免疫组化步骤整理稿.doc

免疫组化步骤：
1、 二甲苯Ⅰ15min，
2、 二甲苯Ⅱ15min，
3、 100%酒精Ⅰ中2min
4、  100%酒精Ⅱ中2min
5、 95%酒精Ⅰ中2min
6、 95%酒精Ⅱ中2min
7、 85%酒精中2min
8、 75%酒精中2min
9、 流动自来水洗2min
10、 蒸馏水洗2min
11、 室温下，将切片放在H2O2-30%甲醇溶液中（97mL+3）处理30min
12、 1XPBS漂洗3×5min
13、 将切片放在柠檬酸钠缓冲液中，121℃,高压20min,降至室70度后，从高压锅内取出自然冷却20min
14、 1XPBS漂洗3×5min
15、 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在室温下用PBS稀释的5%正常小牛血清封闭30min
16、 吸去封闭液，滴加按适当比例稀释的单克隆抗体，切片放于湿盒中于4℃下过夜处理
17、 次日，将湿盒从冰箱中拿出室温回温30min
18、 用PBS漂洗3×5min
19、 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在室温下，将切片用二抗中孵育60min
20、 PBS漂洗3×5min
21、 将切片在蒸馏水中放1-2min
22、 洗完后用吸水纸吸干组织块四周的液体，然后在组织切片上滴加DAB底物反应液，湿盒中避光显色30min（根据自己试剂盒时间而定）
23、 将切片在蒸馏水中放1-2min
24、 流动自来水冲洗5min
25、 切片经Mayer’s苏木素染液复染30s
26、 流动自来水5min
27、 100%酒精脱水3X3min
28、 二甲苯透明3X5min
29、 中性树胶封片

试剂配制：
1:1XPBS 氯化钠，8g +氯化钾，0.2g+十二水合磷酸氢二钠，3.63g+磷酸二氢钾，0.24g-----100ml蒸馏水
2：柠檬酸磷酸盐缓冲液
0.1M 柠檬酸/枸橼酸：21.01g柠檬酸加入1000ml蒸馏水中
0.1M柠檬酸钠/枸橼酸钠：29.41g枸橼酸钠加入1000ml蒸馏水中
0.01M Ph5.0的柠檬酸磷酸盐缓冲液配制：
9ml0.1M 柠檬酸/枸橼酸+41ml0.1M柠檬酸钠/枸橼酸钠 加入到450ml蒸馏水中