条件。微牛,物对高温的忍受力.因其本身的细胞本质和环境条件而有所不同。细 12 第1章 发酵过程染菌的防止胞本质包括遗传木质、菌龄和数目。环境条件包括培养基成分的组成及pH,就消毒灭菌而,包括细菌生存的场合以及设备中所构成的死角，以上这些都影 响并广扰细菌的致死温度和致死时间。营养细胞的抗热力一般不强，而芽的细菌有较强的抗热力，如表1-4所示。表1-4营养细胞和芽菊细菌抗热力比较细菌的种类致死温度/匕致死时间/min解母苜养细胞50605-10大肠杆萧6010肺炎球的5657枯草芽泡杆菌1006-17嗜热脂肪芽胞杆菌12012由表1-4可以看出，各种微生物的抗热力相差很大，除芽胞和嗜热性细菌 的营养细胞外，在液体培养基中生长的大多数细菌，在65 下处理30 min都会 死亡，大多数寄生细菌在60 T下处理10 min也会死亡，而酵母菌和霉菌的抗热 力更爰。在发酵生产的培养觅和发酵设备之中，寄生并繁殖着大量多种的细菌，以杀 灭群体细菌的死亡率为灭菌指标时，就应当充分考虑各种细菌的不同致死温度 和致死时间，并选择其杀灭芽胞细菌和嗜热性细菌的致死温度及致死时间，制定 消毒灭菌工艺控制点。还应当指山，在根据杀灭群体细的的死亡率为灭菌指标时，消毒灭菌的时间 越长，被杀灭的微生物百分率也越高，这是从灭菌角度而言的6但从发醉培养基 营养成分的破坏及损失来说，消毒灭菌的时间越长，温度越高，培养基营养成分 破坏也越严重。所以，消卷灭菌匚艺控制点的选择，应当在充分灭曲的前提下,尽可能地减少培养基营养成分的最少破坏，如，实罐消毒灭菌控制120 20 min,其消后培养基的发酵水平要高于实罐消毒灭菌控制120;30 min的对 照，同样取得灭菌的效果。L3.5总蒸汽的质和压力既然使用蒸汽作为发酥生产过程中消毒灭菌的主要手段,那么蒸汽的质员 和蒸汽所达到的曲鬻辑瞥捕接乎金相效果。1.3消毒灭菌工艺控制点选择的依据 13蒸汽的质量由以下二种情况定性：（1）湿饱和蒸汽。即蒸汽中带有定的水分,常由于蒸汽输送管路中热量 损失而造成。因此，在蒸汽中混悬着无数微细的水滴，此时蒸汽的热含量较低,穿透力较差，灭菌效果也较差。（2）饱和蒸汽。即蒸汽的温度与水的沸点相当，当蒸汽的压力达到平衡时,蒸汽中不含有微细水滴。饱和蒸汽的热含量较高，穿透力较大，因此灭菌效果也 较好。（3）过热蒸汽。蒸汽中液态的水完全蒸发后，再继续加热即成为过热养汽.过热蒸汽与卜热状态和似，在*力不变，温度继续I:升的情况下，蒙汽温度虽然 比饱和蒸汽温度高，但穿透力差,因此,灭菌效果也不如饱和蒸汽。从以二：种性质的蒸汽看出，饱和蒸汽有较高的热含量，较强的穿透力，同 时饱和蒸汽存在着潜热（潜热即为蒸汽变为水的同时所放出的热量兀当被消毒 火菌物体的温度比蒸汽温度低时，蒸汽在该物体的表面凝结为水，同时放出潜 热.这种潜热能迅速提高物体的温度,达到杀灭该物体杂菌的目的C所以，在制定消毒灭的工艺控制点的时候,必须充分考虑蒸汽的性质。有些 工厂白己烧锅炉产牛.蒸汽，蒸汽压力波动很大，同时蒸汽中含水量大，温发达不 到要求，基本属于湿饱和蒸汽的类型。使用这种性质的蒸汽，一方面要注意消毒 灭菌过程的压力、时间、温度的控制，与此同时还要注意使用蒸汽时的进度调整,避开蒸汽使用的高峰，进行发酵罐的消毒火菌。使用这种性质的蒸汽进行灭菌,主要是由于蒸汽锅炉设计不合理，供汽与产汽量不匹配，蒸汽管路设计不合理以 及供热系统管路隔热措施不好造成的。因此，进行以上诸方面的设备改造是保 证消毒灭菌完全彻底的当务之急！饱和蒸汽的温度与压力的相关关系如表1-5所示.表1-5饱和蒸汽的温度与压力的关系蒸汽压力/（kgf/cn?）相当温度/c0.352107.70.703115.51.055121,61.406126.61.758130.52409 m.134.4-f This is trial version 14第1章 发酵过程染菌的防止从表1-5可以看出，饱和蒸汽的温度是随着压力的变化而变化的，压力越 高，温度也随之上升。在发酵过程的消毒灭菌工艺上,一般地，实罐消毒灭菌时 总蒸汽压力最低应维持在3 kgf/cn?以上,而连续消毒灭菌时总蒸汽压力最低 也应维持在4.3 kgf/cm?。如果低于以上要求压力,在制定消毒灭菌工艺控制点 时,就应当认真修改了。在消毒灭菌过程中,经常使用的压力单位有以下儿种：（1）表压。即管路或容器内的介质工作压力，单位是kgf/cm（2）大气压。相当于76 cm或760 mm汞柱的大气压。1 个大气压=1.033 6 kgf/cm（3）绝对压力。即大气压与表压之和。（4）磅/英寸、英制单位，其换算为1 kg，cmz=14.696磅/英寸二目前在消毒灭菌过程中所使用的压强单位均以公制单位kgf/cm?标识并计 算，在旧版本的书籍中以英制压强单位磅/英寸2来表示，见表1-6。表-6磅/英寸z和kgf/cn?对照表磅/英kgf/cm2磅/英寸;kgf/cm2磅/英寸2kgf/cm210.070 31J0.773 421L476 520.140 6120.843 722 IL516 830.210 9130.914 023!1.617 140.281 2140,984 3241.687 450.351 5151,054 6251.757 750.421 8161.124 9261.828 070.192 2171.195 2271.898 780.562 5181.265 52S1.968 6g0,632 8191,335 8292.038 9100,703 1201.406 1302.109 2从以上可以得出如下结论:发醉的消毒灭菌必须卜分重视蒸汽的质量，在制 定消毒灭菌工艺控制点的时候，必须充分地保证以匕提出的各项基本条件。如 果达不到以上条件,就应当从设备装备方面着手，重点解决供汽质量及供汽量平 衡问题，这才是窜耨衣醉消灭染舱止确/法。.Tms is trial L3消毒灭菌工艺控制点选择的依据151.3.6消毒灭菌后营养成分的破坏在抗生素发酵生产中，既然采用蒸汽灭菌方法来杀灭培养基中的杂菌，那么 在高温蒸汽灭的的同时，培养基营养成分必然受温度的影响而产生某些化学变 化。消毒灭菌的时间越K,温度越高,营养成分遭到的破坏也越严重，甚至会改 变原有的培养基成分而影响生长菌的代谢。在高温灭鬲的条件下，同样会产生 一些对生长菌代谢方毒有害的物质。以I:这些都会影响培养基的质量，从而对 发酵过程和抗生素的合成产生极大的负作用。因此，在合理选择消毒灭菌工艺 控制点的同时，理所应当地要充分考虑培养基营养成分的最小破坏.在培养基成分中，糖类物质在高温灭菌中是最容易引起破坏的，特别是还原 糖和有机氮源,起加热消毒时，更容易引起化学变化。糖类物质包括葡萄糖、液糖、糖化母液、蔗糖以及淀粉等。尤其当糖化母液、液糖的补料:艺广泛推广应用以后，糖类物质的消后质量更为工艺控制上的关 注焦点Q葡萄糖和有机氮源共同加热灭菌，生成5-羟甲基精辞和棕色的类黑精，氨 基酸在这些化学反应中具有催化作用，可以大大加速葡萄糖的分解速度，而分解 出来的醛氨化合物是有毒物质,会引起微生物生长能力的明显改变，严审时完全 抑制微生物的生长和繁殖。有一些消毒工在消毒灭菌操作中，为了单纯地避免染菌，而采取了高温、高 压、长时间的不合理操作方法，消后的糖或培养基颜色为黑褐色，这样的糖或培 养基造成抱子不成活，发酹过程代谢异常，补料过程代谢数据混乱，发醉产量降 低。同样因为高温灭菌，乂会造成糖类物质或氮源中的玉米浆被焦化，黏结而产 生结垢，致使消毒罐内形成死角，焦化物脱落乂会造成管路、阀门的堵塞，以致造 成恶性循环,这是造成大面积染菌的主要原因。为了避免糖类物质和其他物料成分在蒸汽灭菌时所发生的化学变化，有些 工厂采用葡萄糖单独分消的办法，避免糖类物质所遭受的破坏，以保证消后质 量。这种方法人为地造成操作环节以及设备流程的复杂化,从消灭染菌角度上 讲,这样的操作需要慎之又慎。目前有一些发酵匚厂，为保证培养基营养成分不被破坏，采用液体膜过滤除 菌的方法。此种工艺流程在设备选择、除菌机理、操作环行上都存在着很多值得 探讨的问题，耐迷使用胰过滤代替蒸冷灭菌，从装备的使用周期，投入成本而Tnis is trial version 16第1章发酵过程染菌的防止者更应当慎重权衡。在培养基成分中，无机盐成分之间在高温灭菌时也会相互作用，生成不利于 生长菌代谢的物质。如,磷酸盐和碳酸钙在高温蒸汽作用下，生成不溶于水的磷 酸盐，致使可溶性磷酸盐的浓度下降,从而影响培养基中磷的含量，进而影响生 长菌的代谢变化和抗生素的合成产量。综上所述，消毒灭菌只是发酵工艺中的一个重要环归而发酵的最终目的.是为了获得较高的抗生素产量。为这个目的,就应当在消毒灭菌的前提下，尽 最大的可能减少培养基营养成分的破坏，而不只是单纯地为了降低染菌率，采取 不合理的灭菌方法。使用这种方法即使染菌率再低，乂有什么实用价值呢？在 消灭染菌的工作中，讲究的是科学性、实用性，而不是肓目性。L4染菌的菌型分类和杂菌的生存条件在抗生素发薛生产的过程中，要消除染菌这个隐患，作为发酵午间的工艺人 员及消毒J首先必须掌握微生物的基础奴识。根据发醉过程中被污染的杂菌 甫型,分析它们的生存条件、存活特点、存活环境，以及针对杂菌这些特点采取相 应的灭菌措施。1.4.1 微生物的生存条件发酵过程中经常污染的各类杂前，是微生物门、纲、类中的某种或是几种。如细菌类的长、短杆菌，球菌及芽他杆菌等，真菌类的酹母菌、霉菌等。各类微生物都具有它自己的牛.命活动规律。即不断地从外界吸收营养物质 加以利用,从中获得能量并令成新的细胞物质，同时排除废物.因此，微生物生 长繁殖过程中，形成了它H己的新陈代谢过程，而这个代谢过程则9周闹环境有 密切的联系。这里提到的周围环境指的是，微生物的最适生长温度,微生物的致死温度和 pH适应范围。1.微生物生长的最适温度温度对微生物的影响极大，因为微生物的生长、发育是一个极其复杂的生物 化学反应。这种反应需要在一定的温度范围内进行，所以温度对微生物的整个 生命过程，都有苗源重要的影响1-1 This is trial version 1.4染菌的菌型分类和杂菌的生存条件17最低生长温度，指的是微生物生长和繁殖过程中的最低温度。在此温度时,微生物牛.K缓慢;低于此温度时，微生物就不能生长，虽然低温能使一部分微生 物死亡，但大部分微生物在歧低温度下，新陈代谢活动减弱或降低，菌体处于休 眠状态，生命力仍然保存0在抗生素发酵的菌种保藏匕我们采取真空、冷冻、r 燥方法保存,就是根据这个道理。最适生K温度,指的是微生物工长的最适合温度。在这个温度时，其他生长 条件适应并巳不变，此时微生物生长代谢最快。一般微生物生长最适温度在 25 t37 C,在抗生素发酵生产上，我们常使用的菌种最适合生长温度在 27t30 3最高生长温度,指的是在其他生长条件不变时，微生物能够存活的最高温 度。高于这个温度，微生物生命活动就要停止，甚至死亡。认真分析微生物的最适生长温度，对寻找抗生索发醉过程中发生的杂菌污 染，分析染菌的原因，具有一定的参考价值，见羡1-7。表1-7各类杂菌所适应的温度范围杂菌的半称适应温度的范围最低最适最高枯草芽胞杆菌15303755嗜热芽抱杆菌526575大肠杆菌1030 3743灰绿葡萄施霉菌015 2 535酵母菌j 0.52g 30402.微生物生长的致死温度微生物在超过了最高生长温度以11的环境中生活，就会引起死亡。温度越 高，死亡越快。微生物对高温的抵御能力，因微生物的种类、发育时间、有无芽胞 而异。微生物在高温下死亡是由于微生物菌体中的酶遇热后失去活性,使新陈代 激发生故障引起的在发醉匚厂的灭菌工作中,利用温度杀灭微生物，则需要一 定的标准，一般采用致死温度和致死时间为标准。在发怫工业生产的灭菌过程中，以杀灭群体微生物的死亡率为指标时，时间越 长,被杀灭微生蝌百分率也就理高，表18是各类杂菌的致死温度范围表.This is I nal version 18第1章 发酵过程染菌的防止表1-8各类杂菌致死温度范围条菌名称致死温度/七.致苑时间/mm嗜热芽抱杆葭12012枯草芽泡杆前100617大肠杆菌6010肝炎原阚S65-7醉母菌50 605-10由表18可以看出，不同的微生物对热的抵抗能力不同。解母曲、霉菌对 热较敏感，一般的细菌对热也较敏感，但芽布杆菌和嗜热芽胞杆前的抗热能力很 强。所以，分析杂菌的致死温度范围,时寻找染菌的原因和杂菌的存活环境，也 是有一定参考价值的。3.微生物生长的最适pH生长环境中的pH,与微牛.物生命活动有密切的关系。因为pH不同，微生 物原生质膜所带的电荷不同，原生质膜具布胶体性质。在一定的pH内,原生质 带正电桁;而在另一种pH内，则带负电荷，这种正负电荷的改变，同时又用起原 生质膜对个别离F渗透性的变化，从而影响微生物对营养物质的吸收，醯的形成 及其活力，代谢途径和细胞膜透性的变化。在抗生素发醉过程巾，控制发酵液的pH,是工艺控制指标之一.pH过高或 过低，都会影响代谢产物的积累。而发酵罐一旦发现染菌，也直接表现在pH的 突然变化匕 表-9列卅了几种杂菌生长的最适pH。表1-9各种杂菌生长的最适pH杂菌名称最适pHpH范圉细菌6,5 7.53.8-12毒酒4,0-5.81,5-8,5薄母蔚3,86,02.5-8.0由表1-9可以看出，细菌生长的pH范围在49,最适pH为7,或微碱性。而霉的和酵母菌生长的PH范围在27,最适pH为5,或微酸性。分析杂菌的 最适生长pH和生长的pH范围,对寻找染菌原因和杂菌的存活环境，具有一定的参考价值。This is trial version 1.4染菌的菌型分类和杂菌的生存条件191.4.2各类微生物存活的环境各类微生物除r有它自己所需要的匕氏条件,如温度、ph、致死温度和致死 时间之外，还要注意到，在抗生素发酵的.工业生产中，杂菌易于存活的环境，从而 针对它们的特点彻底杀灭它.下面把抗生素发酵过程中，经常感染的几种杂菌的易于存活的环境分析 如下.1,酵母菌酵母菌是单细胞的微生物，属真菌类。一般来说，是无鞭毛的不活动的真 菌，通常以出芽方式进行无性繁殖。酵母菌的形态多样,有球形、椭圆形、卵圆 形、腊肠形等，酵母菌的细胞较细菌大，一般在15X530 ptm。25匕是酵母菌生长的 最适温度,低于或高于这个温度，都不适于抱手的生长。醉母菌的生长条件必须有充足的氧气和较高的湿度,在含糖较高,pH中性 或偏酸性的培养甚中，醉母菌生长旺盛,pH高能抑制酢母菌的生长。醉母菌的抗热试验结果是,把装有酹母菌的试管，放入loo 4c的沸水里，煮 沸5 min,冷却后培养。经考察发现,试管里的酵母菌全部杀火。试验证明，