芒柄花素通过HSP90_AKT调控扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及其机制.pdf

第 卷第期年月西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)J o u r n a l o fX ia nJ i a o t o ngU n i v e r s i ty(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l N o S ep 本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版中医药研究芒柄花素通过H S P /A K T调控扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及其机制祁玉营,薛松妍,陈伟佳,贾婷,邢志政,刘欢,马静(西北大学生命科学学院,陕西西安 ;空军军医大学第一附属医院中医科,陕西西安 )摘要:目的探讨芒柄花素(f o r m o n o n e t i n,FMN)对扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及H S P /AK T的影响.方法通过超声心动图、E L I S A法、组织学染色、TUN E L染色,观察不同剂量FMN对扩张型心肌病心力衰竭大鼠的保护作用及心肌细胞凋亡情况.从T CM S P、D i s G e N e t、G e n e C a r d s等数据库获取FMN作用于扩张型心肌病心力衰竭的潜在靶点及其交集,再根据蛋白质互作网络(P P I)获得两者交集的关键靶点,并通过分子对接和W e s t e r nb l o t t i n g对关键靶点进行验证.结果FMN可降低扩张型心肌病心力衰竭大鼠左心室收缩末期内径(L V I D S)、左心室舒张末期内径(L V I D D)水平及N T p r oB N P、c T n T、C K、C K MB和L DH含量,提高射血分数(E F)和短轴缩短率(F S)水平,减少心肌细胞凋亡;FMN与网络药理学筛出的 个关键靶点(AK T、H S P AA、C A S P、MA P K、MMP、S R C、A L B、HR A S、I G F、E G F R)均具有较强的结合作用,以H S P AA、AK T 结合作用最强,同时FMN可降低心肌组织H S P 、AK T及下游C A S P 蛋白表达,提高p AK T的表达.结论FMN可能通过抑制H S P 的表达,促进AK T磷酸化,降低C A S P 的表达,减少心肌细胞凋亡,改善心肌组织损伤,达到治疗扩张型心肌病心力衰竭的目的.关键词:芒柄花素;扩张型心肌病心力衰竭;H S P ;AK T;心肌细胞凋亡中图分类号:R 文献标志码:AD O I:/j d y x b 收稿日期:修回日期:基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(N o G Z Y K J S );陕西省中医药管理局中西医结合临床协同创新项目(N o Z X Y )S u p p o r t e db y T r a d i t i o n a lC h i n e s e M e d i c i n eS c i e n c ea n d T e c h n o l o g y R e s e a r c hP r o g r a m o fN a t i o n a lA d m i n i s t r a t i o no fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e(N o G Z Y K J S )a n dC l i n i c a lC o l l a b o r a t i v e I n n o v a t i o nP r o j e c t o f I n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s e a n dW e s t e r nM e d i c i n eo fS h a a n x iP r o v i n c i a lA d m i n i s t r a t i o no fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e(N o Z X Y )通信作者:马静,教授 E m a i l:j i n g m a f mm u e d u c n.薛松妍为共同第一作者.网络出版地址:h t t p s:/k n s c n k i n e t/k c m s/a r t i c l e/a b s t r a c t?v u o q I h G C S n f L s u R a d T y E V l p W U r h T D C d P D b j e n C B I A a Z t i k x j qS F r I V f u p k y U q j n v O r P B i n WW o&u n i p l a t f o r mN Z K P T()F o r m o n o n e t i nr e g u l a t e sd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y m e d i a t e dh e a r t f a i l u r ei nr a t sv i aH S P /A K Tc a r d i o m y o c y t ea p o p t o s i sa n dm e c h a n i s mQ IY u y i n g,XU ES o n g y a n,CHE N W e i j i a,J I AT i n g,X I NGZ h i z h e n g,L I U H u a n,MAJ i n g(C o l l e g eo fL i f eS c i e n c e,N o r t h w e s tU n i v e r s i t y,X i a n ;T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n eD e p a r t m e n t,F i r s tA i rF o r c eM e d i c a lU n i v e r s i t yH o s p i t a l,X ia n ,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v eT oi n v e s t iga t et h ee f f e c t so ff o r m o n o n e t i n(FMN)o nc a r d i o myo cyt eapopt o s i sa n dH S P /AK Ti nr a t sw i t hd i l a t e dc a r d i o myopa t hy m e d i a t e dh e a r tf a i l u r e M e t h o d sE c h o c a r d i ogr aphy,E L I S A,h i s t o l ogi c a l s t a i n i ng,a n dT UN E Ls t a i n i ngw e r eu s e dt oo b s e r v et h epr o t e c t i v ee f f e c to fd i f f e r e n td o s e so fFMNo nd i l a t e dc a r d i o myopa t hy m e d i a t e dh e a r t f a i l u r e i nr a t sa n dt h eapopt o s i so fc a r d i o myo cyt e s T h epo t e n t i a l t a rge t so ff o r m o n o n e t i n o n d i l a t e d c a r d i o myopa t hy m e d i a t e d h e a r t f a i l u r e w e r e o b t a i n e d f r o m T CM S P,D i s G e N e t,G e n e C a r d s,a n do t h e rd a t a b a s e s,t h ek eyt a rge t sw e r eo b t a i n e da c c o r d i ngt ot h epr o t e i n pr o t e i ni n t e r a c t i o n(P P I)n e t w o r k,a n dt h ek eyt a rge t sw e r ev e r i f i e dbym o l e c u l a rd o c k i ng W e s t e r nb l o t t i ngw a su s e dt of u r t h e rv e r i fyt h er egu l a t o ryr o l eo fk eyt a rge t s i nt h e t r e a t m e n to fd i l a t e dc a r d i o myopa t hy m e d i a t e dh e a r t f a i l u r ew i t hf o r m o n o n e t i nR e s u l t s F o r m o n o n e t i nc o u l dr e d u c e t h e l e v e l s o fL V I D S,L V I DD,N T pr oB N P,c T n T,C K,C K MB,a n dL DHi nr a t sw i t hd i l a t e dc a r d i o myopa t hy m e d i a t e dh e a r tf a i l u r e,i n c r e a s et h el e v e l so fE Fa n dF S,a n dr e d u c et h eapopt o s i so fc a r d i o myo cyt e s FMN h a das t r o ngb i n d i nge f f e c to n k eyt a rge t s(AK T,H S P AA,C A S P,期祁玉营,薛松妍,陈伟佳,等芒柄花素通过H S P /A K T调控扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及其机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版MA P K,MMP,S R C,A L B,HRA S,I G F,a n dE G F R)s c r e e n e dbyn e t w o r kph a r m a c o l og y,w i t hH S P AA a n dAK T h a v i ngt h es t r o nge s tb i n d i nge f f e c t F o r m o n o n e t i nd e c r e a s e dt h ee xpr e s s i o no fH S P ,AK Ta n dd o w n s t r e a mC A S P pr o t e i n,b u ti n c r e a s e dt h ee xpr e s s i o no fp AK Ti n myo c a r d i a lt i s s u e C o n c l u s i o nF o r m o n o n e t i n m ayi n h i b i t t h ee xpr e s s i o no fH S P ,pr o m o t eph o sph o ryl a t i o no fAK Tt op AK T,a n d i n h i b i t t h ee xpr e s s i o no fC A S P,t h e r e byr e d u c i ngt h eapopt o s i so fc a r d i o myo cyt e sa n di mpr o v i ngmyo c a r d i a lt i s s u ed a m age,s oa st oa c h i e v et h epu rpo s eo f t r e a t i ngd i l a t e dc a r d i o myopa t hy m e d i a t e dh e a r t f a i l u r e K E Y WO R D S:f o r m o n o n e t i n;d i l a t e dc a r d i o myopa t hym e d i a t e dh e a r tf a i l u r e;H S P ;AK T;c a r d i o myo cyt eapopt o s i s扩张型心肌病(d i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y,D CM)是一种非缺血性心肌疾病,心力衰竭是其最常见的并发症 .由于其病因尚不明确,病理生理机制复杂,目前现代医学对其缺乏特效的治疗方法.芒柄花素(又 名 刺 芒 柄 花 素、芒 柄 花 黄 素,f o r m o n o n e t i n,FMN)属于异黄酮类化合物,可以通过作用于多条通路及靶点发挥抗凋亡、抗炎、抗氧化、促自噬、调节脂质代谢作用,对心血管系统具有保护作用.目前治疗心力衰竭的多种中成药,如芪参颗粒、芪苈强心胶囊、益心泰颗粒中均含有FMN,说明其可能在心力衰竭的治疗中发挥重要作用.但FMN对扩张型心肌病心力衰竭的治疗作用及机制如何,目前未见报道.因此,本研究拟从动物实验和网络药理学入手,探讨FMN对扩张型心肌病心力衰竭的保护作用及作用机制,为其进一步研发提供可靠的实验依据.材料与方法主要试剂芒柄 花 素 购 自I n C e l l G e n e公 司,阿 霉 素 购 自A l a d d i n公司,M a s s o n染色试剂盒购自索莱宝公司,NT p r o B N P、肌钙蛋白(c T n T)、肌酸激酶(C K)、肌酸激酶同工酶(C K MB)及乳酸脱氢酶(L DH)检测试剂盒均购自G o y B i o公司,H S P 、C A S P、AK T和p AK T抗体购自C S T公司,内参TU B U L I N抗体、HR P标记山羊抗兔I g G、HR P标记山羊抗小鼠I g G和R I P A裂解液购自赛维尔公司,B C A蛋白定量试剂盒购自酷莱博公司.数据库和软件数据库主要包括T CM S P(h t t p:/h t t p:/t c m s p wc o m/t c m s p p h p)、P h a r mM a p p e r(h t t p:/wwwl i l a b e c u s t c n/p h a r mm a p p e r/)、G e n e c a r d s(h t t p s:/www g e n e c a r d s o r g/)、D i s G e N e t数 据 库(h t t p:/wwwD i s g e n e t o r g/)、V e n n y(h t t p:/b i o i n f o r m a t i c s p s b u g e n t b e/w e b t o o l s/V e n n/)、S t r i n g(h t t p s:/s t r i n g d b o r g/,V e r s i o n )、P D B(h t t p s:/www r c s b o r g/)、P u b C h e m(h t t p s:/p u b c h e m n c b i n l m n i h g o v/).软 件 包 括C y t o s c a p e 、C h e m D(版)、A u t o D o c k T o o l s 、A u t oD o c kV i n av、I m a g eJ.实验动物及分组雄性S D大鼠 只,周龄,体质量()g,由空军军医大学动物中心提供.保持环境温度 ,湿度 ,自由进食饮水.实验过程中对动物处置符合动物伦理学规范,伦理审批号为S U CMD L .将实验大鼠随机分为组,分别为正常对照组(C o n t r o l)、模型组(M o d e l)、FMN低剂量组(FMN )、FMN中剂量组(FMN )及FMN高剂量组(FMN ),每组只.动物模型制备参考 文 献 模 型 组 大 鼠 腹 腔 注 射 阿 霉 素m g/k g,按m g/m L用生理盐水溶解,d注射次,连续次,第 天进行超声心动图检测,左心室舒张 末 期 内 径(L V I D D)、左 心 室 收 缩 末 期 内 径(L V I D S)数值增大,且具有统计学意义(P),同时射血分数(E F)值 时,提示大鼠扩张型心肌病心力衰竭模型制备成功.给药方法参考文献FMN低、中、高剂量组分别给予溶于 m L生理盐水的、m g/(k gd)的F MN灌胃,正常对照组用m L/d生理盐水灌胃,共 d.超声心动图用异氟烷麻醉实验大鼠,采用美国G E公司V i v i d E 彩色超声影像系统搭配 S D,MH z探头作超声心动图,检测L V I D S、L V I D D、E F及短轴缩短率(F S).E L I S A法进行腹主动脉取血,静置h,离心 m i n,吸取上层血清至m LE P管.按照E L I S A试剂盒说明书检测血 清NT p r o B N P、c T n T、C K、C K MB及L DH含量.H E和M a s s o n染色HE染色是将实验大鼠心肌组织切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡脱水,用苏木素染色m i n,伊红染色m i n,最后用梯度乙醇脱水,封片.M a s s o n染色是将上 述 切 片 用 苏 木 素 染 色 m i n,丽 春 红 染 色西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版m i n,磷钼酸处理m i n,苯胺蓝复染m i n,最后进行脱水,封片.显微镜观察.T U N E L染色按照TUN E L试剂盒说明书进行染色.凋亡细胞核用绿色荧 光染色标记,心肌 组 织 总 细 胞 核 用D A P I染 色.用 共 聚 焦 显 微 镜 观 察,凋 亡 率 以T U N E L阳性细胞核与D A P I染色细胞核的比值表示.W e s t e r nb l o t t i n g检测称取 m g心肌组织于E P管中剪碎,加入m L配置好的R I P A裂解液,于超声破碎机中进行破碎,后在冰上静置,离心,取上清,用B C A试剂盒进行蛋白定量,金 属浴煮沸 m i n,分 装 放 于 冰箱中.用快速凝胶试剂盒配制胶板,按照蛋白量为 g加样,V电泳 m i n,在 mA的恒流条件下转膜 m i n,将蛋白样品转膜至P V D F膜上,g/L的脱脂牛奶封闭 m i n,一抗孵育过夜,第日经T B S T洗膜,二抗孵育,T B S T洗膜,超敏E C L发光试剂盒显影,最后用I m a g eJ进行蛋白定量分析.F MN作用靶点和扩张型心肌病心力衰竭靶点的获取与交集在T CM S P数据库中把限定词改为“C h e m i c a ln a m e”,输入关键词“F o r m o n o n e t i n”检索FMN的相关作用靶点,下载其m o l 格式并上传到P h a r mM a p p e r网站,靶点种类设定为H u m a n P r o t e i nT a r g e t sO n l y.分别在G e n e C a r d s、D i s G e n e t数据库中以“D i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y”为关键词进行搜索,合并靶点去掉重复;以同样方法得到“H e a r t f a i l u r e”疾病靶点,并取两种疾病靶点的交集,得到扩张型心肌病心力衰竭的靶点.将药物作用靶点和疾病靶点上传至在线V e n n y图,得到FMN作用和扩张型心肌病心力衰竭靶点的交集.构建F MN作用靶点和扩张型心肌病心力衰竭靶点交集的蛋白互作网络(P P I)将上述交集基因上传至S T R I NG网站中,选择物种为人类,得到蛋白质之间的P P I网络图,保存t s v文件格式,导入C y t o s c a p e 软件中进行调整,并利用c y t o H u b b a插件得到关键靶点.F MN的小分子结构与关键靶点的分子对接利用P D B数据库寻找并下载关键靶点蛋白的分子结构文件.使用P y MO L软件对下载的靶点蛋白进行删除水分子和删除原配体等操作.使用P u b C h e m数据库下载F o r m o n o n e t i n小分子结构文件.使用C h e m D(版)软件对小分子的最优构象进行分子力学计算,最终得到能量最小化的小分子最优构象.使用A u t oD o c kT o o l s 将预处理好的靶点蛋白分子进行加氢处理,对分子力学优化所得最优构象的小分子进行加氢和判定可扭转键处理.使用A u t oD o c kV i n av 软件将靶点蛋白和小分子进行分子模拟对接,对接算法为拉马克遗传算法,对接方式为半柔性对接,e x h a u s t i v e n e s s设为,输出的最大构象数设为.得到对接结合自由能以及对接结果文件.统计学分析本实验的统计分析及作图统一使用G r a p h P a dP r i s m 软件.数据以均数标准差(xs)表示,组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较,若方差齐则用配对t检验,P 为差异有统计学意义.结果F MN改善扩张型心肌病心力衰竭大鼠的心脏功能与正常对照组相比,模型组大鼠E F和F S值显著降低(P,图 A、图 B),而L V I D S和L V I D D显著升高(P,图 C、图 D);FMN低、中、高剂量组大 鼠E F、F S均 显 著 高 于 模 型 组(P ,图 A、图 B),而L V I D S和L V I D D显 著 降 低(P,图 C、图 C).FMN低剂量和高剂量组E F、F S明显低于中剂量组,而L V I D S和L V I D D值高于中剂量组(P),中剂量组效果最为明显.F MN改善扩张型心肌病心力衰竭大鼠的心肌损伤与正常对照 组相比,模型 组大鼠血清NT p r oB N P、c T n T、L DH、C K、C K MB含 量 均 显 著 升 高(P,图).FMN低、中、高剂量组大鼠NT p r oB N P、c T n T、L DH、C K、C K MB含量均显著低于模型组(P,图).与上述结果相同,中剂量组效果最为明显.F MN改善扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌组织病理改变HE染色显示,与正常对照组相比,模型组可见较多心肌细胞坏死,纤维断裂,细胞排列紊乱;FMN低、中、高剂量组的心肌细胞坏死数量减少及细胞排列情况都有所改善,其中FMN中剂量组效果最好(图 A).M a s s o n染色中红色表示心肌纤维,蓝色表示心肌胶原,染色结果可见正常对照组图中绝大多数为正常心肌组织,稍许掺杂有间质胶原纤维;模型组大鼠心肌间质胶原纤维增生明显,血管周围细胞外基质增多;FMN低、中、高剂量组的心肌胶原纤维化有所减少,以中剂量组最为明显(图 B).期祁玉营,薛松妍,陈伟佳,等芒柄花素通过H S P /A K T调控扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及其机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版与正常对照组比较,P;与模型组比较,P;与FMN中剂量组比较,&P,&P,n.图各实验组超声心动图指标的变化F i g C h a n g e so f e c h o c a r d i o g r a p h i c i n d e x e s i ne a c he x p e r i m e n t a l g r o u p与正常对照组比较,P;与模型组比较,P;与FMN中剂量组比较,&P,&P,n.图各实验组N T p r o B N P和心肌损伤标志物的改变F i g C h a n g e so fN T p r o B N Pa n dm y o c a r d i a l i n j u r ym a r k e r s i ne a c he x p e r i m e n t a l g r o u pA:HE染色结果,箭头指示细胞排列紊乱及纤维断裂部分;B:M a s s o n染色结果,箭头指示胶原纤维化部分.图各实验组大鼠心肌组织的病理改变F i g P a t h o l o g i c a l c h a n g e so fm y o c a r d i a l t i s s u e i ne a c he x p e r i m e n t a l g r o u p西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版F MN可以减轻心肌细胞凋亡TUN E L染色中绿色为阳性细胞,蓝色为D A P I染色的全部细胞核,M e r g e图是将阳性细胞和全部细胞重叠之后得到的结果.结果如图 A、图 B所示,正常对照组心肌细胞凋亡数量少,荧光较弱,而模型组细胞凋亡率显著增加(P);与模型组相比,FMN处理后细胞凋亡率有所降低(P ),以FMN中剂量组最明显(P).FMN低剂量、高剂 量 组 的 细 胞 凋 亡 率 都 比 中 剂 量 组 显 著 增 高(P ).A:TUN E L染色结果,白色箭头指示为TUN E L阳性细胞;B:TUN E L染色定 量 分 析.与 正 常 对 照 组 比 较,P ;与 模 型 组 比 较,P ,P;与FMN中剂量组比较,&P,&P,n.图各实验组大鼠心肌细胞凋亡情况F i g C a r d i o m y o c y t ea p o p t o s i s i ne a c he x p e r i m e n t a l g r o u pF MN作用靶点和扩张型心肌病心力衰竭靶点与交集FMN潜在靶点共 个,扩张型心肌病心力衰竭相关靶点 个.将两者取交集,得到 个共同作用靶点基因.交集靶点韦恩图见图.图F MN作用靶点与扩张型心肌病心力衰竭靶点的交集韦恩图F i g V e n nd i a g r a mo f i n t e r s e c t i o nt a r g e to fFMNa n dd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y m e d i a t e dh e a r t f a i l u r eF MN作用靶点和扩张型心肌病心力衰竭靶点的交集基因蛋白互作网络(P P I)将筛选出的 个交集靶点进行蛋白互作网络可视化分析,见图 A;排名前 关键靶点为AK T、H S P AA、C A S P、MA P K、MMP、S R C、A L B、HR A S、I G F、E G F R(图 B).F MN分子结构与关键靶点的分子对接对接 个蛋白与FMN小分子的结合能如表所示.H S P AA、AK T、MMP 的结合能最低,均为 k c a l/m o l,而后依次为A L B、E G F R、MA P K、H R A S、C A S P、S R C和I G F.使用P y MO L 软件对对接结果进行可视化处理,对接情况见图.W e s t e r nB l o t t i n g检测心肌组织关键靶点的蛋白表达结果与正常对照组相比,模型组的心肌组织H S P 、C A S P、AK T的蛋白表达显著升高,p A K T表达降低(P ).与模型组比较,F MN低、中、高剂量组的期祁玉营,薛松妍,陈伟佳,等芒柄花素通过H S P /A K T调控扩张型心肌病心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡及其机制本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版心肌组织中H S P 、C A S P、A K T表达降低,p A K T表达显著升高(P );F MN低、高剂量组的H S P 、C A S P、A K T比F MN中剂量组表达水平显著升高,而p A K T比中剂量组显著降低(P ,图).A:个交集靶点的P P I网络图;B:排名前 个关键靶点.图F MN作用靶点和扩张型心肌病心力衰竭靶点交集的蛋白质互作网络(P P I)F i g P P I n e t w o r ka t t h e i n t e r s e c t i o n t a r g e t o fFMNa n dd i l a t e dc a r d i o m y o p a t h y m e d i a t e dh e a r t f a i l u r e表 种蛋白质与F MN的分子对接结合能数据T a b M o l e c u l a rd o c k i n gb i n d i n ge n e r g yd a t ao ft e np r o t e i n sw i t hFMNP r o t e i nP D BI DL i g a n dB i n d i n gE n e r g y(k c a l/m o l)H S P AA B Q GAK T O MMP L JA L B Y G E G F R J X Tf o r m o n o n e t i nMA P K Q T AHR A S X J C A S P NM SS R C Y I G F PMXAJ:依次为AK T、A L B、C A S P、E G F R、HR A S、H S P AA、I G F、MA P K、MMP、S R C和芒柄花素的对接图.图排名前 个蛋白分别与F MN小分子结构对接的 D可视图F i g Dv i e w a b l ed o c k i n go f e a c ho f t h e t e nk e yt a r g e t sw i t hf o r m o n o n e t i nm o l e c u l e s讨论扩张型心肌病是目前最常见的心肌病之一,由于与心脏猝死和心力衰竭密切相关,其病因尚且不清楚,并缺乏特效性治疗方法,现已成为心血管疾病防治的焦点之一.FMN属于异黄酮类化合物,主要存在于黄芪的根部、红车轴草的花序和带花枝叶、葛根、鸡血 藤 等 豆 科 植 物 中 .近 年 来 研 究 发 现,FMN可保护心血管、抗炎、抗癌及成骨等作用.但目前尚无FMN治疗扩张型心肌病心力衰竭的作用及机制的文献报道.该病模型制备主要包括口服呋喃唑酮、转基因小鼠、B V病毒、腹腔注射阿霉素等方法,.然而,呋喃唑酮溶入饮用水中对于大鼠食管会产生很大损伤,易导致死亡;且自由饮用又无法确定药物剂量,造成模型个体间的差异较大.转基因小鼠对实验技术水平要求较高,费用较大,很难推广使用.B V病毒诱导的D CM周期较长且传染性强.故腹腔注射阿霉素(D o x o r u b i c i n,D O X)建立扩张型心肌病心力衰竭模型,在目前仍为简便可靠、可重复性较高的造模方法.因此,本研究选择了腹腔注射D O X来制备扩张型心肌病心力衰竭模型.结果表明,模型组大鼠E F值均能达到 以下,与既往研究相符.研究探讨了不同剂量的FMN对扩张型心肌病心力衰竭的保护作用.结果证实,不同剂量的FMN组与 模 型 组 相 比,E F和F S显 著 升 高,L V I D S和L V I D D明显下降,血清NT p r o B N P和c T n T、C K、C K MB、L DH含量明显降低,心脏组织纤维化减少,细胞排列情况有所恢复,细胞凋亡率明显降低,且以中剂量组效果最为明显.西 安 交 通 大 学 学 报(医 学 版)第 卷本刊网址:h t t p:/y x x b x j t u e d u c n微信公众号:西安交通大学学报医学版A:H s p 、p AK T、AK T和C a s p 的蛋白表达条带;BE:实验大鼠心肌组织H s p 、p AK T、AK T和C a s p 的蛋白表达.与正常对照组比较,P;与模型组比较,P,P;与FMN中剂量组比较,&P,&P,n.图各实验组H S P 、p A K T、A K T及C a s p 蛋白表达F i g E x p r e s s i o n so fH S P ,p AK T,AK Ta n dC a s p p r o t e i n i ne a c he x p e r i m e n t a l g r o u p目前网络药理学被广泛应用于中药活性化合物对疾病治疗作用的机制阐释,具体为通过寻找药物和疾病的潜在靶点和交集,利用P P I网络分析找到药物治疗疾病的机制.故为了进一步明确FMN治疗扩张型心肌病心力衰竭的作用机制.本研究采用网络药理学筛选F MN治疗扩张型心肌病心力衰竭的作用靶点,然后进行分子对接,结果发现,F MN治疗该病 的 个 关 键 靶 点 分 别 是A K T、H S P A A、C A S P、MA P K、MMP、S R C、A L B、HR A S、I G F 和E G F R;一般来说,结合能小于k c a l/m o l,两分子可自发结合,k c a l/m o l结合情况优异,小于k c a l/m o l结合作用强烈.而上述关键靶点与FMN结合能均小于,其中AK T、H S P AA 和MMP 的结合能最低,均为k c a l/m o l,说明这个基因与FMN的结合效果最强.H S P 家 族 包 括H S P AA、H S P AA、H S P A B 等,H S P 与细胞内凋亡的多个过程密切相关,在心肌病的多通路调控中起核心作用,也参与调控心力衰竭.H S P 抑制剂可增强AK T的信号传导,可对D O X诱导的心力衰竭提供心脏保护.AK T 是AK T家族成员之一,与调节心血管功能、心脏舒张和收缩功能关系最为密切,可以介导细胞存活和凋亡;p AK T是AK T的磷酸化形式,AK T被激活后促进磷酸化的发生,进而激活或抑制P I K/AK T信号通路的下游靶蛋白,从而调节细胞增殖和凋亡过程,如通过抑制c a s p a s e依赖性和非依赖性的细胞凋亡.C a s p a s e(C A S P)是细胞凋亡过程中的关键靶点,是细胞凋亡的执行基因,在不同的细胞凋亡过程中都是必需的,C A S P 升高常见于心肌缺血、心肌病、心力衰竭等.因此,本研究又采 用W e s t e r n b l o t t i n g检 测 实 验 大 鼠FMN对H S P 、AK T、p AK T及C A S P 的蛋白表达.结果表 明,FMN低、中、高 剂 量 组 与 模 型 组 相 比,H S P 、C A S P、AK T表达明显降低,p AK T显著升高,以中剂量组效果最佳.综上所述,不同剂量FMN均能够降低模型大鼠心脏E F和F S,升高L V I D S和L V I D D、N T p r o B N P、c T n T、C K、C K MB及L DH,减少心肌细胞凋亡,但以中剂量组最为明显;FMN可能是通过抑制H S P 的表达,促进AK T磷酸化,降低C A S P 的表达,减少心肌细胞凋亡,从而缓解心肌损伤,达到治疗扩张型心肌病心力衰竭的目的.由于本实验研究仅从动物实验的角度探讨了FMN治疗