慢性乙型肝炎患者接受核苷（酸）类似物治疗后发生低病毒血症的危险因素及机制研究.pdf

目的研究慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者接受核苷（酸）类似物 nucleos(t)ide analogues，NAs治疗下发生低病毒血症(low-level viremia，LLV)的危险因素及机制。方法选取 2021 年 5 月 2023 年 3 月淄博市第一医院感染科门诊就诊的 NAs 治疗疗程大于 48 周且高敏 HBV DNA2 000IU/ml 的 115 例 CHB 患者，根据高敏 HBV DNA 定量结果分为持续性 LLV 组（n=34）、间歇性 LLV 组（n=32）及持续病毒学应答(sustained virologic response，SVR)组（n=49）；收集患者 NAs 治疗前临床特征及实验室指标进行组间比较，采用 Logistic 回归分析确定 LLV 发生的危险因素；抽取患者 NAs 治疗后血清进行肝功能指标、乙型肝炎病毒双链松弛环状 DNA(hepatitis B virus double-strand relaxed circular DNA，HBV rcDNA)及前基因组 RNA(pregenomic RNA，pgRNA)检测并进行结果的组间比较，探讨 LLV 发生的机制。结果持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组及 SVR 组乙型肝炎 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性率分别为 70.59%，53.13%和 10.20%，乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）(lgIU/ml)结果分别为 3.27(3.03，3.61),3.04(2.93，3.26)和 2.99(2.20，3.16)。间歇性 LLV 组和持续性 LLV 组 HBeAg 阳性率均高于 SVR 组（2=14.005，27.192，均 P0.001），持续性 LLV 组 HBsAg 结果高于 SVR 组(Z=-3.375，P=0.001)，差异均有统计学意义(均 P0.05)。Logistic 回归分析发现，患者治疗前 HBeAg 阳性（OR:8.660，95%CI:2.865 26.183）是患者发生LLV 的独立危险因素。持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组及 SVR 组 HBV rcDNA 的阳性率分别为 58.82%，6.25%和 0.00%，pgRNA 阳性率分别为 52.94%，18.75%和 4.08%。持续性 LLV 组 HBV rcDNA 阳性率高于 SVR 组和间歇性 LLV 组（2=20.504，37.974，均 P0.001），持续性 LLV 组 pgRNA 阳性率高于间歇性 LLV 组和 SVR 组（2=8.328,26.199；P=0.005,0.001），差异均有统计学意义。结论CHB 患者 NAs 治疗前 HBeAg 阳性是发生 LLV 的独立危险因素；NAs 治疗后部分 LLV 患者 HBV pgRNA 阳性且定量水平高，HBV rcDNA 维持在较高的合成水平，NAs 无法完成抑制rcDNA 的合成，从而导致 LLV 的发生。关键词：慢性乙型肝炎；低病毒血症；双链松弛环状脱氧核糖核酸；前基因组核糖核酸中图分类号：R512.62；R446文献标识码：A文章编号：1671-7414（2023）05-133-06doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.025Risk Factors and Mechanism of Low-level Viremia in Patients with Chronic Hepatitis B Receiving Nucleos(t)ide Analogues TreatmentL Chengxiua,c，CHEN Meib，WANG Jichuanb，LI Qinga,c，ZHANG Kuntinga,c，SUN Xiaolina,c（a.Department of Clinical Laboratory；b.Department of Infection Diseases；c.Key Laboratory of Molecular Immunology of Laboratory Medicine,Zibo First Hospital,Shangdong Zibo 255200，China）Abstract:ObjectiveTo investigate the risk factors and mechanism of low-level viremia(LLV)in patients with chronic hepati-tis B(CHB)who receive nucleos(t)ide analogues(NAs)treatment.Methods115 CHB patients who received NAs treatment for more than 48 weeks and had HBV DNA2 000IU/ml were selected from the Department of Infection Diseases of Zibo First Hos-pital from May 2021 to March 2023.Based on the results of high sensitivity HBV DNA quantification,patients were divided into persistent LLV group（n=34）,intermittent LLV group（n=32）,and sustained virologic response(SVR)group（n=49）.Clinical characteristics and laboratory indicators of patients with NAs before treatment were collected for inter group compari-son.Logistic regression analysis was used to determine the risk factors for LLV occurrence.The serum of patients under NAs treatment was extracted for liver function indicators,hepatitis B virus double-stranded relaxed circular DNA(HBV rcDNA)and pregenomic RNA(pgRNA)detection.The results were compared between groups to explore the mechanism of LLV occurrence.基金项目：淄博市第一医院院级课题（2022YJKT-28）：CHB 患者低病毒血症与 rcDNA 及 pgRNA 的相关性研究。作者简介：吕承秀(1987-），男，硕士，主管检验师，研究方向：病原体分子生物学检验，E-mail:。通讯作者：孙晓琳(1982-)，女，硕士，副主任技师，研究方向：病原微生物学，E-mail:zb 。134现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.2023ResultsThe HBeAg positive rates in the persistent LLV group，intermittent LLV group，and SVR group were 70.59%，53.13%and 10.20%，respectively.The HBsAg(lgIU/ml)results were 3.27(3.03，3.61)，3.04(2.93，3.26)and 2.99(2.20，3.16)，respectively.The HBeAg positive rates in the intermittent LLV group and the persistent LLV group were higher than those in the SVR group（2=14.005，27.192，all P0.001）,and the HBsAg values in the persistent LLV group were higher than those in the SVR group(Z=-3.375，P=0.001)with statistical significance.Logistic regression analysis found that HBeAg positivity(OR:8.660,95%CI:2.86526.183)before treatment was an independent risk factor for the development of LLV in patients.The posi-tive rates of HBV rcDNA in the persistent LLV group,intermittent LLV group,and SVR group were 58.82%,6.25%and 0.00%,respectively.The positive rates of pgRNA were 52.94%,18.75%and 4.08%,respectively.The positive rate of HBV rcDNA in the persistent LLV group was higher than that in the SVR group and intermittent LLV group（2=20.504，37.974，all P0.001)，the positive rate of pgRNA in the persistent LLV group was higher than that in the intermittent LLV group and SVR group（2=8.328，26.199；P=0.005，0.001),the differences were statistically significant.ConclusionHBeAg positivity before NAs treatment in CHB patients is an independent risk factor for the development of LLV.Some patients under treatment with NAs with LLV had positive HBV pgRNA and high quantitative levels,the synthesis of HBV rcDNA was high level,NAs can not complete the inhibition of rcDNA synthesis,leading to the occurrence of LLV.Keywords:chronic hepatitis B；low-level viremia；double-strand relaxed circular DNA；pregenomic RNA慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染引起的肝脏慢性炎症性疾病。CHB 患者接受核苷（酸）类似物 nucleos(t)ide analogues，NAs 抗病毒治疗可减轻肝脏炎症、逆转或延缓纤维化进程，降低肝细胞癌的发生风险。近年来研究发现1，尽管 CHB 患者长期接受 NAs 抗病毒治疗，仍有约 30%的患者发生低病毒血症(low-level viremia，LLV)。SUN等2-3研究发现 LLV 是 CHB 患者抗病毒治疗后患者纤维化进展及肝癌发生的重要危险因素。目前关于 LLV发生的危险因素及机制尚不明确。本研究旨在分析CHB 患者长期接受 NAs 治疗后发生 LLV 的危险因素，探究 LLV 发生的机制。1材料与方法1.1研究对象选取 2021 年 5 月 2023 年 3 月淄博市第一医院感染科门诊就诊的115例CHB患者。纳入标准：所有 CHB 患者符合慢性乙型肝炎防治指南（2022 版）；患者经 NAs 治疗时间大于 48 周；高敏 HBV DNA 连续检测至少 2 次，每次间隔至少 3 个月，高敏 HBV DNA2 000IU/ml或阴性。排除标准：并发甲、丙、丁型肝炎病毒或其他嗜肝病毒感染者；并发肝衰竭或急性乙型肝炎者；并发恶性肿瘤；酒精、免疫或其他原因引发的肝脏损伤者；用药依从性差的患者。本研究获得医院伦理委员会批准。1.2仪器与试剂SLAN 96P 全自动荧光定量 PCR仪（上海宏石医疗科技有限公司），EZ Bead 全自动核酸提取仪及高敏HBV DNA定量检测试剂盒（山东见微生物科技有限公司），i2000SR 化学发光仪及乙型肝炎五项定量检测试剂盒（美国雅培公司），AU5821 全自动生化分析仪及肝功能检测试剂盒（美国贝克曼公司），乙型肝炎病毒前基因组 RNA(hepatitis B virus pregenomic RNA，HBV pgRNA)定量检测试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司），乙型肝炎病毒双链松弛环状 DNA（hepatitis B virus double-strand relaxed circular DNA，HBV rcDNA）引物及荧光探针（通用生物股份有限公司合成）。1.3方法 1.3.1实验分组：根据 CHB 患者 NAs 治疗后的高敏 HBV DNA 定量结果，将患者分为持续 LLV 组、间歇 LLV 组和持续病毒学应答(sustained virologic response，SVR)组。持续 LLV 组定义为接受 NAs治疗至少 48 周以后，患者连续检测高敏 HBV DNA至少2次，每次间隔36个月，HBV DNA均阳性，但 2 000 IU/ml；间歇 LLV 组定义为接受 NAs 治疗至少 48 周以后，患者连续检测高敏 HBV DNA 至少3次，每次间隔36个月，HBV DNA间歇阳性，但 2 000 IU/ml；SVR 组定义为接受 NAs 治疗至少 48 周以后，患者连续检测高敏 HBV DNA 至少 2次，每次间隔 3 6 个月，HBV DNA 均阴性。1.3.2患者 NAs 治疗前临床特征及实验室指标：医院信息化系统收集患者治疗前临床特征及实验室指标。实验室指标包括乙型肝炎 e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎核心抗体（an-tibody to hepatitis B core antigen，HBcAb）、丙氨酸 氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬 氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总 胆 红 素（total bilirubin，TBil）、-谷 氨 酰 基转 移 酶(-glutamyl transpeptidase，GGT)、清 蛋白(albumin，Alb)、总胆汁酸（total biliary acid，TBA）和血小板计数（platelet count，PLT）。1.3.3患者 NAs 治疗后肝功能、高敏 HBV DNA，HBV rcDNA 及 HBV pgRNA 检测：抽取患者 NAs135现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023治疗后全血，离心分离血清分别进行肝功能(ALT，AST，TBil，GGT，Alb，TBA)检测、高敏 HBV DNA，HBV rcDNA 和 HBV pgRNA 检测。其中高敏 HBV DNA 检测（检出限 10 IU/ml）采用 TaqMan 实时荧光定量法，HBV pgRNA 检测（检出限 50copies/ml）采用 TaqMan 实时荧光定量法，HBV rcDNA（检出限 20 IU/ml）采用 TaqMan 实时荧光法，HBV rcDNA 检测参见文献报道4。1.4统计学方析采用 SPSS23.0 进行数据统计处理，计数资料多组间比较用卡方(2）检验，组间进一步两两比较采用 Bonferroni 检验；正态分布的计量资料用均数 标准差(xs）表示，多组间比较采用独立样本方差分析，组间进一步两两比较采用 LSD-t 检验；非正态分布的计量资料用中位数（四分位间距）M(P25，P75)表示，多组间比较用Kruskal-Wallis H 检验，组间进一步两两比较采用Nemenyi 检验；多因素 Logistic 回归分析 CHB 患者NAs 治疗后发生 LLV 的独立危险因素；P0.05）；HBeAg 阳性率在三组间的差异有统计学意义（2=33.678，P0.001），组间进一步两两比较发现，间歇性LLV 组 和 持 续 性 LLV 组 HBeAg 阳 性 率 均 高 于SVR 组（2=14.005，27.192，均 P0.001）；HB-sAg(lgIU/ml)结果在三组间的差异有统计学意义（Z=12.314，P=0.002），组间进一步两两比较发现，持续性 LLV 组 HBsAg(lgIU/ml)值高于 SVR 组（Z=-3.375，P=0.001）。2.1.2患者 NAs 治疗后发生 LLV 的多因素 Logistic回归分析：见表 2。66 例 LLV 患者（34 例持续性LLV 患者及 32 例间歇性 LLV 患者）与 49 例 SVR患者以是否发生 LLV 作因变量，HBeAg 阳性率、HBsAg(lgIU/ml)作为自变量进行 Logistic 回归分析发现，患者治疗前 HBeAg 阳性（OR:8.660,95%CI:2.865 26.183）是患者 NAs 治疗后发生 LLV 的独立危险因素。表 1 患者 NAs 治疗后发生 LLV 的单因素分析 xs，n(%)，M(P25,P75)项 目持续性 LLV 组（n=34）间歇性 LLV 组（n=32）SVR 组（n=49）2/F/Z 值P 值年龄(岁)48.8510.6148.6310.2649.149.290.0270.973男性 n(%)19(55.88)17(53.13)37(75.51)5.3860.068HBeAg 阳性 n(%)24(70.59)17(53.13)5(10.20)33.6780.001HBsAg(lgIU/ml)3.27(3.03,3.61)3.04(2.93,3.26)2.99（2.20,3.16）12.3140.002HBcAb(S/CO)94.35(22.40,130.97)112.42(69.36,129.80)95.03(51.13,136.73)0.2750.872ALT(U/L)26.90(17.70,61.00)25.20(18.95,84.50)27.90(19.75,50.60)0.4060.816AST(U/L)34.35(25.80,50.00)29.05(23.50,50.25)28.45(21.85,48.50)1.3080.520TBil(mol/L)14.50(12.20,20.20)13.65(12.55,21.25)17.10(13.45,21.45)2.4420.295GGT(U/L)21.70(18.70,36.80)20.10(14.10,39.25)23.95(17.00,38.10)1.0640.587Alb(g/L)42.45(40.40,44.40)42.50(39.75,44.45)42.35(40.20,44.10)0.0300.985TBA(mol/L)3.40(2.00,6.70)2.85(2.00,7.50)2.80(1.85,4.70)1.3440.511PLT(109/L)190.7974.45216.4255.71189.9761.751.1510.323表 2 患者 NAs 治疗后发生 LLV 的多因素 Logistic 回归分析类别SEWald POR95%CIHBeAg 阳性 n(%)2.1590.56414.6260.05）。2.2.2患者NAs治疗后HBV rcDNA检测结果比较：115 例患者中 HBV rcDNA 阳性共 22 例，其中持续性 LLV 组 20 例，间歇性 LLV 组 2 例，SVR 组0 例，三组间 HBV rcDNA 阳性率分别为 58.82%，6.25%，0.00%，差异有统计学意义（2=49.649，P0.001），组间进一步两两比较发现，持续性 LLV组 HBV rcDNA 阳性率高于 SVR 组和间歇性 LLV组，差异均有统计学意义（2=20.504，37.974，均P0.001）。表 3 患者 NAs 治疗后肝功能指标比较 M(P25,P75)项目持续性 LLV 组（n=34）间歇性 LLV 组（n=32）SVR 组（n=49）Z 值P 值ALT(U/L)16.70(13.50,25.50)21.25(13.20,26.50)22.60(13.80,26.90)1.4050.495AST(U/L)23.85(19.00,29.00)22.60(20.20,30.40)22.90(19.20,29.00)0.2970.862TBil(mol/L)15.50(10.80,19.60)13.50(11.25,18.00)15.30(12.40,19.80)0.9960.608GGT(U/L)19.15(14.30,22.50)19.80(13.95,26.25)21.40(15.30,29.40)1.4710.479Alb(g/L)44.20(43.20,45.70)44.80(42.40,45.55)44.50(43.30,46.10)0.1720.918TBA(mol/L)2.55(1.70,4.10)2.60(1.90,4.55)3.20(2.10,4.80)0.9790.6132.2.3患者NAs治疗后HBV pgRNA检测结果比较：115 例患者中 HBV pgRNA 阳性共 26 例，其中持续性 LLV 组 18 例，间歇性 LLV 组 6 例，SVR 组2 例，三组间 HBV pgRNA 阳性率分别为 52.94%，18.75%和 4.08%，差异有统计学意义（2=27.763，P0.001）；三组间 HBV pgRNA（lg copies/ml）定量结果分别为5.561.02,4.290.84和3.420.34，差异有统计学意义（F=7.211，P=0.004）；组间进一步两两比较发现，持续性 LLV 组 HBV pgRNA阳性率高于间歇性 LLV 组和 SVR 组，差异有统计学意义（2=8.328，26.199；P=0.005，0.001）；持续性 LLV 组 HBV pgRNA 定量结果高于间歇性LLV 组和 SVR 组，差异有统计学意义（t=2.728，3.080，P=0.013，0.007）。3讨论随着 HBV DNA 检测试剂灵敏度的提高，约有20%30%长期接受 NAs 治疗的患者血清中存在低水平的 HBV DNA，国内外专家将这种情况定义为低病毒血症（LLV）5-6。目前，LLV 的定义国内外尚无相关标准，鲁凤民等7专家建议将 CHB患者接受恩替卡韦、富马酸替诺福韦酯或富马酸丙酚替诺福韦等一线药物治疗至少 48 周以上，血清 HBV DNA 采用高灵敏 TaqMan 实时荧光定量法(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)仍可检测到，但 2 000 IU/ml，在排除依从性问题及病毒耐药突变后，定义为 LLV；LLV 可以分为两类：持续性 LLV 和间歇性 LLV。CHB 患者接受NAs 药物治疗后发生 LLV 成为目前 HBV 抗病毒治疗的难点和热点。本研究根据 LLV 的定义及分类对纳入研究的 115 例患者分为持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组和 SVR 组，并对患者 NAs 治疗前临床特征及实验室指标比较发现，持续性 LLV 组及间歇性 LLV 组 HBeAg 阳性率明显高于 SVR 组，持续性LLV组HBsAg(lgIU/ml)结果明显高于SVR组，与程齐齐等8的研究结果一致。多因素 Logistic 回归分析发现，患者 NAs 治疗前 HBeAg 阳性是 LLV发生的独立危险因素。HBV 病毒颗粒进入肝细胞,病毒颗粒内的rcDNA 被释放到细胞核中并形成 cccDNA；病毒pgRNA 从 cccDNA 转录并翻译成病毒蛋白，在细胞质中，病毒聚合酶与 pgRNA 结合并被核心蛋白包裹；在核衣壳内，pgRNA 经逆转录酶和病毒聚合酶形成 rcDNA；成熟衣壳被包裹并通过多囊泡体(multivesicular body，MVB)分泌途径作为子代病毒颗粒分泌，完成 HBV 的复制周期4,9。NAs 是一种直接口服抗病毒药物，通过竞争性抑制病毒聚合酶和逆转录酶来抑制 pgRNA 逆转录为 rcDNA，从而形成无感染能力的基因组缺陷子代病毒颗 粒10-11。王雷婕等12-13认为 CHB 患者接受 NAs 抗病毒治疗后发生 LLV 的可能机制为患者较弱的免疫应答状态和 NAs 竞争性抑制病毒复制所特有的局限性。近年来研究发现12，ALT 水平能够反映机体自身免疫应答状态，NAs 治疗后 ALT 水平可能与LLV 的发生有关；ALT 水平低，机体免疫应答较弱，不利于感染HBV的肝细胞清除和cccDNA的丢失，因此，ALT 水平低的患者可能易发生 LLV。然而，也有研究发现 ALT 水平与 LLV 的发生无相关性14。本研究发现，NAs 治疗后 ALT，AST 等肝功能指标在持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组以及 SVR 组间差异无统计学意义。NAs 竞争性抑制病毒复制所特有的一种局限性为患者细胞内大量 dNTP 存在的情况下，NAs 无法完全阻断 HBV pgRNA 逆转录 rcDNA 的合成，137现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023未被阻断的含 rcDNA 的病毒颗粒分泌入血液可继续感染患者肝细胞完成 HBV 的复制周期12。本研究对持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组和 SVR 组患者进行 HBV rcDNA 检测发现，持续性 LLV 组rcDNA 阳性率明显高于间歇性 LLV 组和 SVR 组。持续性 LLV 组患者血液中含 rcDNA 的病毒颗粒导致血清中 HBV DNA 采用高灵敏 qPCR 法仍可检测到，从而导致患者 NAs 治疗后发生 LLV。血液中含 rcDNA 的病毒颗粒可继续感染患者肝细胞完成HBV 的复制周期，导致 LLV 患者纤维化进展及肝癌发生15-16。NAs 竞争性抑制病毒复制所特有的另一种局限性为 NAs 竞争性抑制 HBV pgRNA 逆转录为rcDNA，但对共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的影响较小，cccDNA 的长期存在是 HBV 慢性感染的重要原因17-18。理论上，cccDNA 水平应该是预测预后的最直接指标；然而，由于其分布不均和侵入性检查造成的损伤，cccDNA 的应用受到限制19。研究发现，pgRNA 是cccDNA 的直接转录产物，pgRNA 与 cccDNA 呈正相关且反映 cccDNA 的转录活性20-22。本研究对持续性 LLV 组、间歇性 LLV 组及 SVR 组患者进行pgRNA 检测发现，持续性 LLV 组 pgRNA 阳性率明显高于间歇性 LLV 组和 SVR 组，持续性 LLV 组pgRNA定量结果明显高于间歇性LLV组和SVR组。因此，持续性 LLV 患者 pgRNA 阳性率高及定量水平高，反映 cccDNA 的转录活性强，rcDNA 维持在较高的合成水平，NAs无法完成抑制rcDNA的合成，rcDNA 可被成熟衣壳包裹并通过 MVB 分泌途径作为子代病毒颗粒分泌入血液中，导致血清中 HBV DNA 采用高灵敏 qPCR 法仍可检测到，从而导致患者 NAs 治疗后发生 LLV。综上所述，治疗前 HBeAg 阳性是 CHB 患者NAs 治疗后发生 LLV 的独立危险因素；CHB 患者NAs 治疗后部分 LLV 患者（特别是持续性 LLV 患者）pgRNA 阳性且定量水平高，cccDNA 转录活性强，rcDNA 维持在较高的合成水平，NAs 无法完成抑制 rcDNA 的合成，rcDNA 可被成熟衣壳包裹并通过MVB分泌途径作为子代病毒颗粒分泌入血液中，导致血清中 HBV DNA 采用高灵敏 qPCR 法仍可检测到，从而导致患者 NAs 治疗后发生 LLV，由于血液中 rcDNA 的存在，HBV 可继续感染肝细胞完成HBV 的复制周期，从而导致发生 LLV 患者纤维化进展及肝癌发生。本研究存在以下几点不足之处：因部分患者 NAs 治疗前 HBV DNA 定量结果缺失，未进行基线 HBV DNA 水平对 48 周后 NAs 治疗效果的影响评估；未考虑药物与药物、药物与食物的相互作用对一线 NAs 抗病毒作用的可能影响；样本量相对较少，研究结果可能存在偏倚。因此，CHB 患者接受 NAs 治疗后发生低病毒血症的危险因素及机制还需要大样本和多中心的进一步研究。参考文献：1 ZHANG Qian,PENG Hong,LIU Xiaoqiang,et al.Chronic hepatitis B infection with low level viremia correlates with the progression of the liver diseaseJ.Journal Clinical Translational Hepatology,2021,9(6):850-859.2 SUN Yameng,WU Xiaoning,ZHOU Jialing,et al.Persistent low level of hepatitis B virus promotes fibrosis progression 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