肿瘤侵袭转移实验技术ppt课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,肿瘤侵袭、转移实验技术,首都医科大学,2015.11,目录,一、概述,二、细胞划痕实验,三、Transwell,四、裸鼠尾静脉注射实验,五、总结,一、概述,肿瘤侵袭和转移,体外,体内,细胞划痕实验,Transwell,裸鼠尾静脉注射,二、细胞划痕实验,细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法，实验成本低，可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的迁移能力。,实验优点：,1.,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。,2.,适合研究细胞与胞外基质（ECM）、细胞与细胞之间相互作用引起的细胞迁移。,3.,与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用。,4.,研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。,二、细胞划痕实验,实验材料：,细胞样品,仪器、耗材：6孔板 marker笔 直尺 枪头,试剂、试剂盒：无血清培养基、PBS,二、细胞划痕实验,1.,所有能灭菌的器械都要灭菌,2.超净工作台,紫外线消毒30min,注：需要灭菌的器材包括,离心管,、,吸管筒,、,移液枪,、,枪头,等,二、细胞划痕实验,4,.每孔加入5X10,5,个细胞并培养约,24h,注：1.数量以过夜贴壁能铺满为宜，适当调整,2.,数量少时可培养一段时间至铺满板底,（,3,.6孔板背面画线5-6条）,二、细胞划痕实验,5,.用1ml枪头垂直于孔板和线制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致,注：.人工枪头制造划痕难以保证划痕宽度的一致性，影响实验结果，这也是该方法最大的缺陷,二、细胞划痕实验,6,.吸掉旧培养基，用无菌PBS冲洗细胞3次，去除划下的细胞后，再,加入无血清培养基，根据需要设加实验组、对照组。,注：冲洗时温柔，贴壁加入，避免冲掉单层细胞,二、细胞划痕实验,7,.放入37度5%CO,2,培养箱，培养。按0，（6），12，24小时取样，拍照。,8,.计算、比较、分析,image J 软件计算每个视野的划痕面积,Insert。,2.,将细胞接种于Dish中间的Insert，培养。,3.,细胞长满Insert 区域后用镊子移除Insert即可产生500m宽度的划痕。,4.,每隔4-6小时拍照记录。,5.,根据收集图片数据分析实验结果,二、细胞划痕实验,谈几点问题：,1.,细胞的选择：一般适用于上皮，纤维样细胞系,a.本身有迁移能力，且较强。,b.有极性，方便测量，观察。,c.对无血清有较强的忍受力。,2.,观察的时间：一般为,0,、,6,、,12,、,24h,a.时间太久，无血清，易死亡，相对坚强,b.时间太久，细胞繁殖，假阳性,二、细胞划痕实验,三、,Transwell,Transwell,是一种应用Transwell 小室来探究细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等的问题的实验技术。,三、,Transwell,Transwell,小室：常用8.0,um,膜，铺胶,130rmb,、不铺胶,40rmb,，可重复利用,上层培养液：无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2%BSA,细胞：有侵袭能力细胞,先撤血清让细胞饥饿1224h，再进行实验,材料准备及说明：,三、,Transwell,基质胶：常用的是人工重构基底膜材料,Matrigel,下层培养液：含5%10%FBS的培养基，,也可用趋化因子,细胞培养板：6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用,材料准备及说明：,三、,Transwell,1.,Transwell,小室制备,包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，,4,风干,水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37，30min。,三、,Transwell,2,.取细胞悬液加入Transwell小室，24孔板小室一般200,l。细胞密度为110,10,5,个,.,3.24孔板下室一般加入500,l含FBS或趋化因子的培养基,。,三、细胞划痕实验,4.,培养细胞：常规培养,48h,，具体调整,5.,结果测定：,直接测定：细胞染色，镜下计数,间接测定：,MTT,法、荧光试剂检测、结晶紫染色,问：某药可抑细胞侵袭，,24h,后可抑制细胞增殖，可以培养,36h,看结果吗？,三、,Transwell,直接观察：,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。,细胞计数：把小室反过来直接观察或把膜切下直接染色，取若干个视野计数细胞个数,问：、先后问题？,三、,Transwell,间接观察：结晶紫法,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞,染色：推荐采用0.1%结晶紫固定染色。,染色后可以用33%醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值，间接反映细胞数。,四、裸鼠尾巴静脉注射,小鼠肿瘤转移模型分类：,1.,人工转移模型：将肿瘤细胞体外培养株或腹水等行注射，在肺(尾静脉注射)、脑(颈动脉注射）肝脏(肝动脉注射）等部位观察,2.,自发转移模型：肿瘤细胞接种在小鼠腋部或足趾的皮下、腹腔肌肉或原组织中，观察转移灶。,四、裸鼠尾巴静脉注射,1.,裸鼠的选择：,4-6,周裸鼠、价格约,100+rmb,2.,细胞的选择：查阅文献，选择合适细胞株；,细胞浓度：具体不定，动物肿瘤一般接种2600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤,四、裸鼠尾巴静脉注射,3.,注射技巧：,固定：,50ml,离心管自制或购买成品,注射位置：鼠尾部侧面的2条静脉，一般在尾部远端的1/3到1/2处进针。,注射：选择1-2ml注射器，针头采用4号或4.5号。,凸显静脉：温水，烤灯等,四、裸鼠尾巴静脉注射,问：如何判断已经注射进入：,注射到静脉的推液几乎没有阻力，可快速将液体推完通常600ul可在10秒推完。如果注射到静脉以外，强行推液，阻力较大，注射处周围会出现露水样渗液，而且出针后，出血较少。,并且由于药液瘀阻在尾部，导致血流不畅，尾部缺血，易导致尾部炎症和坏死。,四、裸鼠尾巴静脉注射,4.,观察结果：,影像；,大体解剖测量；,组织切片染色,如何算一个完整的实验？,五、总结,细胞划痕实验,transwell,裸鼠尾静脉注射,谢谢！,首都医科大学,2015.11,