氯化钴模拟法构建绒毛外滋养细胞缺氧模型.pdf

目的:探讨适宜的绒毛外滋养细胞(EVT)化学性缺氧模型。方法:选取2022 年 4 月至 2023 年 1 月在广西医科大学第一附属医院妇科选择人工流产的正常孕妇(6 9 孕周)的绒毛组织,分离和培养原代 EVT,利用免疫细胞化学进行纯度鉴定。利用氯化钴(CoCl2)构建细胞缺氧模型,CCK鄄8 实验检测不同浓度(0、50、100、150、300滋mol/L和 600滋mol/L)CoCl2在不同时间(6、12、24h 和 48h)对原代 EVT 细胞存活率的影响,实时荧光定量聚合酶链反应实验(RT鄄qPCR)检测缺氧诱导因子鄄1琢(HIF鄄1琢)mRNA 表达。结果:成功分离和培养原代 EVT。EVT 的细胞存活率与 CoCl2浓度和缺氧时间有关。相对于对照组(0滋mol/L),0 150滋mol/L 浓度组细胞存活率下降不明显;300滋mol/L 浓度组作用 24h 后对细胞生长明显抑制。600滋mol/L 浓度组的细胞毒性作用出现最早,24h 后细胞基本全部死亡。150滋mol/L CoCl2缺氧 6、12、24、48h 各组的 HIF鄄1琢 mRNA 相对表达量分别是对照组(0h)的 0.50 倍、0.64 倍、1.45 倍和 3.00 倍。缺氧时间 24h,50、100、150滋mol/L CoCl2各组的 HIF鄄1琢 mRNA 相对表达量分别是对照组(0滋mol/L)的 1.23 倍、1.28 倍、1.58 倍。结论:CoCl2可用于构建原代 EVT 的化学性缺氧细胞模型,综合 CoCl2的细胞毒性作用及 HIF鄄1琢 mRNA 表达水平,CoCl2的适宜作用浓度是 150滋mol/L,作用时间是 24h。摇 摇 揖关键词铱摇 氯化钴;缺氧;绒毛外滋养细胞;缺氧诱导因子 琢摇 摇 中图分类号:R714摇 文献标志码:A摇 文章编号:1004-7379(2023)09-0645-06摇 摇 DOI:10.13283/ki.xdfckjz.2023.09.031Construction of a new model for extravillous trophoblast cell hypoxia using cobalt chlo鄄ride.Yin Chunyue,Long Yu.Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospi鄄tal of Guangxi Medical University,Nanning摇 530021摇 摇 揖Abstract铱摇 Objective:To investigate a suitable model of chemical hypoxia of extravil鄄lous trophoblast(EVT).Methods:Primary EVTs were isolated and cultured from the villi ofnormal pregnant women(6 9 weeks)who chose to abortion in the First Affiliated Hospital ofGuangxi Medical University from April 2022 to January 2023,and the purity was determined byimmunocytochemistry.We used cobalt chloride(CoCl2)to construct cell hypoxia model,andCCK鄄8 assay was used to detect the effects of different concentrations(0,50,100,150,300,600滋mol/L)of CoCl2on the survival rate of primary EVT cells at different times(6,12,24,48h).Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction(RT鄄qPCR)assay was usedto detect the expression of hypoxia鄄inducible factor鄄1琢(HIF鄄1琢)mRNA.Results:We success鄄fully isolated and cultured primary EVT.The survival rates of EVT were correlated with the con鄄centration and exposure time of CoCl2.Compared with control group(0滋mol/L),the cell surviv鄄al rate in 0 150滋mol/L concentration groups decreased insignificantly.However,the300滋mol/L concentration group significantly inhibited cell growth after 24h.Cytotoxic effectsappeared first in the 600滋mol/L group,and almost all cells died after 24h.HIF鄄1琢 mRNA rela鄄546现代妇产科进展 2023 年 9 月第 32 卷第 9 期摇 Prog Obstet Gynecol,Sep.2023,Vol郾 32,No郾 9*基金资助:国家自然科学基金会(No:81960282);广西自然科学基金(No:2020GXNSFDA297024)通信作者摇 Email:longyu tive expression levels in the 150滋mol/L CoCl2hypoxia group at 6,12,24h and 48h were 0.50times,0.64 times,1.45 times,3.00 times of that in the control group(0h),respectively.After24h hypoxia,the HIF鄄1琢 mRNA relative expression levels in 50,100滋mol/L and 150滋mol/LCoCl2groups were 1.23 times,1.28 times,and 1.58 times of that in control group(0滋mol/L),respectively.Conclusion:CoCl2can be used to construct the chemical hypoxia cell model ofprimary EVT.Based on the cytotoxicity of CoCl2and the expression level of HIF鄄1琢 mRNA,theoptimal concentration of CoCl2is 150滋mol/L,and the optimal time is 24h.摇 摇 揖Key words铱摇 Cobalt chloride;Hypoxia;Extravillous trophoblast;Hypoxia鄄inducible fac鄄tor鄄1琢摇 摇 整个妊娠期胎盘微环境中的氧气水平不是恒定的,妊娠早期生理性氧张力为 2%3%,妊娠中期和晚期为 6%8%1。这个缺氧阶段与胎盘发育的最关键阶段重叠,即胚泡植入、绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblast,EVT)侵袭和螺旋动脉重塑。在胎盘早期发育过程中,细胞滋养层细胞(cy鄄totrophoblast,CTB)增殖并形成细胞柱,该细胞柱远端的 CTB 在孕早期开始分化为两种唯一与母体接触且具有迁移和侵袭能力的 EVT,包括血管内绒毛外滋养细胞(endovascular extravillous trophoblast,eE鄄VT)和间质绒毛外滋养细胞(interstitial extravilloustrophoblast,iEVT),eEVT 侵入螺旋动脉形成 EVT栓,阻止母体血液流入绒毛空间,从而创造持续 10周的低氧妊娠环境2。在妊娠头 3 个月末,这些栓子逐渐消散,eEVT 开始沿着血管向近端迁移,将螺旋动脉重塑成低阻力高流速的血管,逐渐将局部子宫氧张力水平升高并恢复到其“正常冶生理水平;iEVT 则侵袭至子宫肌层的上 1/3 处。这种缺氧缺血/再氧合过程是正常的、生理的,并且对于正常的胎儿和胎盘发育至关重要3。氧张力水平的变化与胚胎发育结局密切联系。先兆子痫、早产、复发性流产等妊娠相关疾病的发生发展与氧合异常有关4。氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)已被广泛应用于模拟缺氧环境的化学试剂,能产生与缺氧缺血相似的反应5,其诱导的化学性缺氧模型具有稳健性好、可重复性高的优点。本研究拟分离和培养原代人早孕 EVT,探讨其在 CoCl2不同浓度和处理时间条件下的增殖、活力及缺氧相关反应基因的变化,以建立一个可靠、检测方便的 EVT 细胞缺氧模型,为探索及防治 EVT 侵袭缺陷与缺氧的疾病奠定体外实验的细胞学基础。1摇 资料与方法1.1摇 材料1.1.1摇 研究对象摇 选取 2022 年 4 月至 2023 年 1 月在广西医科大学第一附属医院行人工流产的正常孕妇。纳入标准:年龄 18 45 岁;妊娠前无心血管系统、泌尿系统及糖尿病等病史;B 超证实为宫内妊娠,宫腔内见孕囊、胚芽,并有原始心管搏动,孕周 6 9 周;术前 3 个月内未服用过甾体类激素及抗早孕药物。本实验已获得患者知情同意及伦理审查。1.1.2摇 主要试剂与仪器摇 DMEM/F12 培养液购自美国 Gib鄄co 公司;DNase I 酶、氯化钴购自美国 Sigma鄄Aldrich 公司;优级胎牛血清、胰酶购自大连美仑公司;兔抗人细胞角蛋白 7抗体(cytokeratin 7,CK7)、兔抗人波形蛋白抗体(vimentin,VIM)、兔抗人人白细胞抗原鄄G 蛋白抗体(human leucocyteantigen鄄G,HLA鄄G)、小鼠抗兔 HRP 多克隆二抗购自 Bioss 公司;Trizol 试剂购自 invitrogen 公司;荧光定量 PCR 试剂盒购自 Novoprotein 公司;倒置荧光显微镜(日本 Olympus 公司)。1.2摇 实验方法1.2.1摇 原代 EVT 细胞分离培养和鉴定摇参考 Handschuh等6方法,取正常 6 9 孕周人工流产的绒毛组织,用含高浓度双抗的 PBS 冲洗,剪除蜕膜、胎膜及血管,给予 10mL/g 组织复合酶(含 0.02%EDTA 的 0.125%胰酶、DNase I 酶、4.2mmol/L MgSO4、25mmol/L HEPES)静置消化 35 40min,依次经 200 目和 400 目筛网过滤,300伊g 离心 10min。将细胞沉淀重悬于 2mL 红细胞裂解液,裂解 10min,500 伊g 离心5min,去上清,加 5 倍体积 PBS 清洗细胞,500伊g 离心 3min。将细胞重悬于含 20%血清的完全培养基,细胞计数,接种于预先用鼠尾胶原蛋白 I 包被的培养板或培养皿,置 5%CO2、37益培养箱培养32 48h,更换新的培养基或干预。用 HLA鄄G、CK7 和 VIM 抗体鉴定 EVT。1.2.2摇 免疫细胞化学摇 制作 EVT 细胞爬片,培养 32 48h,4%多聚甲醛室温固定细胞 30min,PBS 洗涤 3 5 次。室温封闭 30min,加 CK7、HLA鄄G 和 VIM 一 抗(稀 释 比 均 为1 颐 100),4益过夜。PBS 清洗 3 次,每次 5min,加 HRP 标记的二抗(稀释比为1 颐 100)室温孵育1h,PBS 清洗,DAB 显色10 20min。显微镜观察和拍照。1.2.3摇实时荧光定量聚合酶链反应实验(reverse transcrip鄄tion quantitative polymerase chain reaction,RT鄄qPCR)摇按说明书使用 TRIzol 法提取 RNA,将 RNA 逆转录成 cDNA。管家基因 茁鄄肌动蛋白(茁鄄actin)为内参。引物序列:茁鄄actin:F:CATTAAGGAGAAGCTGTGCT,R:GTTGAAGGTAGTTTCGTG鄄GA。HIF鄄1琢:F:GGCAGCAACGACACAGAAAC,R:TG鄄CAGGGTCAGCACTACTTC。扩增条件:预变性 95益,1min;95益,20s,60益,1min,40 个循环。实验重复 3 次,取平均值646现代妇产科进展 2023 年 9 月第 32 卷第 9 期摇 Prog Obstet Gynecol,Sep.2023,Vol郾 32,No郾 9来确定该基因 mRNA 水平表达。缺氧诱导因子鄄1琢(hypoxia鄄inducible factor鄄1琢,HIF鄄1琢)mRNA 相对表达量由 茁鄄actin 矫正后以 2-驻驻Ct计算。1.2.4摇 CCK鄄8 检测摇 将 EVT 细胞按 5伊103/孔接种于 96 孔板,培养 36 48h,给予不同浓度(0、50、100、150、300、600滋mol/L)CoCl2和不同缺氧时间(6、12、24、48h)干预细胞,干预结束后加 10滋L CCK鄄8 于 37益培养箱继续培养 2h。酶标仪检测各孔 OD 值(检测波长为 450nm)。1.3摇 统计学分析摇采用 SPSS24.0 分析,数据以 軃x依s 表示。用 F 检验进行方差齐性检验后,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P0.05 为差异有统计学意义。2摇 结摇 果2.1摇原代 EVT 的体外培养及鉴定摇原代分离的EVT 细胞体外培养 2h 后开始贴壁,24h 后基本贴壁和铺展,贴壁细胞形态多样,多呈上皮细胞样生长,个别细胞呈纤维细胞样。高密度种植时,EVT 细胞间触角相互连接紧密,多数培养 3 4d 逐渐积聚成团,频繁操作易造成细胞片状脱壁。相对绒毛滋养细胞(villous trophoblast,vCTB),EVT 显著特点是细胞发生迁移聚集现象(图 1A),但不会相互融合为多核的合体滋养层细胞(syncytio trophoblasts,STB)。相差显微镜下,细胞呈不规则的多角形,细胞核大居中,胞浆丰富透明。体外培养的 EVT 细胞 CK7(图1B)、HLA鄄G 染色呈棕黄色(图1C)、VIM 浅棕色(图 1D)。随机5 个视野下,染色阳性率高,表明体外培养的细胞为人 EVT 且纯度高,可满足后续试验需要。2.2摇 CoCl2对原代 EVT 细胞存活率的影响摇CCK鄄8 法检测结果显示,EVT 的细胞存活率呈时间和浓度依 赖 性。相 对 于 对 照 组(0滋mol/L CoCl2),600滋mol/L CoCl2组较早出现细胞毒性作用(P 0.05),300滋mol/L 浓度组在 24h 对细胞抑制作用明显,相对对照组,其细胞形态发生明显改变,表现为细胞触角大部分消失,空泡形成增多(图 2),但差异无统计学意义(P0.05),48h 后细胞存活率小于 50%(P0.05)。600滋mol/L 浓度组在缺氧 24h 后细胞基本全部死亡,细胞存活率均小于 50%(P0.05)。见表 1。图 1摇 早孕人 EVT 的细胞形态与免疫细胞化学鉴定A:早孕人 EVT 细胞 HE 染色(伊200);B:EVT 上皮来源性标志基因 CK7 着色呈深棕色(伊400);C:EVT 特异性标志基因 HLA鄄G着色呈深棕色(伊400);D:EVT 间质来源标志基因 VIM 着色呈浅棕色(伊400);E:PBS 阴性对照组,细胞质未见着色(伊400)图 2摇 0滋mol/L CoCl2和 300滋mol/L CoCl2对原代 EVT 细胞形态的影响(伊100)A D:分别为 0滋mol/L CoCl2作用时间 6、12、24h 和 48h;E H:分别为 300滋mol/L CoCl2作用时间 6、12、24h 和 48h746现代妇产科进展 2023 年 9 月第 32 卷第 9 期摇 Prog Obstet Gynecol,Sep.2023,Vol郾 32,No郾 9表 1摇 CoCl2对 EVT 细胞存活率的影响(軃x依s)分组6h12h24h48h#0滋mol/L CoCl2111150滋mol/L CoCl21.07依0.061.17依0.130.99依0.180.95依0.04100滋mol/L CoCl21.03依0.081.11依0.120.89依0.210.87依0.06150滋mol/L CoCl21.00依0.181.03依0.130.84依0.240.76依0.14300滋mol/L CoCl20.95依0.150.94依0.140.66依0.280.25依0.02*600滋mol/L CoCl20.75依0.14*0.87依0.240.28依0.16*0.08依0.04*P0.05 vs 0滋mol/L 相比;#选择扩展方差分析的两两比较(Games鄄Howell 法)2.3摇CoCl2对原代 EVT HIF鄄1琢 mRNA 表达的影响摇 取 150滋mol/L 设时鄄效关系组,相对于对照组 0h,缺氧 6、12、24、48h 组 HIF鄄1琢 mRNA 相对表达量分别是其 0.50 倍、0.64 倍、1.45 倍和 3.00 倍(图3A)。缺氧 24h,CoCl2对 EVT 细胞存活率影响尚可(表1、图4)且HIF鄄1琢mRNA表达量显著增加,因此,取 24h 设量鄄效关系组,相对于对照组,50、100、150滋mol/L CoCl2组 HIF鄄1琢 mRNA 相对表达量分别是其 1.23 倍、1.28 倍、1.58 倍(P0.05)(图 3B)。图 3摇 CoCl2对原代 EVT HIF鄄1琢mRNA 表达的影响A:固定 CoCl2浓度为 150滋mol/L 设时鄄效关系组,各组 HIF鄄1琢mRNA 相对表达量;B:固定 CoCl2时间为 24h 设量鄄效关系组,各组 HIF鄄1琢mRNA 相对表达量图 4摇 150滋mol/L CoCl2对原代 EVT 细胞形态的影响(伊100)A E:缺氧时间分别为 0、6、12、24h 和 48h3摇 讨摇 论由于不同物种间胎盘结构、功能及发育过程存在高度异质性7-8,目前尚缺乏可靠的动物模型,体外模型仍是当前滋养细胞相关疾病的主要研究模型,且多以绒毛膜癌细胞系(如 BeWo、JAR 和 JEG3)或滋养层永生化细胞系(HTR8/SVneo 和 SW71)为主,然而这些细胞系在来源及功能上异于真正滋养层细胞,体外实验数据的代表性和说服力有限9。本研究成功分离和培养原代 EVT,并利用 CoCl2构建了化学性缺氧细胞模型,结果提示适宜的缺氧浓度和时间为 150滋mol/L 和 24h,这为后续研究奠定了体外实验的细胞学基础。氧在整个妊娠期胎盘发育中发挥着重要作用,缺氧环境影响滋养细胞增殖、分化、迁移和侵袭能力,氧调节异常引起胎盘发育不全可导致多种妊娠相关疾病的发生发展2。因此,构建缺氧细胞模型显得尤为重要。细胞缺氧有物理性缺氧法和化学性缺氧法。目前物理性缺氧主要有 2 种方式:(1)培养室构建,通过调节室中气体成分来维持氧气浓度。每次将细胞移出进行操作时,会迅速建立常氧环境,且平衡至所需的低氧气浓度(需较长时间)。而且传感器监测的是培养箱内部气体环境的氧气浓度,非培养液的溶解氧浓度10。(2)液态石蜡隔绝空气法,但是石蜡对培养基液面不完全密封,隔绝氧气的效果不佳,这些最终将影响实验结果的稳定性和准确性10。化学性缺氧法通过在细胞培养液中添加化学试剂实现,如 CoCl2、去铁氧胺和连二亚硫酸钠等10。CoCl2是一种广泛应用诱导体外缺氧的化学试剂。通过异二聚体缺氧诱导因子 1(hypoxia鄄induc鄄ible factor鄄1,HIF鄄1)蛋白的表达来评估缺氧与否,该蛋白由两个亚基组成:HIF鄄1琢 和 HIF鄄1茁。HIF鄄1茁在细胞核中组成型表达,HIF鄄1琢 受氧张力调节。促进 HIF鄄1琢 降解 HIF 特异性脯氨酰羟化酶具有铁结合核心,该核心处的铁被认为对其酶活性至关重要5。这种铁可被钴取代,从而抑制 HIF鄄1琢 降解5。此外,钴抑制 HIF鄄1琢 和 von Hippel Lindau(VHL)蛋白(另一种参与 HIF鄄1琢 降解的蛋白质)之间的相互作用,从而阻止 HIF鄄1琢 的降解11。总而言之,CoCl2主要通过稳定 HIF鄄1琢 表达来模拟缺氧。研究证明,CoCl2诱导的化学性缺氧和真正物理性缺氧相关的下游靶标,如血管内皮生成因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)和葡萄糖转运蛋白 1(glucosetransporter鄄1,GLUT1)的 调 节 是 相 似846现代妇产科进展 2023 年 9 月第 32 卷第 9 期摇 Prog Obstet Gynecol,Sep.2023,Vol郾 32,No郾 9的12-13。CoCl2可用于模拟多种癌细胞系的缺氧,包括乳腺癌和卵巢癌细胞14,15。CoCl2可诱导 HIF鄄1琢 表达,但 Co2+为重金属离子,对细胞本身具有毒性作用,毒性作用大小也因细胞种类不同而有所差异。因此,CoCl2的作用浓度和时间的条件需摸索,以保证细胞在没有受到明显抑制作用状态下成功模拟缺氧。本研究结果显示,随着细胞培养液中 CoCl2浓度和时间的增加,细胞的存活率呈依赖性下降趋势。以 300滋mol/L,24h 为分界点,CoCl2对原代 EVT 细胞的毒性作用趋于明显:0 150滋mol/L 低浓度组随着时间的增加,细胞存活率略有下降,300滋mol/L 浓度组在 24h 后对细胞抑制作用明显,细胞形态发生显著改变,48h 后细胞存活率小于 50%,600滋mol/L浓度组在24h 后表现为细胞存活率均小于50%。然而,由于原代 EVT 获取及实验检测技术应用的局限性,目前利用 CoCl2构建原代 EVT 细胞缺氧模型的文献有限,主要模型仍为绒毛膜癌细胞系和永生化滋养细胞系。Wang 等16报道,HTR鄄8/SVneo 细胞在 200滋mol/L CoCl2浓度下培养 24h 细胞活力明显下降,同样时间下,400滋mol/L 浓度组的细胞存活率小于 50%。Chen 等17统计发现其半数抑制浓度为300滋mol/L,本研究数据与这些结果相近。也有研究18表明,该细胞系的半数抑制浓度高达 500滋mol/L,值得注意的是肿瘤来源滋养细胞系 JEG鄄3 表现为600滋mol/L 的高半数抑制浓度19。以上表明不同来源的同类型细胞,氯化钴对其存活率的影响有较明显的差异。本研究在 CoCl2对原代 EVT 的细胞存活率和细胞状态影响的基础上,选择 150滋mol/L 及以下浓度组进行后续缺氧细胞模型的探索。以 HIF鄄1琢 表达水平确认是否成功构建缺氧细胞模型。对于类型不同的细胞5,CoCl2诱导缺氧的标志 HIF鄄1琢 稳定表达可最早在 2h 内观察到,最大表达峰值出现在 100300滋mol/L 和 12 48h 的浓度和时间范围。本研究结果发现,150滋mol/L 浓度组的 HIF鄄1琢 mRNA 表达在 12h 内是降低的,24h 后其呈时间依赖性增加,缺氧 24h 的 HIF鄄1琢 mRNA 表达增加且显著(P 0.05)。本结果显示,不同浓度组(0、50、100滋mol/L和 150滋mol/L)作用 24h,HIF鄄1琢 mRNA 表达具有浓度依赖性,在一定作用时间内其表达不断增加,但其仅在 150滋mol/L 浓度组表达具有统计学意义(P0.05)。HIF鄄1琢 mRNA 表达幅度增加均不明显,可能原因:CoCl2诱导缺氧在转录和翻译上的差异,这有待后续在蛋白质水平的验证;与细胞自身的自我保护机制有关,由于选取人早孕(6 9 周)原代EVT,在体内正值生理性“缺氧冶阶段1,此时 EVT可能处于缺氧保护状态。综上所述,CoCl2可用于原代人 EVT 细胞的缺氧诱导,成功构建化学性缺氧细胞模型,综合 CoCl2的细胞毒性作用与 HIF鄄1琢 mRNA 的表达,原代 EVT适宜的作用浓度和时间是 150滋mol/L 和 24h,这初步为 EVT 侵袭缺陷等疾病的氧调节研究奠定了可靠的细胞基础。参摇 考摇 文摇 献1摇 Chang CW,Wakeland AK,Parast MM.Trophoblast lineagespecification,differentiation and their regulation by oxygentensionJ.J Endocrinol,2018,236(1):R43鄄R562 摇Burton G,Cindrova鄄Davies T,Yung HW,et al.Hypoxiaand reproductive health:oxygen and development of thehuman placentaJ.Reproduction,2021,161(1):F53鄄F653摇 Soares MJ,Iqbal K,Kozai K.Hypoxia and placental devel鄄opmentJ.Birth Defects Res,2017,109(17):1309鄄13294摇 Jauniaux E,Burton GJ.The role of oxidative stress in pla鄄cental鄄related diseases of pregnancyJ.J Gynecol ObstetBiol Reprod(Paris),2016,45(8):775鄄7855摇 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OG,Franco M,et al.Hypoxia鄄inducible factor鄄1琢(HIF鄄1琢)prot