马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2023，44（3）：572-579Chinese Journal of Wildlifehttp：/马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达唐成怡，吴玄烨，吴尽，杨帆，刘学东*（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040）摘 要为探究细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶8基因（CDK8）在马鹿（Cervus elaphus）鹿茸的皮、间充质、前软骨和软骨组织中的mRNA表达水平和该基因编码蛋白的生物学特性，采用 PCR方法克隆马鹿 CDK8基因编码区（CDS）全长序列，并连入 pMD-18T载体，测得核苷酸序列，进行相似性比对和系统进化树构建；利用生物信息学方法分析CDK8蛋白的组成、结构和理化性质；利用实时荧光定量 PCR 技术检测 CDK8基因mRNA在鹿茸组织中的表达水平。结果表明：马鹿CDK8的CDS全长1 254 bp，共编码417个氨基酸；所编码的蛋白相对分子质量为47 744.11，理论等电点（pI）为7.28，是一种无信号肽、定位于细胞核的亲水性不稳定蛋白，共38个磷酸化位点，蛋白的二级结构以无规则蜷曲和螺旋为主。CDK8的mRNA在茸皮组织中表达量最高，其后依次是间充质、软骨和前软骨。CDK8是转录机器中介体复合物的重要组成部分，研究克隆获得马鹿CDK8的CDS全长序列，可为了解鹿茸再生过程中CDK8的作用机制与功能提供重要的基础数据。Bioinformatics Analysis and Tissue Expression of CDK8 Gene in Red DeerTANG Chengyi，WU Xuanye，WU Jin，YANG Fan，LIU Xuedong*（College of Wildlife and Protected Area，Northeast Forestry University，Harbin，150040，China）Abstract：In order to explore the mRNA expression level of cyclin-dependent protein kinase 8 gene（CDK8）in various tissues of red deer（Cervus elaphus）antler velvet and the 稿件运行过程收稿日期：2022-11-25修回日期：2022-12-20关键词：鹿茸；CDK8；生物信息学；组织表达Key words：Deer antlers；CDK8；Bioinformatics；Tissue expression中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：2310-1490（2023）-03-0572-08DOI：10.12375/ysdwxb.20230312基金项目：国家自然科学基金面上项目（31671283）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572019BE01）第一作者简介：唐成怡，女，25岁，硕士研究生；主要从事野生动物遗传学研究。E-mail：*通信作者：刘学东，E-mail：唐成怡等：马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达第3期biological characteristics of the protein encoded by the gene，the full-length coding sequence（CDS）of cyclin-dependent protein kinase 8 gene of red deer was cloned by PCR and connected to pMD-18T vector to measure nucleotide sequences.Thereafter，similarity alignment and phylogenetic tree construction could be carried out，and the resulting nucleotide sequences was further used for similarity comparison and phylogenetic tree construction.The composition，structure and physicochemical properties of CDK8 protein were analyzed by bioinformatics methods.Real-time PCR was used to detect the expression level of CDK8 gene mRNA in antler tissues.The results showed that the coding region of red deer CDK8 was 1，254 bp in length，and a total of 417 amino acids were encoded.The encoded protein has a relative molecular mass of 47，744.11 and a theoretical isoelectric point pI of 7.28，which is a hydrophilic unstable protein with no signal peptide and localized to the nucleus with a total of 38 phosphorylation sites，and the secondary structure of the protein is dominated by irregular curls and helixes.The expression level of CDK8 mRNA is the highest in furry tissue，followed by mesenchymal，then cartilage，and the lowest is in precartilage.CDK8 is an important part of the transcription machine the mediator transcriptional regulatory complex.In this study，the full-length coding sequence of red deer CDK8 was cloned for the first time，which can provide important reference data for us to understand the mechanism and function of CDK8 during antler regeneration.CDK8是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinases，CDK）家族的一员1，参与转录调控2，并以中介体复合物和CDK8亚基复合物的形式参与调控NOTCH信号通路3、Wnt/-catenin信号通路35。当下，关于CDK8的研究集中于肿瘤细胞中的功能及靶向 CDK8的肿瘤抑制剂方面，对野生动物CDK8的研究相对较少。鹿茸为雄性鹿科（Cervidae）动物未骨化而带茸毛的角，每年周期性地生长发育，然后脱落。鹿茸是迄今发现的唯一能够完全再生的哺乳动物器官，可被用作研究器官再生的生物学模型6。鹿茸生长由软骨内骨化所驱动，涉及软骨发育、骨化、血管生长和神经发育等生理过程。NOTCH 信号通路和 Wnt/-catenin 通路能促进鹿茸软骨细胞的增殖和分化7，在鹿茸软骨形成过程中扮演重要角色8。而 CDK8 作为转录机器中介体复合物的重要组成部分，在鹿茸再生中的功能尚无研究。为研究CDK8是否在马鹿（Cervus elaphus）鹿茸的再生发育中起作用，本研究克隆了马鹿 CDK8基因编码区（coding sequence，CDS）序列，并进行生物信息学分析，同时利用实时荧光定量 PCR 技术检测CDK8 的 mRNA 在马鹿鹿茸各组织中的表达差异，为了解鹿茸再生过程中 CDK8 的作用机制与功能提供重要的基础数据，也为马鹿的遗传资源保护与利用提供一定的科学依据。1材料与方法1.1样品采集2022年7月，在秦皇岛野生动物园采集雄性鹿茸，消毒杀菌去除表面茸毛后，将表皮层、间充质层、前软骨和软骨分离并剔除多余组织，切成 0.5 cm0.5 cm0.5 cm 的小块，放入装有组织保存液的 1.5 mL离心管中，冰箱-80 保存备用。1.2鹿茸总RNA的提取和cDNA的合成将组织块取出称量，液氮研磨后按RNA提取试剂盒（南京诺维赞生物科技股份有限公司）说明书提取RNA，并用NanoDrop One（赛默飞公司）测定提取RNA 的浓度及纯度，用 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。然后按照反转录试剂盒（南京诺维赞生物科技股份有限公司）说明书合成总cDNA，冰箱-20 保存备用。1.3CDK8基因CDS区扩增和克隆引物设计：参照GenBank上预测的马鹿CDK8基因（GenBankXM_043891847.1）序列和 GAPDH 基因（XM_043881239.1），在Primer Premier5软件设计扩增 CDS 区引物，在 Primer3 input（https：/primer3.ut.ee/）在线设计qPCR引物，送哈尔滨睿博兴科（东北）生物技术有限公司合成（表1）。用 PCR 仪扩增（型号 SEDI G，威泰克（香港）有限公司），PCR 扩增体系为 50 L：2Rapid Taq 573野 生 动 物 学 报第44卷Master Mix（南京诺维赞生物科技股份有限公司）25 L，上、下游引物各2 L，cDNA模板1 L，ddH2O 20 L。扩增程序：95 预变性 5 min；95 变性 15 s，54 退火 15 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 终延伸5 min；产物4 保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测（电泳仪型号 PowerPacTM HV，Bio-Rad（美国）公司），回收扩增成功的目的条带，再次利用 1%琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop One检测质量及浓度。将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体（宝生物工程（大连）有限公司）连接，连接体系10 L：pMD-18T载体 1 L，PCR产物 2 L，ddH2O 2 L，Solution 5 L；16 连接30 min。连接完成后取3 L产物与30 L大肠杆菌DH-5感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司）混合转化，涂布到含氨苄抗性的LB固体培养基上，37 恒温培养14 h，随后挑取阳性菌落于500 L含氨苄抗性的液体LB培养基中摇菌培养，4 h后进行菌液PCR验证。将验证成功的菌株扩大培养后送往哈尔滨睿博兴科（东北）生物技术有限公司进行双向测序，利用DNAStar软件查看峰图，对序列拼接，并将序列翻译为氨基酸序列。1.4CDK8 基因生物信息学分析及系统进化树构建将测序所获得的马鹿CDK8基因序列及翻译后的氨基酸序列与在 NCBI 获得的家马（Equus caballus）、普氏野马（Equus przewalskii）、山羊（Capra hircus）、野猪（Sus scrofa）、小家鼠（Mus musculus）、川金丝猴（Rhinopithecus roxellana）、红原鸡（Gallus gallus）、艾草松鸡（Centrocercus urophasianus）、美国鲥鱼（Alosa sapidissima）、斑马鱼（Danio rerio）和人（Homo sapiens）的CDK8氨基酸序列比对，并利用SnapGene、MEGA 5.0软件将以上氨基酸序列进行相似性分析和构建系统进化树。利用ExPASy服务器ProtScale模块（https：/web.expasy.org/protscale/）对马鹿CDK8基因编码蛋白质进行疏水性预测，利用在线分析工具 SignalP 4.1 Server（https：/services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）对CDK8蛋白进行信号肽预测，运用在线分析工具 DeepTMHMM（https：/ CDK8蛋白进行跨膜区预测分析，用 NetPhos 3.1（https：/services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1）进 行 磷 酸 化 预 测，再 使 用SOPMA在线分析网站预测马鹿CDK8基因编码蛋白的二级结构（https：/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html），并 用SWISS-MODEL 同源建模法（https：/swissmodel.expasy.org/）对马鹿CDK8基因编码蛋白质的三级结构进行预测。1.5CDK8基因实时荧光定量分析以合成的表皮层、间充质层、前软骨和软骨组织的 cDNA 稀释液为模板进行荧光定量 PCR（荧光定量 PCR 仪型号 CFX96，Bio-Rad（美国）公司），测量CDK8在马鹿鹿茸不同组织内的表达量；以 GAPDH为内参基因，使用2-Ct法计算CDK8在不同组织中的相对表达量，使用引物见表1，每个样本设置3个重复孔。反应体系：模板 4.0 L，上、下游引物各0.4 L，2TransStart Tip Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术股份有限公司）10.0 L，ddH2O 5.2 L，总体系为 20.0 L。反应程序：95 预变性 5 min，表1引物序列信息Tab.1 Primer sequence information基因GeneCDK8CDK8GAPDH引物序列Primer sequenceF：5-ATGGACTATGACTTTAAAGTGAAGC-3R：5-GTACCGATGTGTCTGGTGGG-3F：5-TATGGGTGAAGGTCCTGAGC-3R：5-GGGCTCGGTACCAGAATGTA-3F：5-TCACTGCCACCCAGAAGACC-3R：5-GCAGCGCCAGTAGAAGCAGG-3退火温度/Annealing temperature545460606060产物大小/bpProduct sequence1 251128100目的Objective克隆实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR574唐成怡等：马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达第3期95 变性 10 s，60 退火 30 s，共 40个循环。为验 证引物的特异性，设置熔解曲线程序：95 变性 10 s，由 65 升温到 95，每 5 s 上升 0.5 并读板1次。2结果2.1马鹿CDK8基因CDS区克隆以马鹿鹿茸茸皮组织 cDNA 为模板扩增 CDK8基因CDS区，电泳后获得约1 300 bp的特异性条带（图 1），与预期结果一致。条带回收后与 pMD-18T载体连接并转化，选取菌液PCR阳性样品送测序，将测序结果与不同物种的 CDK8 及马鹿 CDK8 基因 各转录本比对，测序结果与人、鼠和羊等物种的CDK8高度相似，与马鹿CDK8的预测转录本4完全一致，证明马鹿中确实存在转录本 4 且被克隆成功。2.2马鹿CDK8蛋白的生物信息学分析2.2.1序列同源性比对与进化树分析马鹿、普氏野马、山羊、人、小家鼠、红原鸡和斑马鱼等物种的CDK8蛋白序列比对结果显示：该蛋白在哺乳类、鸟类间的相似性高达98%以上，在哺乳类、鸟类和鱼类间的相似性达93%以上（图2）；进化树结果也显示CDK8在各物种间进化保守（图3），说明该蛋白在各物种内的功能及作用机制相对保守。2.2.2CDK8蛋白质分析理化性质：CDK8分子式为C2125H3286N588O631S18，用ProtParam 分析该蛋白序列，马鹿的 CDK8基因 CDS全长为 1 254 bp，共编码 417 个氨基酸，含量最多 的为亮氨酸（7.9%）；相对分子质量为47 744.11，理论等电点（pI）为 7.28，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）和带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）均为 55。亲水性平均值为-0.759，为亲水性蛋白，脂肪系数66.19，不稳定系数40.12，是不稳定蛋白。亲疏水性与跨膜区域：采用在线分析工具ProtScale 中 Hphob./Kyte&Doolittle 算法，以 19 为 1个阅读框（大于1.6的区域为疏水区，小于-1.6的图1马鹿CDK8基因CDS区PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of CDK8 gene CDS region in red deer图2不同种属的CDK8蛋白相似性Fig.2 Comparison of CDK8 protein similarities among different species575野 生 动 物 学 报第44卷区域为亲水区，1.6-1.6的区域为两性区域），对蛋白质的亲疏水性进行分析（图4A），最大值为1.268，最小值为-3.037，且亲水区域大于疏水区域，与ProtParam预测结果一致，属亲水性蛋白，无跨膜区域。用DeepTMHMM对该蛋白进行分析，预测结果显示无跨膜区域，与ProtScale预测结果一致。信号肽与亚细胞定位：SignalP 4.0分析预测结果显示 CDK8 蛋白质不具有信号肽（图 4B）。用WoLF PSORT工具预测CDK8蛋白的亚细胞定位，分数分别为细胞核 17.00，细胞核和细胞质 15.67，细胞质12.00，线粒体7.70，说明CDK8蛋白可能定位在细胞核中。磷酸化位点：用NetPhos 3.1预测CDK8蛋白的氨基酸磷酸化位点，用NetOGlyc 4.0程序预测糖基化位点。结果表明，CDK8蛋白有38个可能的磷酸化位点（图4C），分别为4个酪氨酸（Tyr）、16个苏氨酸（Thr）和 18个丝氨酸（Ser）；CDK8蛋白具有 25个可能的糖基化位点。蛋白质二级结构预测：用在线软件 SOPMA 对CDK8蛋白质的二级结构进行预测分析，CDK8蛋白主要以无规则蜷曲为主，占53.96%，其次为-螺旋和延伸链，分别占 29.98%、12.47%，最少的是 转角，占3.60%（图4D）。蛋白质三级结构预测：用在线分析软件ExPASy中的SWISS-MODEL Work space程序预测马鹿CDK8蛋白质的三级结构（图 4E），相似性达 99.72%，GMQE为0.72（取值为01，值越大可信度越大），以无规则蜷曲和螺旋为主，结构较松散，可能与其在复合物中的支架作用有关。2.3CDK8 基因在马鹿鹿茸各组织中的相对表达量利用 RT-PCR 技术检测 CDK8 基因在马鹿鹿茸各组织中的表达水平，以 GAPDH 为内参基因，用2-Ct法分析，结果如图5所示。经t检验和单因素方差分析，发现CDK8在马鹿鹿茸各组织间的mRNA表达水平差异显著（P0.000 1）。4种组织中，CDK8在茸皮中表达量最高，其后依次是间充质和软骨，前软骨中CDK8表达水平最低。以前软骨为对照组，表达量为（1.000.03），茸皮、间充质和软骨的相对表达量依次是（4.220.38）、（2.710.21）和（1.940.25）。3讨论本研究成功克隆了马鹿 CDK8 基因 CDS 区序列，该序列长1 254 bp，共编码417个氨基酸。同源性分析发现，该基因编码蛋白在马鹿、山羊、家马、普氏野马和红原鸡等物种间的相似性高达98%以上，在哺乳类、鸟类和鱼类间达93%以上，说明CDK8在物种间保守性较高，生理功能作用机制相似，该基因在不同物种间的研究结果有较高的参考意义。对马鹿CDK8蛋白理化性质进行生物信息学预测分析，结果显示CDK8分子式为C2125H3286N588O631S18，相对分子质量为47 744.11，理论等电点为7.28，是亲水性、无信号肽和无跨膜结构的不稳定蛋白，有 38个可能的磷酸化位点。磷酸化、乙酰化和甲基化等蛋白的翻译后修饰可以调节蛋白的激活、灭活和降解。已有研究用蛋白质组学方法找出8个CDK8蛋白的磷酸化位点，但不同位点的修饰对CDK8功能的调节作用还有待研究910。CDK8二级及三级图3不同种属CDK8蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of CDK8 protein among different species576唐成怡等：马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达第3期结构预测结果显示，该蛋白有大量的无规则卷曲和螺旋，三级结构与很多蛋白相比较松散，这可能与该蛋白的功能有关。CDK8可作为支架结合Med12、Med13和周期蛋白C（cyclin C）形成CDK8亚基复合物，以独立于中介体复合物的形式行使组蛋白激酶的功能11。马鹿鹿茸不同组织中，茸皮和间充质层的CDK8表达量最高，CDK8可能在茸皮和间充质组织中起到促进细胞增殖的作用。马鹿鹿茸中茸皮与间充质在最外层，生长最快，细胞增殖和分化也快。CDK8在很多癌症细胞中被认为是原癌基因，有促进细胞增殖、迁移和侵袭的作用。在乳腺癌中，CDK8在乳腺癌细胞中过表达，用miR-26b抑制CDK8的表达，可以抑制癌细胞的增殖，并使人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231、MCF-7 周期停止12。但在子宫内膜癌中，CDK8表现为抑癌基因，在内源CDK8低表达的KLE细胞中使CDK8过表达，在体内小鼠模型中，抑制细胞增殖，有效阻断肿瘤生长，并在体外试验Transwell中抑制细胞迁移；而在内源CDK8高表达的AN3 CA和HEC-1A细胞系中敲除CDK8结果则恰好相反13。在包括卵巢癌在内的多种癌细胞模型中，CDK8还能驱动上皮到间充质的转化。CDK8可通过招募YAP1控制对TGF-/BMP骨形态发生蛋白敏感的SMAD转录激活和周转，SMAD1在广泛的癌症模型中以严重依赖于基质刚度和YAP1的方式驱动上皮到间充质的转化（EMT）14。在胰腺癌中，突变的 K-ras 激活CDK8，部分 CDK8通过 Wnt/-catenin信号通路刺激胰腺癌的上皮-间充质转化15。CDK8在鹿茸前软骨中的表达量比软骨高，比茸皮和间充质低，可能与CDK8调节软骨分化，维持骨图4马鹿CDK8蛋白的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of red deer CDK8 protein注：A.CDK8蛋白疏水性预测；B.CDK8蛋白信号肽预测；C.CDK8蛋白潜在磷酸化位点预测；D.CDK8蛋白二级结构预测（蓝色为-螺旋，红色为延伸链，绿色为-转角，紫色为无规则卷曲）；E.CDK8蛋白三级结构预测Note：A，Hydrophobicity prediction of CDK8 protein.B，Signal peptide prediction of CDK8 protein.C，Potential phosphorylation sites prediction of CDK8 proteins.D，Secondary structure prediction of CDK8 protein（-helix in blue，extended strand in red，-turn in green，random coil in purple）.E，Tertiary structure prediction of CDK8 protein577野 生 动 物 学 报第44卷细胞稳态作用相关。研究人员在用TGF-诱导梅花鹿（Cervus nippon）、塔里木马鹿（C.elaphus yarkandensis）鹿茸间充质干细胞向软骨分化过程中，检测到多个Wnt家族基因表达量增加，初步说明Wnt通路对软骨及软骨骨化有重要的影响1617。除大量研究证明 CDK8可调控 Wnt通路外，小鼠遗传研究表明，骨 髓 间 充 质 干 细 胞 中 的 CDK8 通 过 CDK8-RANKL-STAT1轴控制破骨细胞形成，在骨吸收和体内平衡中起着至关重要的作用18。所以推测CDK8可能参与鹿茸的生长发育，本研究结果也表明，鹿茸不同组织间的CDK8的mRNA表达水平有差异。下一步可通过在鹿茸间充质细胞中过表达/敲减CDK8，进一步研究与软骨及骨化有关的CDK8下游基因。相比于CDK8调控下游基因的研究，CDK8上游基因研究较少，对调控 CDK8上游因子研究多集中于 miRNA，在一些肿瘤细胞试验中略有提及 CDK8的调控通路，在乳腺癌细胞中Skp2与CDK8与肿瘤状态呈正相关，与mH2A1呈负相关。Skp2可泛素化mH2A1，敲低Skp2使mH2A1上调、CDK8下调，肿瘤增殖减小19。目前以CDK8为靶点的肿瘤治疗方式引起高度关注，但多以化学类CDK8抑制剂为主，仅有极少数抑制剂进入临床研究。研究CDK8的作用及调控机制在鹿茸生长发育、肿瘤发生发展与抑制方面都有重大意义，后续可就 CDK8对马鹿不同组织细胞增殖、分化的具体作用做深入研究。参考文献：1 MALUMBRES M.Cyclin-dependent kinasesJ.Genome Biology，2014，15（6）：122.2 LIM S，KALDIS P.Cdks，cyclins and CKIs：roles beyond cell cycle regulation J.Development，2013，140（15）：3079-3093.3 RIBEIRO 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pathwayJ.Cancer Letters，2015，356（2）：613-627.16 开丽比努尔 吾布力，王姗姗，郑永富，等.鹿茸MSCs软骨分图5马鹿CDK8在鹿茸各组织中的表达差异Fig.5 mRNA relative expression of CDK8 gene in different tissues of red deer antler注：空心圆圈代表每组数据各重复孔的具体数值，小写字母不同表示各组间差异显著（p0.000 1）Note：The hollow circles in the figure represent the specific values of each complex well for each set of data.Differences in lowercase letters indicate significant differences between groups（p0.000 1）578唐成怡等：马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达第3期化过程 WNT 信号基因的表达与分析 J.中国畜牧杂志，2018，54（5）：47-53.WUBULI K，WANG S S，ZHENG Y F，et al.Expression and analysis of WNT signal gene during chondrogenesis of pilose antler MSCsJ.Chinese Journal of Animal Science，2018，54（5）：47-53.17 王亮，钟武，陈睦虎.WNT及TGF-信号通路对鹿茸间充质干细胞软骨分化的影响 J.沈阳药科大学学报，2018，35（12）：1052-1057.WANG L，ZHONG W，CHEN M H.Cooperation between TGF-and Wnt pathways during chondrocyte differentiation of velvet antler mesenchymal stem cells J.Journal of Shenyang Pharmaceutical University，2018，35（12）：1052-1057.18 YAMADA T，FUKASAWA K，HORIE T，et al.The 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