DB4201T540-2018重要动物疫病监测样品采集技术规范.docx

ICS 65.020.01B 41DB4201武汉市地方标准DB4201/T 540-2018重要动物疫病监测样品采集技术规范2018-08-28 发布2018-09-28 实施武汉市质量技术监督局 发 布DB4201/T 540-2018前言本规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本规范附录A、附录B为资料性附录。 本规范由武汉市动物疫病预防控制中心提出。本规范由武汉市农业委员会归口。 本规范起草单位：武汉市动物疫病预防控制中心、烟台出入境检验检疫局、蔡甸区动物疫病预防控制中心。 本规范主要起草人：张四化、尹伟力、阮征、刘开武、王雪、万云、赵静、吴建英、陈橙、吴颢、杜娜、宫时玉。本规范首次发布。 IDB4201/T 540-2018重要动物疫病监测样品采集技术规范1 范围本规范规定了重要动物疫病监测样品采集的一般要求，包括采样原则和要求、样品类别和数量、采样前准备、样品采集、采样记录、样品的包装、样品的保存和运输等。本规范适用于本地动物防疫机构技术人员及养殖企业技术人员开展相关采样工作。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 3075 畜禽养殖场消毒技术 中华人民共和国农业部农医发2017年第25号 病死及病害动物无害化处理技术规范 中华人民共和国农业部公告第503号 高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。 3.1重要动物疫病被本地政府列入强制免疫范围的动物疫病，或需进行优先防治的动物疫病、人畜共患病及其他对畜禽生产影响较大被列入本地监测计划的动物疫病。3.2监测采用规定的标准和方法，持续对特定群体中疫病的发生、流行、分布及相关因素进行观察与检测的过程。3.3样品取自动物及其产品或环境，拟通过相关检测反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。3.4 采 样按照规定的程序和要求从动物及其产品或环境取得样品的过程。3.514 采样原则和要求4.1 采样人员必须是兽医技术人员，具备动物传染病相关知识，熟练掌握各种采样技术。 4.2 个人安全防护和消毒隔离按照 NY/T 3075 的要求执行。 4.3 凡发现动物有急性死亡，在排除炭疽后方可剖检、取样。 4.4 解剖时先胸腔后腹腔，先取实质性器官，后取肠道等易污染的组织器官及内容物。 4.5 病死动物要在隔离区（下铺塑料布）或实验室剖检、取样，剖检后的动物尸体、废弃物等要按病死及病害动物无害化处理技术规范进行无害化处理。5 样品类别和数量5.1 样品类别5.1.1 抗体监测样品包括全血、血清、禽蛋等； 5.1.2 病原监测样品包括分泌物、组织、粪便、精液、皮肤样品等。 5.2 样品数量根据本地监测计划，结合养殖场（户）实际情况，确定监测的具体比例和数量。可参考场群内个体抗体监测抽样数量表和场群内个体病原学监测抽样数量表（见附录B.1和附录B.2）。 6 采样前准备6.1 采样用品6.1.1 血液采集用品一次性注射器、镊子、碘酊、75%酒精棉、干棉球、采血针、采血管、保定动物专用工具等。 6.1.2 禽蛋采集用品格状专用盛蛋盘等。 6.1.3 拭子采集用品无菌棉拭子、剪刀等。 6.1.4 组织采集用品解剖刀、剪刀、镊子、扁桃体采样器、灭菌牙签、酒精灯等。 6.1.5 其他采集用品金属探杯（采集牛羊O-P液）、塑料桶、全棉绳（采集猪口腔液）等。 6.2 存放用品2塑料离心管（2 mL、10 mL、15 mL、50 mL）、玻璃容器、自封袋、试管架、离心管存放盒、铝盒、封口膜、冷冻剂、防震材料、采样箱、保温箱、胶布等。 6.3 防护用品口罩、一次性PE手套或乳胶手套、防护服、防护帽、防护眼镜、胶靴、消毒液等。 6.4 样品保存液6.4.2 根据所采样品的种类和要求，准备不同类型并分装成适量的保存液。 6.4.3 pH 7.4 磷酸盐缓冲液（PBS，配制方法见附录 A.1） 6.4.4 pH 7.4 甘油 PBS（配制方法见附录 A.2） 6.4.5 棉拭子保存液（配制方法见附录 A.3） 6.4.6 粪便保存液（配制方法见附录 A.4） 6.4.7 30甘油 PBS（配制方法见附录 A.5） 6.4.8 50甘油 PBS（配制方法见附录 A.6） 6.5 记录用品不干胶标签、签字笔、圆珠笔、油性记号笔、采样登记表和样品编号表（见附录B.3、附录B.4、附录B.5）等。 7 样品采集技术7.1 血液7.1.1 采血部位7.1.1.1 应根据动物种类确定采血部位，不同动物的采血部位见附录 B.6。 7.1.1.2 采血部位的皮肤应先剃毛（拔毛）、清洁，用 12碘酊消毒后，再用 75酒精棉球由内向外螺旋式脱碘消毒，干燥后穿刺采血。 7.1.2 采血方法7.1.2.1 猪前腔静脉采血仔猪或中等大小的猪适用前腔静脉采血，参照NY/T 541中6.1.2.2规定执行。7.1.2.2 猪耳缘静脉采血体型较大的猪适用耳缘静脉采血，参照NY/T 541中6.1.2.1规定执行。 7.1.2.3 牛尾静脉采血牛尾静脉位于牛尾腹侧面的中心线皮下位置，采血时将牛尾上提，在离尾根10 cm左右中点凹陷处， 将注射器针头垂直刺入约1 cm，见有血液回流时，把注射器活塞向外拉使血液流入针筒。 7.1.2.4 牛、羊、马颈静脉采血3DB4201/T 540-2018颈静脉位于颈部侧面颈静脉沟内，采血时将牲畜保定，手指压迫颈静脉近心端，使血管怒张，针头与皮肤呈45角由下向上刺入血管，见有血液回流时，把注射器活塞向外拉使血液流入针筒。 7.1.2.5 禽翅静脉采血禽侧卧保定后，将禽翅翻开，暴露翅静脉，拇指按压翅静脉近心端，使之怒张，针头由近心端向远心端方向平行刺入静脉，放松对近心端的按压，缓慢抽取血液。 7.1.2.6 禽心脏采血参照NY/T 541中6.1.2.6规定执行。 7.1.3 血样的处理7.1.3.1 全血将采集的全血立刻注入装有抗凝剂的试管中，轻轻摇动，充分混匀。血液抗凝可选用以下四种方法： a) 5 mL 全血加入 0.1 mL10乙二胺四乙酸二钠溶液。 b) 5 mL 全血加入 0.5 mL 3.8枸椽酸钠（柠檬酸钠）溶液。 c) 5 mL 全血加入 0.1 mL 1肝素钠溶液。 d) 使用市售商品抗凝管。 7.1.3.2 血清7.1.3.2.1 将采集的全血在室温下（2025）倾斜 30角放置 2 小时4 小时，待全血凝固并析出血清后，将血清注入无菌离心管，离心后取上清液备用。 7.1.3.2.2 采集动物血样时，注射器或采血管应保留 1/2 或 1/3 的空气，以便析出血清。 7.2 禽蛋7.2.1 采集方法随机采集规模化禽场、养禽专业户、散养农户的不同养殖单元的禽蛋，禽蛋要求无破损，置于洁净卫生的格状专用盛蛋盘中。 7.2.2 卵黄抗体的提取提取卵黄液，将卵黄液、生理盐水、氯仿按1:1:2比例混匀后静置30分钟，3 000r/min离心20分钟， 取上层清液备用（氯仿体积不计，待检样品按被稀释2 倍计算）。 7.3 拭子7.3.1 禽咽喉-泄殖腔双拭子将一个棉拭子插入喉头口及上颚裂处来回刮3 次5 次取咽喉分泌液，将另一个棉拭子插入泄殖腔约1.5 cm2 cm，旋转2圈3圈取泄殖腔内容物，将两个拭子的样品端插入同一个含1 mL棉拭子保存液（配制方法见附录A.3，下同）的离心管中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。 7.3.2 禽环境拭子7.3.2.1 禽内环境拭子4用棉拭子擦拭笼具表面、笼具周围、垫料、饲槽、饮水、粪便等禽舍内环境部位，分别置于含1 mL 棉拭子保存液的离心管中，剪下或折断尾部，也可用多个拭子充分擦拭后置于一个离心管中，盖上管盖并做好标记。 7.3.2.2 禽外环境拭子用棉拭子擦拭禽舍外的地面、出入道路、污水、运送工具等处，置于含1 mL棉拭子保存液的离心管中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。 7.3.3 羊口鼻拭子用棉拭子刮取羊口腔黏膜分泌物，取另一个棉拭子插入羊鼻腔约23 cm，旋转后沾上分泌物，将拭子样品端一并置于含有1 mL棉拭子保存液的离心管中，剪下或折断尾部，盖上管盖并做好标记。 7.4 分泌物7.4.1 牛、羊食道-咽部分泌物（O-P 液）7.4.1.1 采样前禁食12小时，适量饮水，避免采样时胃内容物反流污染O-P液。采样前将O-P液探杯置于23的氢氧化钠溶液浸泡5分钟消毒，再用清水冲洗后使用。每采完一头动物，探杯要重复消毒并充分清洗。 7.4.1.2 采样时，动物站立保定，将探杯随吞咽动作送入食道上部10 cm15 cm处，轻轻来回抽动 2 次3次，再将探杯拉出，采集2 mL5 mL O-P液，倒入含有等量pH 7.4甘油PBS的离心管中，盖上管盖并做好标记。 7.4.2 猪口腔液将直径1.3 cm的全棉绳用于保育猪、直径1.6 cm的绳子用于生长育肥猪和生产公母猪口腔液采集。全棉绳上端固定在猪圈栏杆上，下垂高度与猪只的肩关节齐平，悬挂处应远离饲槽和猪排便区，任猪咀嚼，30分钟后收取棉绳，刮取和挤压口腔液至灭菌自封袋内，然后将自封袋内液体转入离心管，盖上管盖并做好标记。每份样品1 mL以上为有效采集量。 7.5 组织7.5.1 扁桃体7.5.1.1 从活体采集扁桃体样品时，应使用专用扁桃体采集器。 7.5.1.2 采样前将采样器置于 23的氢氧化钠溶液浸泡 5 分钟消毒，再用清水冲洗后使用。每采完一头动物，采样器要重复消毒并充分清洗。 7.5.1.3 采样时，用保定绳将猪只固定，再用开口器撬开猪嘴，顶住上额、压住舌头，卡住下巴，看到突起的扁桃体后，迅速进枪，顶住腭扁桃体（切忌滑动或搅动，以免创口过大），迅速扣动扳机，拉出刀杆，用灭菌牙签将样品从刀槽中挑至灭菌离心管中，盖上管盖并做好标记。 7.5.2 脏器组织7.5.2.1 根据疑似病种选择优先采集的脏器组织，采集有病变的部分，或采集病变和健康组织交界处。动物主要疫病病原监测采样部位见附录 B.7。 7.5.2.2 用消毒的器械切取所需脏器组织块，每取一份组织块，应用火焰消毒剪刀镊子等采样器械，防止组织间相互污染，采集的组织块分别放入灭菌的容器或自封袋内。57.6 粪便7.6.1 一般动物粪便7.6.1.1 少量采集时，以灭菌的棉拭子从直肠深处或泄殖腔黏膜上蘸取粪便，立即置于含1 mL粪便保存液（配制方法见附录A.4，下同）的离心管中，盖上管盖并做好标记。 7.6.1.2 多量采集时，可将动物肛门周围消毒后，用器械或戴上手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便，装入灭菌容器内，封口标记。 7.6.2 野生动物粪便野生或珍稀动物采集新鲜粪便样品，每份样品1 g2 g，置于内含1 mL粪便保存液的离心管中，盖上管盖并做好标记。 7.7 精液消毒液洗净阴茎，用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采取精液。将集精杯从假阴道上取下，装入灭菌容器中，封口标记，样品中不得加入防腐剂。 7.8 皮肤样品用消毒的剪刀剪下1 g2 g动物的病变皮肤如新鲜的水泡皮、结节、痂皮等，加入含1 mL 50甘油PBS的离心管中，封口标记。 8 采样记录8.1 样品编号在离心管管盖或管壁、自封袋上用记号笔做好标记，或用签字笔填写标签贴在样品包装上，同一动物种类的样品，从“1”开始顺序编号，在数字前加上不同动物种类代码：猪“Z”，牛“N”，羊“Y”， 鸡“J”，鸭“A”，其他“Q”。 8.2 采样登记采样登记表信息应包括采样地址、被采样场（户）名、场点类型、联系人、电话、动物种类、样品类别、养殖规模、采样数量、编号、品种、日龄、群体数量、免疫信息、发病情况等。采样登记表应用签字笔逐项填写（一式二份），填写的信息应准确、完整，字迹清晰、工整。将采样登记表和病史资料装在自封袋中，一份随样品送实验室，另一份留存备案。各类监测采样登记表、样品编号表见附录B.3、附录B.4、附录B.5。 9 样品的包装9.1 装载样品的容器必须完整无损，密封不漏液。用前清洁干净，必要时经高温干热、紫外线照射或高压蒸汽灭菌后使用。 9.2 根据样品性质及检验目的选择不同的容器，容器装量不可过多，液态样品不可超过容量的 80%， 以防冻结时容器破裂。 9.3 自封袋外粘贴标签，注明采样场点、样品名称和数量、采样日期等，并将各个样品放到自封袋中。 9.4 装载样品的小塑料离心管应放在规定的离心管盒内，装载血液的注射器和玻璃容器应用铝盒盛放， 盒内加填防震材料避免样品晃动。 69.5 自封袋、塑料盒及铝盒外应贴封条，封条上应有采样人签章，并注明贴封日期，标注放置方向。 9.6 对疑似高致病性动物疫病的样品包装参考高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范。 10 样品的保存和运输10.1 根据样品性质及检验目的确定保存方法，不同样品的保存方法见附录 B.8。 10.2 样品采集、处理后，应于 24 小时内送抵实验室进行检测，运送时维持样品环境处于 28低温状态；24 小时内不能送检的，根据不同检验要求，按所需温度分类保存于冰箱或冰柜。 10.3 未完成血清分离的全血样品，待血清析出后方能运输，途中严禁振荡，以免溶血。 10.4 样品密封后置于保温箱中运送，内置适当冷冻剂和防震材料。 10.5 样品运送应符合生物安全要求，外包装上加贴生物安全警示标志，运送高致病性病原微生物样品应按照高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范的规定执行。7附 录 A（资料性附录） 样品保存液的配制A.1 pH7.4 磷酸盐缓冲液（PBS）氯化钠（NaCl） 8.0g 氯化钾（KCl） 0.2g 磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.9g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2g 蒸馏水（或无离子水） 加至1000 mL，充分溶解 A.2 pH7.4 甘油PBS在pH 7.4 PBS（A.1）中加入甘油（丙三醇），体积比例为1020，调pH值至7.4，103.4Kpa 高压灭菌20分钟，冷却后4保存备用。 A.3 棉拭子保存液取pH 7.4甘油 PBS（A.1），加入青霉素（2 000 U/mL）、链霉素（2 mg/mL）、丁胺卡那霉素 （1 000 U/mL）、制霉菌素（1 000 U/mL），加入抗生素后应调pH至7.4，采样前分装离心管，每管加1.0 mL，冷冻保存。 A.4 粪便保存液配制方法同A.3，但抗生素浓度应提高5倍。加入抗生素后应调pH至7.4。采样前分装离心管，每管加1.0 mL，冷冻保存。 A.5 30%甘油PBS在pH 7.4 PBS（A.1）中加入甘油（丙三醇），体积比例为30，调pH值至7.4，103.4 Kpa高压灭菌20分钟，冷却后4保存备用。 A.6 50%甘油PBS在pH 7.4 PBS（A.1）中加入甘油（丙三醇），体积比例为50，调pH值至7.4，103.4Kpa高压灭菌20分钟，冷却后4保存备用。 8附 录 B（资料性附录）场群内个体抗体监测抽样数量表表B.1、表B.2、表B.3、表B.4、表B.5、表B.6、表B.7、表B.8分别给出了场群内个体抗体监测抽样数量表、场群内个体病原学监测抽样数量表、武汉市动物疫病抗体监测采样登记表、武汉市动物疫病病原监测采样登记表、样品编号表、不同动物的采血部位、动物主要疫病病原监测采样部位、不同样品的保存方法。 B.1 场群内个体抗体监测抽样数量表场/群存栏数 （头只） 抽样数量（头/只） 可接受误差 5% 6% 7% 8% 9% 10% 50 37 33 30 26 24 21 100 59 49 42 36 30 26 150 72 59 48 40 34 29 200 82 65 53 43 36 30 250 90 70 56 45 37 31 300 95 73 58 46 38 32 350 100 76 59 47 39 32 400 103 78 60 48 39 32 450 106 80 61 49 39 33 500 109 81 62 49 40 33 550 111 82 63 50 40 33 600 113 83 64 50 40 33 650 115 84 64 50 41 33 700 116 85 65 51 41 33 750 117 86 65 51 41 34 800 118 86 65 51 41 34 850 119 87 66 51 41 34 900 120 87 66 51 41 34 950 121 88 66 52 41 34 1000 122 88 66 52 41 34 1100 123 89 67 52 42 34 1200 125 89 67 52 42 34 1300 125 90 67 52 42 34 1400 126 90 68 53 42 34 1500 127 91 68 53 42 34 1600 128 91 68 53 42 34 1700 128 91 68 53 42 34 1800 129 92 68 53 42 34 1900 129 92 69 53 42 34 2000 130 92 69 53 42 34 注：预期抗体合格率90%，95%置信水平，不同可接受误差条件下、不同规模抽样数量。 9B.2 场群内个体病原学监测抽样数量表场/群存栏数 （头只） 抽样数量（头/只） 可接受误差 1% 2% 3% 4% 5% 50 49 46 41 35 30 100 95 83 67 54 43 150 139 113 87 65 50 200 181 140 101 73 54 250 220 162 112 79 57 300 258 181 121 83 59 350 294 199 129 87 61 400 329 214 135 89 62 450 361 227 140 91 63 500 393 239 145 93 64 550 423 250 149 95 65 600 452 260 152 96 66 650 480 269 155 98 66 700 506 277 158 99 67 750 532 284 160 99 67 800 557 291 162 100 67 850 580 297 164 101 68 900 603 303 166 102 68 950 625 309 168 102 68 1000 646 314 169 103 69 1100 687 323 172 104 69 1200 724 331 174 105 69 1300 760 338 176 105 70 1400 793 345 178 106 70 1500 824 350 179 106 70 1600 853 355 180 107 70 1700 881 360 182 107 70 1800 907 364 183 108 71 1900 931 368 184 108 71 2000 955 372 185 108 71 注：预期病原学阳性率5%，95%置信水平、100%试验敏感性条件下，不同可接受误差条件下、不同规模抽样数量。 10B.3 武汉市动物疫病抗体监测采样登记表采样地址 区 乡 （ 镇 ） 村 采样时间 被采样场/户名 联系人 联系电话 场点类型 种畜禽场 商品代养殖场户 屠宰场 批发/交易市场 散养户 其他 动物种类 猪 牛 羊 鸡 鸭 鹅 鸽 其他 样品类别 血清 全血 蛋样 其他 养殖数量 采样数量 样品编号 样品信息 序号 样品编号（起止） 品种 日龄 群体数量 样品类别 动物来源 备注 免疫情况 疫苗 疫苗类型及亚型 厂家及批号 免疫次数 最后一次免疫时间 猪 *猪瘟 *蓝耳病 *O 型口蹄疫 A 型口蹄疫 其它苗 牛 *口蹄疫 羊 *口蹄疫 *小反刍兽疫 禽 *禽流感 *新城疫 其它疫苗 包括群体数量、品种、发病数量、死亡数量、临床变化、剖检变化、动物既往病史等情况（可附页） 发病情况 （健康监测不填） 采样单位：采样人：联系电话：采样日期：11DB4201/T 540-2018采样单位：采样时间：采样人：被采样单位签字：12B.4 武汉市动物疫病病原监测采样登记表采样场点及户名动物种类样品类别样品编号数量群体大小动物状态联系人联系电话备注 注：1、样品类别为禽双拭子、环境样、野鸟粪、扁桃体、淋巴结、口腔液、O-P液、口鼻拭子等；2、采样场点及户名：写明具体的交易市场/规模场（村）/栖息地/生猪屠宰场名称；动物种类：猪/牛/羊/鸡/鸭/鹅/鸽/野鸟等；3、来源地：交易市场和屠宰场需要写明动物来源地（市内来源要占样品总量的50%以上）；4、备注中填写样品详细来源地。 DB4201/T 540-2018B.5 样品编号表采样场点及户名： 采样人： 联系电话： 采样时间： 序号 原始编号 序号 原始编号 序号 原始编号 序号 原始编号 注：序号为采样管上标注号；原始编号为动物号。 13B.6 不同动物的采血部位动物种类采血部位猪前腔静脉、耳缘静脉牛尾静脉、颈静脉羊颈静脉马颈静脉禽翅静脉、心脏14B.7 动物主要疫病病原监测采样部位疫病名称样品采集部位禽流感活禽采集咽喉和泄殖腔双拭子，幼禽、珍禽或野禽采集新鲜粪便，死亡禽采集肠管及肠内容物、肺、气管、肝、脾、肾、脑等新城疫口蹄疫牛羊采集食道-咽部分泌物，猪活体采口腔液，发病动物采集未破裂的舌面或蹄部、鼻镜、乳头等部位的水泡皮和水泡液，屠宰场或死亡动物采集淋巴结、脊髓、肌肉等猪瘟急性病例首选扁桃体，慢性病例选择直肠末端、脾、肾、淋巴结和回盲口等高致病性猪繁殖与呼吸综合征病猪或疑似病猪采集扁桃体、肺、淋巴结、脾等，新鲜死胎、弱仔以及哺乳仔猪应加采血液、胸腔积液等猪伪狂犬病病死或扑杀猪采集大脑和三叉神经节、扁桃体、肺等，待检活猪采集鼻拭子，公猪可加采新鲜精液猪圆环病毒病淋巴结、脾、肺、肾等小反刍兽疫活体采集口鼻拭子，病死或扑杀畜采集肠系膜和支气管淋巴结、脾、胸腺、肠粘膜和肺等牛羊布鲁氏菌病活体采集血清、新鲜全乳等牛结核分枝杆菌病活体采集血清样品，疑似病例采集下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门及肺门淋巴结）、纵膈及肠系膜的淋巴结， 呼吸道、乳房、泌尿生殖道、肠结核疑似病例，可采集痰、乳、精液、子宫分泌物、尿、粪便等15B.8 不同样品的保存方法样品类型短期保存长期保存血清4保存-20以下冻存全血4保存禽蛋4保存拭子4保存-20以下冻存分泌物4保存-20以下冻存组织-20以下冻存粪便-20以下冻存精液4保存-20以下冻存皮肤样品-20以下冻存供细菌检验的样品30%甘油PBS（附录A.5）4保存供病毒检验的样品50%甘油PBS（附录A.6）0以下冻存 16