基因工程操作步骤复习课程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程操作步骤,一、目的基因的获取,1,目的基因主要是,编码蛋白质的基因,：,如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相,关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、,与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的,基因、具调控作用的因子等。,2,获取目的,基因,的常用方法：,1、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,调控遗传信息表达,上,游有,RNA,聚合酶结合位点,:,基因结构,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有,RNA,聚合 酶结合位点,(,启动子,),。,与,RNA,聚合酶结合位点,基因结构,1.,从基因文库中获取目的基因,1.,基因文库的概念,:,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。,2.,基因文库的种类,:,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库,某生物体内全部,DNA,许多,DNA,片段,受体菌群体,限制酶,与运载体连接导入,基因组文库,cDNA,反转录,受体菌群体,与运载体连接导入,cDNA,文库,某种生物某个时期的,mRNA,真核细胞的,cDNA,的获取,编码区,非编码区,非编码区,DNA,聚合酶,剪接有关的酶,RNA,聚合酶,mRNA,前体,mRNA,单链,DNA,cDNA,逆转录酶,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码序列,。即不含,非编码区,和,内含子,基因组,DNA,文库与,cDNA,文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子（具有启动作用的,DNA,片段）,基因中内含子,(,位于编码蛋白质序列的非编码,DNA,片段）,基因多少,物种间的基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物,mRNA,，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,2.,利用,PCR,技术扩增目的基因,1,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术。,2,原理：,DNA,复制,原料：,模板,DNA,；,DNA,引物；四种脱氧核苷酸；热稳定,DNA,聚合酶,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,3,前提：,已知目的基因的一段核苷酸序列,PCR,技术的操作过程,a,、,DNA,变性,（,90-95,）：双链,DNA,模板在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火,（,复性,55-65,）：系统温度降低，,引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶,的作用下，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,d.,重复,a.b.c,步骤：每重复一次，目的基因增加,_,倍,一,5,/,3,/,G,G,T,C,3,/,5,/,G,A,C,C,5,/,3,/,引物,G,G,变性,复性,延伸,1.,目的基因,DNA,受热变性，解链；,2.,引物与单链互补结合；,3.,合成链在,DNA,聚合酶作用下进行延伸。,5,/,3,/,A,G,引物,过程：,PCR,技术的操作过程,PCR,反应体系中目的基因成,指数,(2,n,),形式扩增,PCR,技术扩增与,DNA,复制的比较,DNA,复制,PCR,技术,场所,原理,条件,解旋方式,酶,特点,结果,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、,引物,DNA,在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、,边解旋变复制,半保留复制、,全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的,DNA,片段,形成整个,DNA,分子,热稳定的,DNA,聚合酶,细胞内的,DNA,聚合酶、解旋酶、,DNA,连接酶等,PCR,技术扩增过程,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,断裂，形成,_,b,、复性（,55-60,）：系统温度降低，引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,3.,人工合成法,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用,DNA,合成仪人工合成,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,思考：,化学法合成的目的基因含,内含子、启动子和终止子,吗？,人工合成法,（,真核生物,）,反转录法,目的基因的信使,RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使,RNA,序列,基因的核苷酸序列,目的基因,合成,推测,推测,单链,DNA,合成,课堂小结,目的基因的获取,1,、从基因文库中获取,2,、利用,PCR,技术扩增,3,、人工合成,种类,基因组文库：,含有一种生物的,全部,基因,部分基因文库：,只包含了一种生物的,部分,基因，,如：,cDNA,文库,二、基因表达载体的构建,基因工程的核心,1,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可,以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达,和发挥作用。,2,基因,表达载体,的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,二、基因表达载体的构建,核心,（,1,）用一定的,_,切割质粒，使其出现一个切口，露出,_,。,（,2,）用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,（,3,）将切下的目的基因片段插入质粒的,_,处，再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,1.,过程,:,基因表达载体的构建,核心,质粒,DNA,分子,一个,切口,两个,黏性末端,两个,切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,表达载体,过程,:,基因表达载体的构建,基因工程的核心,1,、目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2,、基因表达载体的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,它们各自的作用是什么,?,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,3.,基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,位于基因的首端,是,mRNA,结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,三、将目的基因导入受体细胞,1,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞,内维持稳定和表达的过程。,2,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌,和动植物细胞等。,3,目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,1,）农杆菌转化法,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,2,）基因枪法：,目的基因导入单子叶植物细胞,操作方法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,。,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在,0.6,4um,。,适用：,单子叶植物,1,、目的基因导入植物细胞的方法,（,3,）花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入,DNA,（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点,:,十分简便经济。,例：转基因抗虫棉,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：大肠杆菌,常用法：Ca,2+,处理获得感受态细胞,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,小结：,将目的基因导入受体细胞,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,显微注射技术,Ca,2+,处理法,受体细胞,体细胞,受精卵,原核细胞,转化过程,将目的基因插入到,Ti,质粒的,T-DNA,上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的,DNA,表达,将含有目的基因的表达载体提纯,取卵（受精卵）,显微注射,受精卵发育,获得具有新性状的动物,Ca,2+,处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收,DNA,分子,四、目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组,DNA,分子吗？,1,真正能摄入重组,DNA,分子的受体细胞很少。,2,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1,、鉴定,分子水平的鉴定,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,1,4,N,1,4,N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了,目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法,DNA,分子杂交技术,变性,变性,1,、鉴定,分子水平的鉴定,变性,方法,分子杂交技术,（,2,）检测目的基因是否转录出了,mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的,mRNA,1,4,N,1,4,N,1,、鉴定,分子水平的鉴定,提取,（,3,）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt,毒素蛋白,将,Bt,毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗,Bt,毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2,、鉴定,个体水平的鉴定,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA,分子杂交,表达检测,转录检测,分子杂交,翻译检测,抗原抗体,杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等,个体水平的鉴定,类型,步骤,检测内容,方法,结果显示,分子检测,第一步,目的基因是否进入受体细胞,DNA,分子杂交,（,DNA,和,DNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第二步,目的基因是否转录出,mRNA,分子杂交技术,（,DNA,和,mRNA,之间）,是否成功显示出杂交带,第三步,目的基因是否翻译出蛋白质,抗原,抗体杂交,是否成功显示出杂交带,个体水平鉴定,包括抗虫、抗病的,接种实验,，以确定是否有抗性以及抗性的程度；,基因工程产品与天然产品的活性比较，以确定功能是否相同等。,目的基因的表达和检测,课堂练习,1,、,有关基因工程的叙述中，错误的是,(),A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,课堂练习,2,、基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,（）,A,、人工合成目的基因,B,、目的基因与运载体结合,C,、将目的基因导入受体细胞,D,、目的基因的检测和表达,C,【,拓展深化,】,只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对,课堂练习,即时应用,(,随学随练，轻松夺冠,),3,(2009,年高考浙江卷,),下列关于基因工程的叙述，错误的是,(,),A,目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物,B,限制性核酸内切酶和,DNA,连接酶是两类常用的工具酶,C,人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性,D,载体上的抗性基因有利于筛选含重组,DNA,的细胞和促进目的基因的表达,D,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,