棉花GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析.pdf

山西农业科学 2023，51（9）：974-982Journal of Shanxi Agricultural Sciences棉花 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析张世鹏，刘文丽，程昌豪，李学宝，李扬（华中师范大学 生命科学学院/遗传调控与整合生物学湖北省重点实验室，湖北 武汉 430079）摘要：LIM 结构域蛋白是重要的发育调控因子，常作为肌动蛋白结合蛋白（F-Actin）参与调控细胞骨架建成。为了进一步研究 GhWLIM5在棉纤维中的生物学功能，通过研究棉花的遗传转化并获得相应的转基因植株，同时对多株转基因植株进行表型分析，并通过分子试验对棉花 LIM 蛋白 GhWLIM5在棉花纤维发育中的功能进行相关研究。结果表明，与野生型相比，抑制 GhWLIM5表达的 GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维中肌动蛋白细胞骨架较为稀疏，细胞生长速度降低，成熟纤维较短，纤维强度较弱。通过低速共沉淀检测发现，GhWLIM5 促进F-Actin 成束的能力与 pH 环境密切相关，随着 pH 值的升高，GhWLIM5促进 F-Actin 成束的能力逐渐下降。高速共沉淀结果显示，加入同等浓度 F-Actin的情况下，经高速离心，GhXLIM6存在于沉淀中的比例明显高于 GhWLIM5，说明 GhWLIM5结合 F-Actin的能力弱于 GhXLIM6。纤维品质分析表明，抑制 GhWLIM5的表达还会影响棉纤维次生壁的发育；但实时荧光定量结果显示，与野生型相比，转基因棉花纤维中这些纤维素合酶基因GhCESA4/7/8的表达并未发生明显变化，说明 GhWLIM5可能不直接影响棉纤维次生壁发育。研究结果揭示，GhWLIM5通过结合并维持动态的 F-Actin细胞骨架在棉纤维伸长生长中起重要作用。关键词：陆地棉；纤维伸长生长；肌动蛋白细胞骨架；LIM 蛋白中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：10022481（2023）09097409Function Analysis of Cotton GhWLIM5 in Cotton Fiber DevelopmentZHANG Shipeng，LIU Wenli，CHENG Changhao，LI Xuebao，LI Yang（Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology/School of Life Sciences，Central China Normal University，Wuhan 430079，China）Abstract：LIM domain proteins are important development regulatory factors,and often involved as an actin binding protein(F-Action)in regulating cytoskeleton construction.To further explore the biological function of GhWLIM5 in cotton fiber,in this study,corresponding transgenic plants were obtained by studying the genetic transformation of cotton.At the same time,the phenotypes of several transgenic plants were analyzed,and the function of GhWLIM5 of cotton LIM protein in cotton fiber development was studied by molecular experiments.The results showed that compared with the wild type,the actin cytoskeleton in the fiber of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton inhibiting GhWLIM5 expression was relatively sparse,cell growth rate decreased,mature fibers were shorter,and fiber strength was weaker.Low-speed cosedimentation assay showed that the ability of GhWLIM5 to promote F-Actin bundles was closely related to the pH environment.With the increase of pH,the ability of GhWLIM5 to promote F-Actin bundles gradually decreased.The results of high-speed cosedimentation showed that when the same concentration of F-Actin was added,the proportion of GhXLIM6 in the precipitation was significantly higher than that of GhWLIM5 after high-speed centrifugation,indicating that the ability of GhWLIM5 to bind F-Actin was weaker than that of GhXLIM6.Fiber quality analysis showed that inhibition of GhWLIM5 expression also affected the secondary wall development of cotton fibers.However,real-time fluorescence quantitative analysis showed that the expression of these cellulose synthase genes-GhCESA4/7/8 in transgenic cotton fibers did not change significantly compared with the wild type,indicating that GhWLIM5 may not directly affect the secondary wall development of cotton fibers.Research findings revealed that GhWLIM5 played an important role in cotton fiber elongation by binding and maintaining dynamic F-Actin cytoskeleton.Key words：cotton(Gossypium hirsutum);fiber elongation;actin cytoskeleton;LIM protein棉花为锦葵科棉属植物，是世界范围内重要的经济作物之一，可为纺织工业提供天然原料。目前，doidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.02收稿日期：2023-07-14基金项目：农业部转基因专项（2016ZX08009003）；国家自然科学基金面上项目（32172039）作者简介：张世鹏（1998-），男，湖北襄阳人，在读硕士，研究方向：棉纤维发育及分子机制调控。通信作者：李扬（1983-），女，河南唐河人，副教授，主要从事棉花纤维发育分子调控机制研究工作。974张世鹏等：棉花 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析全球种植最为广泛的是四倍体的陆地棉（Gossypium hirsutum），其纤维产量占总棉花产量的 90%，具有重要的经济价值1。棉花纤维是棉花胚珠表皮细胞分化而来的单细胞毛状突起，其发育过程是一个复杂而高度程序化的过程，可被分为 4 个相互重叠的时期：起始期、快速伸长期、次生壁生物合成期及脱水成熟期2。棉纤维细胞的发育起始于开花当天，大约持续至开花后 5 d，只有 20%30%的胚珠表皮细胞可以分化形成最终的长纤维。起始期和伸长期之间并没有显著的时间节点，通常认为开花5 d 后，棉纤维就已经进入了伸长期，并将持续至20 d。该时期是棉花纤维细胞的快速生长时期，决定着棉纤维的最终长度。在开花后 16 d左右，棉纤维细胞开始大量合成纤维素，标志着棉纤维细胞发育进入了次生壁生物合成期，这个时期纤维素的合成与沉积量决定了成熟棉纤维的强度。这个过程通常持续到 40 d，之后棉纤维发育进入到脱水成熟期3。作为真核细胞细胞骨架重要组成成分之一，肌动蛋白细胞骨架广泛参与细胞的形态维持、细胞器的运动、细胞分裂、细胞迁移、物质的囊泡运输和细胞内信号转导等4-6。棉纤维正常生长发育依赖于细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态行为，早期体外药学试验显示，肌动蛋白结合蛋白（F-Actin）在发育的纤维细胞中参与调控微管的定向7。而在纤维长绒极度缩短的 ligon lintless突变体中，F-Actin 结构呈现不规则排列状态8。此外，抑制棉纤维伸长期优势表达的GhACT1基因的表达，会造成肌动蛋白细胞骨架变少，棉纤维伸长生长受到严重抑制9。肌动蛋白细胞骨架的动态特征依赖于各种肌动蛋白结合蛋白的协同作用，它们通过结合、成核、封端、切割、解聚、成束、交联等方式参与形成不同形态的肌动蛋白骨架10。在棉花中，下调肌动蛋白解聚因子GhADF1的表达能够提高纤维中F-Actin 的聚合度，同时提高棉纤维的长度和强度11。而过量表达 GhPFN2 能够增加纤维细胞的微丝密度及成束度，进而促进纤维细胞中早期纤维素的沉积12。LIM 蛋白是一类古老而保守的蛋白家族，大多包含 1个或多个 LIM 结构域（C-X2-C-X16-23-H-X2-C）-X2-（C-X16-21C-X2-3-（C/D/H），参与蛋白与蛋白的相互作用13。植物中的LIM蛋白被分为4组。其中，亚族又可分为3个类型：PLIM、WLIM及XLIM14。迄今为止，大部分植物 LIM 蛋白都被认定为肌动蛋白结合蛋白，能够促进 F-Actin的成束，调节肌动蛋白动态平衡，并保护 F-Actin 不发生解聚15-18。在棉花中，GhWLIM1a和GhXLIM6也均被报道参与棉纤维中 F-Actin 的成束反应19-20。先前研究表明，GhWLIM5蛋白在体外能够结合 F-Actin并促进 F-Actin 成束，但其在棉纤维中的功能及其与其他 LIM 蛋白是否存在功能差异仍不清楚21。本研究对GhWLIM5蛋白参与棉纤维发育中F-Actin成束调控进行深入探讨，并检测pH对GhWLIM5蛋白功能的影响，同时也比较不同 LIM 蛋白结合和促进 F-Actin 成束能力的差异，为深入理解 LIM蛋白在棉纤维发育中的功能提供重要的科学依据。1 材料和方法1.1试验材料供试棉花品种为陆地棉（Goasypium hirsutum）珂字 312；蛋白表达载体为 pET-28a；植物转化载体为 pBI121；蛋白表达菌株为 BL21；植物转化农杆菌菌株为 LBA4404。1.2试验方法1.2.1载体构建为构建 GhWLIM5 RNAi载体，约 250 bp 的 GhWLIM5 的 CDS 片段首先以反向重复的方式被克隆进 pBluescript SK 载体，然后通过双 酶 切 定 向 连 接 方 式 克 隆 进 pBI121 载 体（35S:GhWLIM5 RNAi）或 pBI101-TUA9载体（TUA9p:GhWLIM5 RNAi），引 物 分 别 为 GhWLIM5-L1、GhWLIM5-R1 和 GhWLIM5-L2、GhWLIM5-R2。为构建 GhWLIM5 和 GhXLIM6 原核表达载体，不含终止密码子的 GhWLIM5、GhXLIM6 的编码序列 被 克 隆 到 pET-28a 载 体 中，引 物 分 别 为 GhWLIM5-EL、GhWLIM5-ER 和 GhXLIM6-EL、GhXLIM6-ER。1.2.2植物材料生长条件棉花种子经浓硫酸脱绒后，28 培养箱中浸泡 1 d后，将露白种子于营养土中在 23 培养室中萌发育苗，16 h 光照/8 h 黑暗。待其生长至二叶期后，移植到大田继续培养。1.2.3高速共沉淀与低速共沉淀将 GhWLIM5和 GhXLIM6 原 核 表 达 载 体 转 入 大 肠 杆 菌 BL21（DE3），用 以 表 达 GhWLIM5 和 GhXLIM6 蛋 白。重组蛋白在天然条件下用 Ni-NTA 琼脂糖进行亲和纯化后，用截流大小为 10 ku 的超滤管将 buffer置 换 为 Exchanged buffer（100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl，pH值 7.4）。高速、低速共沉淀分析利用 Cytoskeleton 公司的 Actin Binding Protein Biochem Kit 进行。首先，将兔源肌动蛋白用 General Actin buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2，pH 值 8.0）溶解至浓975山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期度为 10 mol/L，随后加入到 Actin Polymerization buffer（5 mmol/L Tris-HCl、0.2 mmol/L CaCl2、0.2 mmol/L ATP、1.0 mmol/L DTT、2 mmol/L MgCl2，pH 值 8.0）中 使 G-Actin 聚 合 成 F-Actin。然后将不同浓度蛋白加入到预组装的 F-Actin聚合体系中，于 24 条件下孵育 30 min，于 4 进行离心 1 h（高速共沉淀分析离心力为 200 000 g，低速共沉淀分析离心力为 14 000 g）。上清和沉淀分别收集，SDS PAGE 电泳后用考马斯亮蓝 G250 进行染色分析。1.2.4棉纤维 F-Actin 染色观察棉纤维 F-Actin染色参照 WANG 等17方法进行。将胚珠在含有0.66 mol/L Atto 488 phalloidin、0.1 mol/L PIPES（pH值7.0）、0.05%Triton X-100、1 mmol/L MgCl2、3 mmol/L DTT、0.3 mol/L PMSF、5 mmol/L EGTA和 0.25%戊二醛的 PBS中室温孵育 10 min，漂洗干净后，将纤维从胚珠上切下并固定在载玻片上，加入抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，在激光共聚焦显微镜（徕卡，SP5）下进行观察。1.2.5胚珠体外培养取开花前 1 d 棉桃，用 75%酒精进行表面消毒 1 min，然后用无菌水清洗干净。切开棉桃，取出胚珠置于 BT 培养基（含 0.5 mol/L IAA和 0.5 mol/L GA）中，30 静置避光培养。1.2.6基因表达检测利用天根 RNApre Pure 多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒提取各组织 RNA，利用 HiScript II 1st Strand cDNA synthesis Kit试剂盒将1 g总RNA反转录成cDNA。以GhTUB作为内标进行 qRT-PCR 分析。qRT-PCR 反应条件及基因表达水平计算方法参照文献18的方法进行。1.3数据分析利用 Image J 软件进行微丝定量分析，将微丝图像骨骼化后统计图片的 Skewness 值，代表微丝成束度。使用称量台对总种子数大于 100 粒的质量进行统计，利用量尺对棉纤维长度进行统计，数据以平均值标准差呈现；统计分析采用 SPSS 13及 Excel软件进行。2 结果与分析2.1GhWLIM5 RNAi转基因棉花表型分析为了探讨 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能，分别构建了 35S 启动子和纤维伸长期优势性启动子 TUA9p 启动的 GhWLIM5 RNAi 载体，转化棉花并均获得了一些转基因棉花。其中，35S:GhWLIM5 RNAi 共 2 个株系，TUA9p:GhWLIM5 共4 个株系。对这些转基因棉花（T2）开花后 9 d 棉纤维中 GhWLIM5 的表达量进行检测，结果显示，在转基因棉花纤维中，GhWLIM5 的表达量均发生显著下调（图 1-A）。A.GhWLIM5在野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因棉花中表达水平；B.野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因棉花成熟棉纤维长度比较；C.野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因棉花成熟棉纤维长度；D.野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因棉花种子比较。*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01）。WT.野生型；35S1、35S2.35S:GhWLIM5 RNAi转基因株系 1 和 2；TUA1TUA4.TUA9p:GhWLIM5 RNAi株系 1-4。图 2、3、5同A.Expression level of GhWLIM5 expression in wild type and GhWLIM5 RNAi transgenic cotton;B.Comparison of mature fiber length between GhWLIM5 RNAi lines and wild type;C.Mature fiber length in GhWLIM5 RNAi transgenic cotton and wild type;D.Comparison of cotton seeds between GhWLIM5 RNAi lines and wild type.*indicated significant differences(P0.05);*indicated extremely significant differences(P0.01).WT.Wild type;35S1,35S2.35S:GhWLIM5 RNAi transgenic line 1 and 2;TUA1-TUA4.TUA9p:GhWLIM5 RNAi line 1-4.The same as Fig.2,3,5图 1GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维表型分析Fig.1Phenotype analysis of fiber GhWLIM5 RNAi transgenic cotton976张世鹏等：棉花 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析表型观察发现，这些转基因棉花成熟纤维长度较野生型更短，而其种子大小则没有显著差异（图1-B、1-D）。每个株系随机选取 50颗种子测量棉纤维长度，结果表明，除 TUA9p:GhWLIM5 RNAi株系3（TUA3）及35S:GhWLIM5 RNAi株系 1（35S1）外，其他转基因株系成熟棉纤维长度均较 WT 显著变短。测量和统计结果显示，转基因棉纤维长度较野生型相比均减少 5%15%，二者存在显著或极显著差异（图 1-C）。随后，选取了棉纤维品质 4 个常用性状（纤维长度、马克隆值、纤维强度及伸长率）对野生型及GhWLIM5 RNAi转基因棉花成熟纤维进行了品质分析。由表 1可知，转基因棉花纤维上半部分长度均短于野生型，这与手动测量分析结果基本吻合。同时，GhWLIM5 RNAi 转基因棉花（除 TUA3 外）纤维的强度值也比野生型降低了 4.0%8.9%（表1）。此外，马克隆值作为棉花的重要品质指标，能够有效地反映棉花纤维细度与成熟度22-25，也间接反映了棉纤维细胞壁厚度。品质分析结果显示，野生型棉纤维马克隆值为 5.44，而 大 多 GhWLIM5 RNAi 转基因植株的棉纤维马克隆值则比野生型降低了 2.0%32.4%。这些结果暗示，GhWLIM5可能不仅参与棉纤维伸长生长，还影响棉纤维次生壁发育。为进一步检测纤维生长速度，本研究在体外进行胚珠培养，在快速伸长期测量纤维长度，结果如图 2-A 所示，在相同的培养环境下，野生型棉纤维细胞生长速度快于 GhWLIM5 RNAi 转基因棉纤维细胞。培养 12 d 后野生型棉纤维细胞长度约为12.5 mm，而转基因植株（除 TUA3 外）棉纤维细胞长 度 在 8.010.5 mm（图 2-B）。在 培 养 15、18 d后，转基因植株的棉纤维长度依然短于野生型（图2-C、D）。以上结果说明，抑制 GhWLIM5 的表达能够抑制棉纤维伸长生长，意味着 GhWLIM5在棉纤维伸长生长过程中起着重要作用。表 1 野生型与GhWLIM5表达抑制棉花纤维品质分析Tab.1 Cotton fiber quality analysis of wild type and GhWLIM5 expression inhibited样品PlantWTGhWLIM5 Ri 35S1GhWLIM5 Ri 35S2GhWLIM5 Ri TUA1GhWLIM5 Ri TUA2GhWLIM5 Ri TUA3GhWLIM5 Ri TUA4上半部平均长度/mmFiber upper half mean length30.71a29.44b29.41b28.43c28.19c30.56a29.94ab断裂比强度/（N/tex）Fiber strength30.19a28.00c28.99b28.45bc27.51d30.58a28.75b伸长率/%Fiber elongation ratio5.20a4.77b5.44a4.97ab5.26a4.85b4.92b马克隆值Micronaire units5.44a4.77b3.68c4.89b5.33a5.27a5.13ab注：不同小写字母表示株系间差异显著（P0.05）。Note:Different letters indicated significant differences between lines(P0.05).A.野生型与 GhWLIM5 RNAi转基因棉花离体胚培养 12 d后纤维生长情况；B、C、D.体外培养 12、15、18 d的野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因棉花棉纤维长度 A.Fiber growth of wild-type and GhWLIM5 RNAi transgenic cotton embryos cultured in vitro for 12 days;B,C,D.Fiber length of wild-type and GhWLIM5 RNAi transgenic cotton cultured in vitro for 12,15,18 days图 2GhWLIM5 RNAi转基因棉花胚珠离体培养纤维生长情况分析Fig.2Fiber growth analysis of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton ovules cultured in vitro977山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2.2棉纤维 F-Actin聚合度检测先前研究表明，GhWLIM5 蛋白在体外能够促进F-Actin丝束的聚合21。因此，本研究用Atto 488-鬼笔环肽对处于开花后 12 d的野生型及 GhWLIM5 RNAi转基因植株棉纤维进行染色，分析 GhWLIM5对棉纤维中 F-Actin 细胞骨架的影响。结果表明（图 3），野生型棉纤维中，肌动蛋白丝束与棉纤维细胞生长方向平行，F-Actin 丝束聚合度较高（图 3-A）；而 无 论 是 在 35S:GhWLIM5 RNAi 还 是 在TUA9p:GhWLIM5 RNAi 转基因棉花中，F-Actin丝束的聚合程度都发生了下降（图 3-B、C）。用Image J 对 F-Actin 的 Skewness 值进行计算用以量化 F-Actin的聚合度，结果显示，GhWLIM5抑制程度较高的转基因株系（35S2、TUA1、TUA2）棉纤维 F-Actin 的 Skewness 值显著低于野生型，且 F-Actin 聚合程度和 GhWLIM5 的表达量呈正相关（图3-D）。以上结果表明，GhWLIM5通过增加 F-Actin的成束度调控棉纤维细胞内微丝骨架高级结构重排，进而促进棉纤维的伸长生长。2.3pH对LIM蛋白促进F-Actin成束能力的影响有研究表明，LIM 蛋白促进 F-Actin 成束的能力受到pH的影响26。为检测GhWLIM5的功能是否也受到 pH的调节，本研究表达并纯化了 GhWLIM5蛋白，并在体外进行了 F-Actin聚合反应，利用低速共沉淀检测在不同 pH 环境下 GhWLIM5 促进 F-Actin 成束的能力。结果显示，在加入了相同量的GhWLIM5 蛋白后，pH 条件不一样 F-Actin 的聚合程度不同（图4-A）。测量与统计结果表明，当反应体系中无 GhWLIM5时，不论在哪种 pH 条件下，均有约 40%的 F-Actin 存在于沉淀中，说明 pH 不影响F-Actin的自身聚合能力。但在加入GhWLIM5后，在 pH 值为 6.2 时，处于沉淀中的 F-Actin 比例提高到约 70%；当 pH 值升到 7.0 时，处于沉淀中的 F-Actin比例降至 50%左右；而当 pH值升到 7.4后，处于沉淀中的 F-Actin比例降至和不加 GhWLIM5时一样，均为40%左右（图4-B）。由此可见，GhWLIM5促进 F-Actin 成束的能力与 pH 环境密切相关，随着 pH 值的升高，GhWLIM5促进 F-Actin成束的能力逐渐下降。AC.共聚焦观察野生型、35S:GhWLIM5 RNAi 和 TUA9:GhWLIM5 RNAi 的开花后 12 d 棉纤维中 F-actin 细胞骨架；D.野生型和 GhWLIM5 RNAi转基因棉花开花后 12 d棉纤维细胞骨架 Skewness值统计分析A-C.Confocal observation of wild-type,35S:GhWLIM5 RNAi and TUA9:GhWLIM5 RNAi F-actin cytoskeleton in 12DPA cotton fibers;D.Statistical analysis of Skewness values of 12DPA cotton fiber cytoskeleton in wild type and GhWLIM5 RNAi transgenic cotton图 3GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维中的肌动蛋白细胞骨架Fig.3Actin cytoskeleton in fibers of GhWLIM5 RNAi transgenic cotton978张世鹏等：棉花 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析2.4不同 LIM 蛋白结合 F-Actin能力的比较先前研究表明，不同 LIM 蛋白结合 F-Actin 的能力存在差异15。为比较 GhWLIM5和 XLIM 家族的 GhXLIM6 对 F-Actin 的结合能力差异，将过量GhWLIM5和GhXLIM6蛋白分别与等量F-Actin孵育后进行高速共沉淀试验，检测二者与 F-Actin 的结合能力。结果显示，加入同等浓度 F-Actin的情况下，经高速离心（200 000 g），GhXLIM6存在于沉淀中的比例明显高于GhWLIM5，说明GhWLIM5结合 F-Actin的能力弱于 GhXLIM6（图 5-A）。进而，将不同浓度GhWLIM5和GhXLIM6蛋白与一定量的 F-Actin 进行体外聚合反应后，通过低速共沉淀检测它们促进 F-Actin成束的能力。结果显示，添加到 4 mol/L 的 GhWLIM5 可使 70%的低聚合度的 F-Actin 聚合成高聚合度的 F-Actin 丝束，而达到同样的效果，GhXLIM6 只需要添加到A.高速共沉淀；B.低速共沉淀A.High-speed co-sedimentation assays；B.Low-speed co-sedimentation assays图 5不同 LIM蛋白结合与促进 F-Actin成束的能力比较Fig.5Comparison of ability of different LIM proteins to bind and promote F-Actin bundlesA.不同 pH 条件下 GhWLIM5蛋白与 F-actin低速共沉淀分析；B.不同 pH 条件下 GhWLIM5蛋白与 F-actin低速共沉淀结果定量化。SUP 表示上清，PEL表示沉淀，黑色三角代表 GhWLIM5的加入量逐渐增大A.Low-speed co-sedimentation assay of GhWLIM5 protein and F-actin under different pH conditions;B.Quantification of low-speed co-sedimentation results of GhWLIM5 protein and F-actin under different pH conditions.SUP represented supernatant,PEL represented precipitation,and the black triangle represented a gradually increasing amount of GhWLIM5 added图 4低速共沉淀分析不同 pH条件下 GhWLIM5促进 F-Actin成束能力Fig.4Ability of GhWLIM5 promoting F-Actin bundles under different pH conditions by low-speed co-sedimentation979山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期2 mol/L，说明 GhWLIM5 促进 F-Actin 成束的能力不如 GhXLIM6（图 5-B）。2.5棉纤维中纤维素合酶表达水平比较纤维品质分析结果显示，GhWLIM5 RNAi 转基因棉花成熟纤维断裂比强度低于野生型，说明抑制该基因的表达还会影响棉纤维次生壁的发育。成熟棉纤维中超过 90%为纤维素，为进一步探索该基因是否能和 XLIM 一样调控棉纤维中纤维素合酶GhCESA4/7/8 的表达，进行了实时荧光定量 PCR 试验，结果表明，和野生型相比，在转基因棉花纤维中这些纤维素合酶基因的表达并未发生明显变化（图 6），说明 GhWLIM5 可能不直接影响棉纤维次生壁发育。3 结论与讨论作为细胞内长距离运输的轨道，肌动蛋白细胞骨架在尖端或者极性生长的细胞中，如花粉管、根毛、棉纤维等，发挥着至关重要的作用19-20,27-29。先前研究表明，GhWLIM5 在伸长期的纤维中优势表达，而这个时期是纤维细胞生长速度到达顶峰的阶段21。为了满足细胞快速生长的需求，该时期的纤维细胞需要高效的囊泡及细胞器的运输，也意味着需要更为高效的微丝重排。当具有促进 F-Actin成图 6次生壁相关纤维素合酶基因在GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维中的表达情况Fig.6Expression of secondary wall related cellulose synthase genes in GhWLIM5 RNAi transgenic cotton fibers980张世鹏等：棉花 GhWLIM5在棉纤维发育中的功能分析束功能的 GhWLIM5 蛋白在棉纤维细胞中含量不足时，将直接降低细胞中微丝的成束能力，导致纤维细胞中囊泡及细胞器运输能力下降，抑制棉纤维生长。事实上，目前的研究也证实，在 GhWLIM5 RNAi转基因棉花中，GhWLIM5表达量越低，纤维细 胞 中 微 丝 成 束 程 度 就 越 低，最 终 棉 纤 维 长 度越短。先前研究表明，拟南芥和百合中的 PLIM 蛋白促进 F-Actin 成束的能力受到 pH 的影响，低 pH 环境更利于 PLIM 对 F-Actin 成束的促进作用；而拟南芥中 WLIMs 的活性与 pH 无关15,17。研究显示，在棉花中 WLIM 蛋白 GhWLIM5 促进 F-Actin 成束的能力受到 pH 的调节，这与拟南芥、百合中的PLIM 的特性较为相似。而 GhXLIM6 则表现出与拟南芥中 WLIM 蛋白相似特性，对 pH 相对不敏感26。由此可见，在棉花纤维发育过程中，LIM 蛋白的功能受到更为复杂地调控，同时兼有花粉管和根毛中存在的调控方式，这与棉花纤维生长呈现独特、向顶的扩散性生长模式是相一致的30。此外，虽然抑制 GhWLIM5也会引起棉纤维次生 壁 的 发 育 受 阻，但 和 GhXLIM6 不 同 的 是，GhWLIM5 并不表现出直接调控次生壁基因的表达。这意味着棉花中不同 LIM 蛋白在棉纤维发育过程中出现一定的功能分化，WLIM 类倾向于行使F-Actin 成束蛋白的功能，而 XLIM 类则兼任 F-Actin成束蛋白及转录因子2个角色。先前有研究表明，F-Actin 和微管细胞骨架组织的活性变化不仅关系到纤维的伸长生长，还能够影响到棉纤维次生壁的合成。尤其是纤维细胞中较早形成的肌动蛋白束，能够促进微管重排及纤维素沉积12。而GhWLIM5在纤维发育起始及伸长期均有较高的表达量，意味着该蛋白在这 2 个时期对肌动蛋白丝束的聚合都有着重要的促进作用。在 GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维中，GhWLIM5 的缺失直接导致在纤维生长的早期即发生了 F-Actin 聚合程度的下降，这可能造成纤维细胞中微管重排的紊乱和纤维素沉积的异常，这或许是 GhWLIM5 RNAi转基因棉花纤维细胞壁发育受影响的原因。参考文献：1 WENDEL J F，CRONN R C.Polyploidy and the evolutionary history of cottonM/Advances in agronomy.Amsterdam：Elsevier，2003：139-186.2 LEE J J，WOODWARD A W，CHEN Z J.Gene expression changes and early events in cotton fibre developmentJ.Annals of Botany，2007，100（7）：1391-1401.3 HAIGLER C H，BETANCUR L，STIFF M R，et al.Cotton fiber：a powerful single-cell model for cell wall and cellulose researchJ.Frontiers in Plant Science，2012，3：104.4 CHEUNG A Y，DUAN Q H，SANTOS COSTA S，et al.The dynamic pollen tube cytoskeleton：live cell studies using actin-binding and microtubule-binding reporter proteinsJ.Molecular Plant，2008，1（4）：686-702.5 CHEUNG A Y，NIROOMAND S，ZOU Y J，et al.A transmembrane formin nucleates subapical actin assembly and controls tip-focused growth in