菱叶绣线菊彩叶园艺品种‘粉霜’和‘黄金喷泉’的叶绿体基因组研究.pdf

热带亚热带植物学报 2023,31(4):510 520 Journal of Tropical and Subtropical Botany 收稿日期收稿日期:2023-01-04 接受日期接受日期:2023-02-10 基金项目基金项目:杭州西湖风景名胜区(市园文局、市运保委)科技发展计划项目(2018-006)资助 This work was supported by the Project for Science and Technology Development of the West Lake of Hangzhou(Grant No.2018-006).作者简介:张巧玲(1982 年生)，女，硕士研究生，从事植物应用及湿地生物多样性保护研究。E-mail:*通讯作者 Corresponding author.E-mail: 菱叶绣线菊彩叶园艺品种菱叶绣线菊彩叶园艺品种粉霜粉霜和和黄金喷泉黄金喷泉的叶绿体基因组研究的叶绿体基因组研究 张巧玲1,陈琳1,张淑燕2,颜海飞3*(1.杭州西溪国家湿地公园生态文化研究中心，杭州 310013；2.华南农业大学生命科学学院，广州 510642；3.中国科学院华南植物园，广州 510650)摘要：摘要：基于菱叶绣线菊(Spiraeavanhouttei)培育出了很多的彩叶园艺品种，其中粉霜彩叶绣线菊(Pink Ice)和黄金喷泉菱叶绣线菊(Gold Fountain)是两个性状优良的品种，这两个彩叶品种的形成机制尚缺乏深入研究。该研究基于二代测序的浅层测序技术，对粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组进行组装、注释、绘制其叶绿体基因组图谱；结合网上已有的绣线菊属植物的叶绿体全基因组开展比较基因组学研究。结果表明，两个品种的叶绿体基因组均为典型的四分体结构，即含有 1 个LSC、1 个 SSC 及 2 个 IR；粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组大小分别为 155 953 和 155 941 bp，各含有 130 个基因，包括85 个蛋白编码基因，37 个转运 RNA 基因和 8 个核糖体 RNA 基因；分别含有 67、69 个简单重复序列，其中，单核苷酸重复序列最多。筛选出这两个叶绿体基因组内 7 个高变异区域，分别为 trnH_GUG-psbA、trnK_UUU、trnR_UCU-atpA、trnT_ GCU-psbD、ndhC、rpl32、ycf1。菱叶绣线菊、粉霜和黄金喷泉虽有非常近缘的关系，但并未聚成单系。该研究首次获得了两种绣线菊属彩叶品种的叶绿体基因组，为进一步理解绣线菊属及其彩叶园艺品种的亲缘关系提供了大量有用信息，并为今后该属更多园艺资源的发掘奠定了基础。关键词：关键词：绣线菊属；园艺品种；叶绿体基因组；系统发育分析 doi:10.11926/jtsb.4769 Chloroplast Genome Analyses of Spiraea vanhouttei Pink Ice and Gold Fountain ZHANG Qiaoling1,CHEN Lin1,ZHANG Shuyan2,YAN Haifei3*(1.Hangzhou Xixi National Wetland Park Ecology&Culture Research Center,Hangzhou 310013,China;2.College of Life Sciences,South China Agricultural University,Guangzhou 510642 China;3.South China Botanical Garden,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650,China)Abstract:Several foliage horticultural varieties have been bred based on Spiraea vanhouttei,including Pink Ice and Gold Fountain,which exhibit excellent horticultural traits.However,the underlying mechanism of these two colorful leaf varieties remain poorly understood.To address this knowledge gap,the complete chloroplast genomes of Pink Ice and Gold Fountain were assembled by using genome skimming sequencing.Comparative genomic analysis of all available chloroplast genomes of the genus Spiraea to date was studied,including variation hotspot analysis,simple repetitive sequence analysis,and phylogenetic analysis.The results showed that both varieties had a typical quadripartite structure,consisting of one LSC,one SSC,and two IRs.The chloroplast genomes of Pink Ice and Gold Fountain were 155 953 and 155 941 bp in size,respectively,and each contains 130 genes,including 85 protein-coding genes,37 transfer RNA genes and 8 ribosomal RNA genes.The two chloroplast genomes also contained 67 and 69 simple repetitive sequences,respectively,with single nucleotide 第 4 期 张巧玲等:菱叶绣线菊彩叶园艺品种粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组研究 511 repeat sequences being the most abundant.There were seven highly variable regions within these two chloroplast genomes,including trnH_GUG-psbA,trnK_UUU,trnR_UCU-atpA,trnT_GCU-psbD,ndhC,rpl32,and ycf1.Finally,phylogenetic analysis revealed that Pink Ice and Gold Fountain could not be considered a monophyletic group,despite their close relationship.Overall,these would provide valuable insights into the chloroplast genomes of two foliage varieties of Spiraea,which would aid in the development of more horticultural resources for this genus in the future.Key words:Spiraea;Horticultural variety;Chloroplast genome;Phylogenetic analysis 叶绿体是植物细胞中一种半自主复制的细胞器，是植物进行光合作用的场所，能将光能转化为化学能进行储存，因此，叶绿体对植物乃至人类的生存至关重要。目前，多数观点认为叶绿体的起源来源于真核细胞早期捕获蓝藻或光合细菌共生形成(内共生假说1)。叶绿体基因组是叶绿体具有的独立遗传物质，最早完成叶绿体基因组测序的物种为烟草(Nicotiana tabacum)2与 地 钱(Marchantia polymorpha)3。在早期，叶绿体基因组序列需首先提取叶绿体 DNA，并随机打断或酶切后才能通过克隆和桑格测序技术获得，获取过程费时费力4，随后，通过设计大量保守引物及长 PCR 方法5使叶绿体基因组学研究进入了快车道。随着高通量测序技术的快速发展，其测序数据通量和准确率都得到了极大提升，而且测序费用较为低廉，使该技术已普遍应用于当前的生物学研究中。基因组浅层测序是一种二代全基因组测序方法，可高效便捷地获取基因组中高重复的基因或区域(如重复元件、核 DNA 的核糖体内转录间隔区等)5。叶绿体基因组在光合组织中的含量较高，约为细胞内总 DNA 含量的 10%20%6，因而基因组浅层测序技术可获得高丰度的叶绿体基因组信息。此外，不断发展的组装及注释技术79也使近年来叶绿体基因组数据呈爆发式增长。植物叶绿体基因组在园艺植物研究方面具有重要价值6，叶绿体基因组可用于园艺植物的起源、演化历史及遗传多样性方面的研究。叶绿体基因组通常为单亲遗传(且绝大多数为母系遗传)，其序列结构及组成相对保守，核苷酸变异虽低于核基因但高于植物线粒体基因。叶绿体基因组的有效群体大小是雌雄异株植物的 1/4 或雌雄同株植物的 1/2，因此叶绿体单倍型的固定时间及溯祖时间都较短，有利于我们发现其遗传变异并追溯其演化历史6。因此，叶绿体基因组在植物起源、演化历史、遗传多样性、杂交方向等领域具有重要研究价值。叶绿体基因组有利于园艺植物的分子定向育种和杂交选育研究。叶绿素含量是植物叶片的重要生理指标,但杂交育种或基因工程会导致核质不亲和或叶绿素合成不正常而形成花叶或白化，增加园艺植物的观赏价值6,1011。叶绿体的合成或质体形成过程中的自发突变是导致一些园艺嵌合体植物如天竺葵(Pelargonium hybridum)、牵牛花(Ipomoea nil)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)、大丽菊(Dahlia pinnata)等花斑现象形成的原因12。最近，有研究比较了 20种嵌合体植物的叶组织(绿叶组织和白化组织)的叶绿体基因组，发现了 8 个叶绿体编码的 RNA 聚合酶或光系统有关的基因中存在 14 个与白化现象产生相关的点突变11。蔷薇科(Rosaceae)绣线菊属(Spiraea)是一类具有重要园艺观赏价值的植物类群。根据最新的蔷薇科分类系统，绣线菊属归属于桃亚科(Amygda-loideae)绣线菊族(Spiraeeae)1314，为北温带分布的大属，全球包含约 90 种(http:/www.plantsoftheworld online.org)，间断分布于欧、亚和北美洲地区。我国是绣线菊属的现代分布和分化中心，多达 70 种(其中 47 种为我国特有15)。因此，我国拥有丰富的绣线菊属的种质资源。绣线菊属植物多为伞形、伞形总状、复伞房或圆锥花序，多数种类具有美丽的花朵、细致的叶片，生性强健，具有耐寒、耐旱、繁殖简便等优点，可应用于花篱、花径、花坛的栽植及园林主景的构造16，是具有重要经济价值的观赏类园艺植物。然而，我国绣线菊属植物的园林应用仅限于几种常见种类，与我国丰富的种质资源十分不符。基于菱叶绣线菊(S.vanhouttei)培育出了多种彩叶园艺品种，其中粉霜彩叶绣线菊(Pink Ice)和黄金喷泉菱叶绣线菊(Gold Fountain)是两个性状优良的菱叶绣线菊品种，表现出较好的园艺价值。近年来，绣线菊属植物的叶绿体基因组研究得到了一些发展。目前，已公开 8 种绣线菊属植物的叶绿512 热带亚热带植物学报 第 31 卷 体基因组数据14,1723，绣线菊属叶绿体基因组具有典型的四分体结构，长度为 156 226155 981 kb，编码基因的数量变化较大，菱叶绣线菊有 129 个编码基因23，而渐尖叶粉花绣线菊(S.japonica var.acumi-nata)有 125 个编码基因22，这可能是注释不完整导致的，因此需进行更详尽的注释及比较基因组学研究。此外，粉霜和黄金喷泉的叶色形成机制及与绣线菊属其他植物的演化关系尚未开展研究。鉴于叶绿体基因组在叶片色素形成及植物亲缘关系及进化方面的重要价值，本研究基于二代测序的浅层测序技术，对粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组进行组装、注释、绘制其叶绿体基因组图谱；结合网上已有的绣线菊属植物的叶绿体全基因组开展比较基因组学研究，探讨粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组的组成及高变异位点；以及这两个品种与绣线菊属植物的亲缘关系，为深入解析菱叶绣线菊及栽培品种的遗传基础和开发绣线菊属的园艺资源奠定基础。1 材料和方法 1.1 植物材料和植物材料和 DNA 测序测序 粉霜彩叶绣线菊(凭证标本号：Yan Hai-Fei Y1940)和黄金喷泉菱叶绣线菊(凭证标本号：Yan Hai-Fei Y1948)植株购自浙江桐乡四季花园家庭农场，并栽种于杭州植物园。凭证标本保存在中国科学院华南植物园标本馆。采集新鲜健康叶片保存在透气的纸袋中，并放入带有变色硅胶的封口袋中干燥保藏。在实验室采用 CTAB 法24从干燥叶片中提取总 DNA，并在深圳华大基因股份有限公司(武汉)的 MGISEQ-2000 基因组测序平台上开展基因组浅层测序，获得原始读长数据(约 2 Gbp)。1.2 叶绿体基因组组装及注释叶绿体基因组组装及注释 原始读长数据在去除接头和低质量数据后，使用软件 GetOrganelle v1.7.3.58进行叶绿体基因组的从头组装。将组装好的序列使用在线注释网站 Geseq(https:/chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html25)进行基因注释，并在 Geneious Prime 2019 软件26中进行适当的手工调整。通过线上工具 OGDRAW v1.3.1(https:/chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html)绘制叶绿体基因组序列物理图谱27。1.3 叶绿体基因组的比较分析叶绿体基因组的比较分析 将叶绿体基因组导入 Geneious Prime 2019 软件,比较叶绿体基因组总长度及大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)和反向重复区(IR)的长度、基因组成、GC 含量等叶绿体基因组的基本信息。利用 mVISTA在线软件(https:/genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)的 Shuffle-LAGAN 模型检测叶绿体基因组的序列异质性。利用在线软件 Reputer(https:/bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/repuer)鉴定叶绿体基因组的重复序列类型(如正向重复、倒置重复、互补重复、回文重复)28；其参数设置为：最小重复长度设置为 8，最小排列值为 50。1.4 叶绿体简单重复序列及核苷酸多态性分析叶绿体简单重复序列及核苷酸多态性分析 使用简单重复序列(SSR)识别软件 MISA29鉴定叶绿体基因组的单核苷酸、二核甘酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸 SSR；每种类型最小重复参数设置依次为 10、5、4、3、3、3；两个 SSR 之间的最小距离设置为 100 bp；当两个 SSR 之间的距离小于100 bp 时识别为复合微卫星(compound SSR)。核苷酸多态性分析采用 DnaSP 6.0 软件30，窗口大小设置为500 bp，步移大小设置为 200 bp。1.5 系统发育分析系统发育分析 从NCBI的GenBank中下载所有绣线菊属物种的叶绿体基因组序列数据，以中华绣线梅(Neillia sinensis)(MT683856)和华北珍珠梅(Sorbaria kirilowii)(NC_062461)为外类群(表 1)。本研究提取出所有叶绿体基因组中共有的蛋白质编码区(Protein-coding genes,PCGs)，并采用 MAFFT v7.308 软件31比对后形成串联序列矩阵。利用 RAxML v8.2.10 软件32序列矩阵进行最大似然树的构建，核苷酸替代模型设置为 GTRGAMMA，执行 1 000 次重复自举抽样以获得系统树上每个分支的支持率。2 结果和分析 2.1 叶绿体基因组的结构叶绿体基因组的结构 粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组长度分别为 155 953 和 155 941 bp，均稍小于菱叶绣线菊(155 957 bp)，也小于绝大多数已知绣线菊属植物，除毛枝绣线菊(Spiraea martini)和蒙古绣线菊(S.mongolica)外(表 1),粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组与其他绣线菊属物种的一致，均为典型的四分体结构，即含有 1 个 LSC、1 个 SSC 和 2 个 IR(图1)。粉霜叶绿体基因组的 LSC、SSC 和 IR 的长度分别为 84 384、18 883 和 26 342 bp，黄金喷泉分第 4 期 张巧玲等:菱叶绣线菊彩叶园艺品种粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组研究 513 别为 84 395、18 860 和 26 343 bp。粉霜与菱叶绣线菊叶绿体基因组的 GC 含量均为 36.8%，而黄金喷泉为 36.7%，说明绣线菊属植物叶绿体基因组的GC 含量相近。通过重新注释并仔细检查，除渐尖叶粉花绣线菊缺失 psaA 基因外，该属叶绿体基因组的基因组成高度保守。表 1 绣线菊属叶绿体基因组的基本特征 Table 1 Chloroplast genome feature of genus Spiraea 序号 No.物种 Species 总长 Total length(bp)大拷贝区 Large single-copy region(bp)重复区Inverted repeat region(bp)小拷贝区 Small single-copy region(bp)GC/%总基因数Total gene number 蛋白质编码基因 Protein-coding gene rRNA 基因rRNA genetRNA 基因tRNA gene 1 绣球绣线菊 S.blumei 155 957 84 384 26 343 18 887 36.8130 85 8 37 2 三裂绣线菊 S.trilobata 155 981 84 417 26 343 18 878 36.8130 85 8 37 3 渐尖叶粉花绣线菊 S.japonica var.acuminata 153 822 82 226 26 344 18 908 36.6129 84 8 37 4 S.insularis 158 637 86 997 26 365 18 910 36.9130 85 8 37 5 蒙古绣线菊 S.mongolica 155 949 84 375 26 340 18 894 36.7130 85 8 37 6 毛枝绣线菊 S.martini 156 226 84 378 26 492 18 864 36.8130 85 8 37 7 珍珠绣线菊 S.thunbergii 155 922 84 360 26 342 18 879 36.8130 85 8 37 8 菱叶绣线菊 S.vanhouttei 155 957 84 384 26 340 18 893 36.8130 85 8 37 9 粉霜 Pink Ice 155 953 84 384 26 343 18 883 36.8130 85 8 37 10 黄金喷泉 Gold Fountain 155 941 84 395 26 343 18 860 36.7130 85 8 37 2.2 叶绿体基因组的基因组成叶绿体基因组的基因组成 基因注释结果表明,粉霜与黄金喷泉叶绿体基因组各含有 130 个基因，包括 85 个蛋白质编码基因，37 个转运 RNA 基因(tRNA gene)和 8 个核糖体 RNA 基因(rRNA gene)。这些基因可划分成光合作用相关基因、自身表达相关基因和其他基因 3 类(表 2)。粉霜与黄金喷泉叶绿体基因组中这 3 类基因的种类和数量均完全一致。光合作用相关的基 表 2 粉霜和黄金喷泉叶绿体基因组的注释基因及其归类 Table 2 Annotated genes and their classification in the chloroplast genomes of Pink Ice and Gold Fountain 类别 Category 基因功能 Gene function 基因 Gene 光合作用相关 Photosynthesis 二磷酸核酮糖羧化酶大亚基 Large subunit of RubiscorbcL 光系统 I Subunit of photosystem I psaA,psaB,psaC,psaI,psaJ 光系统 II Subunit of photosystem II psbA,psbB,psbC,psbD,psbE,psbF,psbH,psbI,psbJ,psbK,psbL,psbM,psbN,psbT,psbZ ATP 合酶 Subunit of ATP synthase atpA,atpB,atpE,atpF*,atpH,atpI 细胞色素 b/f 复合体 Subunit of Cytochrome petA,petB*,petD*,petG,petL,petN NADPH 脱氢酶 Subunit of NADH ndhA*,ndhB*(2),ndhC,ndhD,ndhE,ndhF,ndhG,ndhH,ndhI,ndhJ,ndhK 细胞色素 c C-type cytochrome synthesis ccsA 自身复制相关 Self-replication RNA 聚合酶 RNA polymerase rpoA,rpoB,rpoC1*,rpoC2 核糖体蛋白 Large subunit of ribosome rpl2*(2),rpl14,rpl16,rpl20,rpl22,rpl23(2),rpl32,rpl33,rpl36,rps2,rps3,rps4,rps7(2),rps8,rps11,rps12*(2),rps14,rps15,rps16*,rps18,rps19 核糖体 RNAs Ribosomal RNA rrn4.5(2),rrn5(2),rrn16(2),rrn23(2)转运 RNAs Transefer RNA trnA-UGC*(2),trnC-GCA,trnD-GUC,trnE-UUC,trnF-GAA,trnfM-CAU,trnG-GCC,trnG-UCC*,trnH-GUG,trnI-CAU(2),trnI-GAU*(2),trnK-UUU*,trnL-CAA(2),trnL-UAA*,trnL-UAG,trnM-CAU,trnN-GUU(2),trnP-UGG,trnQ-UUG,trnR-ACG(2),trnR-UCU,trnS-CGA,trnS-GCU,trnS-GGA,trnS-UGA,trnT-GGU,trnT-UGU,trnV-GAC(2),trnV-UAC*,trnW-CCA,trnY-GUA ATP 蛋白酶 ATP dependent protease clpP*其他 Other 核糖体 Maturase matK 乙酰辅酶 A 羧化酶亚基 Subunit of Acetyl-CoACarboxyase accD 囊膜蛋白基因 Envelop membrane protein cemA 保守的开放阅读框 Conserved open reading frames ycf1(2),ycf2(2)，ycf3*,ycf4(2):含有 2 个重复单元；*:含有 1 个内含子；*:含有 2 个内含子。(2):Two repeat units;*:With one intron;*:With two introns.514 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 1 粉霜和黄金喷泉叶绿体基因组 Fig.1 Chloroplast genomes of Pink Ice and Gold Fountain 因均有 45 个，其中 5 个基因(atpF、petB、petD、ndhA 和 ndhB)含 1 个内含子，ndhB 分布在 IR 上,因此具有 2 个拷贝。自身表达相关基因有 61 个基因,其中 rpoC1、rpl2、rps12、rps16、trnA-UGC、trnG-UCC、trnI-GAU、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC均有1个内含子，而clpP含有2个内含子,其中,有15 个基因分布于 IR 上(rpl2、rpl23、rps7、rps12、rrn4.5、rrn5、rrn16、rrn23、trnA-UGC、trnI-CAU、trnI-GAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnR-ACG、trnV-GAC)，因此均有 2 个拷贝。其他基因中的 ycf1 和ycf2 分布于 IR 上，均有 2 个拷贝，ycf3 含有 2 个内含子。2.3 重复序列及简单重复序列重复序列及简单重复序列(SSR)分析分析 在粉霜叶绿体基因组中共鉴定出49个重复序列，其中正向重复和回文重复各 19 个，反向重复 9个，互补重复 2 个;在黄金喷泉中鉴定出 49 个重复序列，其中正向重复和反向重复均与粉霜一致，但回文重复和互补重复分别为20个和1个;在菱叶第 4 期 张巧玲等:菱叶绣线菊彩叶园艺品种粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组研究 515 绣线菊中鉴定到 49 个重复序列，其中 2 个互补重复、21 个回文重复、19 个正向重复、7 个反向重复(表 3)。粉霜、黄金喷泉和菱叶绣线菊的叶绿体基因组分别含有 67、69 和 65 个简单重复序列(表 4)。其中，单核苷酸重复序列最多，4 碱基重复序列次之，2 碱基重复序列均为 6 个。粉霜叶绿体基因组有 1个 5 碱基重复序列，而其余 2 种菱叶绣线菊均不存在这类重复。本研究的 3 种菱叶绣线菊均不存在 3碱基重复和 6 碱基重复，其叶绿体基因组的简单重复特征也基本反映了绣线菊属的情况。2.4 叶绿体基因组变异分析叶绿体基因组变异分析 以三裂绣线菊(S.trilobata)的叶绿体全基因组为参考序列，利用 mVISTA 在线软件基于 Shuffle-LAGAN 模型检测绣线菊属叶绿体基因组的序列异质性(图 2)。结果表明,绣线菊属叶绿体基因组较为保守，特别是 IR 区的变异程度整体较低。变异多发生在大小拷贝区(LSC 和 SSC 区)，特别是基因间隔区(Intergenic spacers:IGSs)的变异信号更多。使用 DnaSP6 软件的滑动窗口方法筛选粉霜和黄金喷泉叶绿体高变区域(图 3)，结果存在7 个高变异区域，分别为 trnH_GUG-psbA、trnK_UUU、trnR_ UCU-atpA、trnT_GCU-psbD、ndhC、rpl32 和 ycf1。2.5 系统发育分析系统发育分析 对10个有叶绿体基因组数据的绣线菊属物种进行了系统发育分析(图 4)。结果表明，除 1 个节点外，其余分支节点均有很高的支持率(95%)；菱叶绣线菊、粉霜和黄金喷泉虽有非常近缘的关系，但并未聚成单系；菱叶绣线菊与绣球绣线菊(S.blumei)形成姐妹群，该分支再与黄金喷泉组成姐妹关系，但其支持率非常低(37%)，其关系并未解决。3 结论和讨论 当前，欧美国家已在原产于亚洲的绣线菊属物种中进行了大量的新品种培育，基于粉花绣线菊(S.japonica)培育出金焰绣线菊(Gold Flame)、金山绣线菊(Gold Mound)、魔毡绣线菊(WalbumaPBR)表 3 绣线菊属植物叶绿体基因组的重复序列 Table 3 Repetitive sequence in chloroplast genomes of Spiraea 物种 Species 互补 Complement 回文 Palindromic 正向 Forward 反向 Reverse 毛枝绣线菊 S.martini 1 21 21 6 绣球绣线菊 S.blumei 2 21 19 7 三裂绣线菊 S.trilobata 2 21 18 8 渐尖叶粉花绣线菊 S.japonica var.acuminata 0 21 15 14 S.insularis 1 17 27 4 蒙古绣线菊 S.mongolica 0 21 18 10 珍珠绣线菊 S.thunbergii 0 21 18 10 菱叶绣线菊 S.vanhouttei 2 21 19 7 粉霜 Pink Ice 2 19 19 9 黄金喷泉 Gold Fountain 1 20 19 9 表 4 绣线菊属叶绿体基因组的简单重复序列 SSR 类型 Table 4 SSR type in chloroplast genomes of Spiraea 物种 Species 单碱基重复 Mononucleotide 2 碱基重复Dinucleotide3 碱基重复 Trinucleotide4 碱基重复 Tetranucleotide5 碱基重复 Pentanucleotide 6 碱基重复 Hexanucleotide总计 Total 毛枝绣线菊 S.martini 55 7 1 10 0 0 73 绣球绣线菊 S.blumei 49 6 0 10 0 0 65 三裂绣线菊 S.trilobata 51 6 0 10 0 0 67 渐尖叶粉花绣线菊 S.japonica var.acuminata 51 8 0 9 1 0 69 S.insularis 55 7 1 9 1 1 74 蒙古绣线菊 S.mongolica 50 6 0 9 0 0 65 珍珠绣线菊 S.thunbergii 51 5 0 8 0 0 64 菱叶绣线菊 S.vanhouttei 49 6 0 10 0 0 65 粉霜 Pink Ice 50 6 0 10 1 0 67 黄金喷泉 Gold Fountain 52 6 0 11 0 0 69 516 热带亚热带植物学报 第 31 卷 图 2 绣线菊属植物叶绿体基因组的比对分析 Fig.2 Alignment of chloroplast genomes of Spiraea 图 3 粉霜和黄金喷泉叶绿体基因组核苷酸多态性(Pi)的滑动窗口分析 Fig.3 Sliding window analysis of nucleotide diversity(Pi)in chloroplast genomes of Pink Ice and Gold Fountain 第 4 期 张巧玲等:菱叶绣线菊彩叶园艺品种粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组研究 517 图 4 基于叶绿体基因组中编码基因构建的绣线菊属植物最大似然树。分支上的数字为支持率 Fig.4 ML tree of Spiraea based on coding genes of chloroplast genomes.Bootstrap values on each branch 等大量园艺品种。菱叶绣线菊是麻叶绣线菊(S.cantoniensis)和三裂绣线菊的人工杂交种，广泛栽培于我国的山东、江苏、广东、广西、四川33。基于菱叶绣线菊培育出了很多的彩叶园艺品种，其中粉霜彩叶绣线菊和黄金喷泉菱叶绣线菊是两个性状优良的菱叶绣线菊品种，具有极高的园艺价值。我国是绣线菊属的现代分布和分化中心，种类多达70 种(其中 47 种为我国特有种15)，拥有丰富的绣线菊植物资源，但其园艺资源亟待开发。绣线菊属叶绿体基因组的研究还未深入开展，据统计，仅有8 个绣线菊属物种具有叶绿体基因组数据14,1723。通过绣线菊属叶绿体基因组学研究将有助于厘清该属植物的遗传资源及亲缘关系，有利于进一步发掘其园艺资源。本研究首次测序组装并分析了绣线菊属中两种重要彩叶绣线菊粉霜和黄金喷泉的叶绿体基因组，发现这两种彩叶绣线菊的叶绿体基因组均为典型的四分体结构，即含有 1 个 LSC、1 个 SSC 和2 个 IR，并与其他绣线菊属物种的叶绿体基因组结构一致，是植物叶绿体基因组中最常见的结构类型34。粉霜和黄金喷泉叶绿体基因组分别为155 953 和 155 941 bp，是绣线菊属叶绿体基因组中较小的。此外，本研究通过比较绣线菊属叶绿体基因组，发现除渐尖叶粉花绣线菊缺失 psaA 基因外，该属的叶绿体基因组在基因组成和 GC 含量均较稳定。一般而言，光合作用相关的 psa 基因以往在寄生植物中大量缺失，可能与寄生植物无需进行光合作用有关3537，而这类基因的丢失现象近年来也在其他植物中发现，可能是由于其他基因(如核基因)发挥了其功能有关38。渐尖叶粉花绣线菊叶绿体基因组丢失 psa 基因的原因值得后续深入研究。叶绿体基因组的编码区序列进化速率慢，因而相对保守，而基因内含子及基因间隔区，以及简单重复序列均有较高的变异速率，叶绿体基因组内不同的区域具有不同变异速率的特点非常适用于不同分类阶元的系统发育研究。例如，保守的编码基因适用于科、目及以上分类阶元的系统发育分析39，而其非编码区可用于近缘物种或种下的进化研究40。叶绿体简单重复序列(SSR)是研究植物系统与进化的重要遗传标记，主要为单核苷酸重复序列4142。在本研究518 热带亚热带植物学报 第 31 卷 中，粉霜、黄金喷泉及菱叶绣线菊的叶绿体基因组均含有最多的单核苷酸重复序列，与以往的研究结果一致41。此外，本研究还发现 4 碱基重复序列也较多，为后续开展相关研究奠定了基础。除叶绿体简单重复序列外，本研究使用滑动窗口方法筛选出粉霜和黄金喷泉的 7 个高变异区域，这些高变位点有 4 个处于编码区，其余位于基因间隔区。在这些高变位点中，trnH_GUG-psbA 和 ycf1 在其他植物中也具有很高的变异，因此曾被推荐为 DNA 条形码候选位点4344。此外，其他片段也具有很高的变异率(特别是 rpl32)，说明这些位点在绣线菊属中具有作为 DNA 条形码位点的潜力，为后续开展相关研究提供了重要研究方向。本研究对 10 个有叶绿体基因组数据的绣线菊属物种进行了系统发育分析，结果表明几乎所有的分支节点均有很高的支持率(95%)。在以往的研究中，菱叶绣线菊与绣球绣线菊、三裂绣线菊等具有非常近缘的亲缘关系，但彼此的关系并未解决45。本研究支持以上结论，并进一步厘清了这些种的关系，说明绣线菊属叶绿体基因组的蛋白质编码区已积累了较大变异，有充足的系统发育信号，为今后大规模开展相关研究奠定了基础。菱叶绣线菊是麻叶绣球和三裂绣线菊的人工杂交种，本研究由于缺少麻叶绣线菊的样品，并不能使用叶绿体基因组进行杂交方向的判定，后续通过引入麻叶绣线菊的样品将有助于解决上述问题。本研究还发现，菱叶绣线菊、粉霜和黄金喷泉虽有近缘关系，但并未聚成单系，这说明两个菱叶绣线菊园艺品种可能分别通过杂交培育的，也可能是由于菱叶绣线菊(尤其是叶的颜色)经历了强烈的人工选择，从而导致其叶绿体基因突变很快积累，并通过无性繁殖的方式保持了这种变异。叶绿体基因组研究可为我们进一步理解绣线菊属及其彩叶园艺品种的亲缘关系提供大量有用信息，为今后发掘该属更多有价值的园艺资源奠定了基础。参考文献参考文献 1 RAVEN J A,ALLEN J F.Genomics and chloroplast evolution:What did cyanobacteria do for plants?J.Genome Biol,2003,4(3):209.doi:10.1186/gb-2003-4-3-209.2