《边做边学-目的DNA片段的体外扩增》导学案2.doc

《边做边学 目的DNA片段的体外扩增》导学案
课前自主导学

知识1
使用PCR仪的安全措施
1.严禁在PCR仪运行过程中打开盖子，否则会造成仪器的永久损坏。
2．样品池及池盖内表面温度较高，当心灼伤。
3．加热器内腔为高温、高压，严禁触及。
4．仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音，请立即停止运行，检查是否有毛细管断裂等故障。
5．仪器运行过程中如果计算机长时间没有反应，仪器也没有任何动作，请切断电源，进行检查。
6．任何时候打开机器外壳时候，都必须切断电源。
7．必须保持样品池内部清洁，可用体积分数为95%的酒精、湿棉签擦拭相关部位。
8．仪器必须放置在PCR实验室里，操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定，做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。
9．当仪器接通电源后，打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害，因此，在进行任何调整、替换、保养或维修之前，请切断所有的电源。

知识2
聚合酶链式反应程序

1.向离心管中加入模板DNA、脱氧核苷酸引物和4种脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
2．变性：在94 ℃高温下作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA。
3．退火(复性)：反应体系的温度降至40～60 ℃，使得引物与作为模板的单链DNA上特定部位相互配对、结合。
4．延伸：反应体系的温度回升到72 ℃左右，在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对的原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。

知识3
目的DNA片段的体外扩增
一、DNA片段的PCR扩增
1．准备器材
2．在0.2 mL PCR薄壁离心管中加入5 μL10×PCR缓冲液，dACP、dCTP、dGTP、dTTP各5 μL，1 μL模板，5 μL引物1和5 μL引物2，29 μL双蒸水。
3．煮沸5 min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/μL加入Taq聚合酶。
4．扩增DNA片断的反应程序：将离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94 ℃的条件下预热，5min，再设置反应程序为：94 ℃，30 s―→56 ℃，30 s―→72 ℃，30 s(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72 ℃，5 min。运行反应程序。
二、DNA分子的测定
1．配制二苯胺试剂
2．取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放入两支试管中，加入等量的二苯胺试剂，混匀后观察溶液的颜色。
3．根据蓝色的深浅，可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有明显的增加。
正误判断
1．DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。(×)
【提示】　是在94 ℃高温解链，不需DNA解旋酶的参与。
2．DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶参与。(×)
【提示】　只需将温度降至40～60 ℃，使引物与模板配对。
3．DNA延伸过程需要Taq聚合酶的作用。(√)
4．所有PCR中使用的引物都是相同的。(×)
【提示】　引物的序列是依据被扩增区域的3′端边界DNA序列确定的。
课堂互动探究

探究1
PCR技术的反应原理与反应过程
【问题导思】　
①如何理解PCR技术的反应原理？
②怎样理解PCR的反应过程？
1．PCR解旋与复旋的原理：DNA热变性的原理

2．PCR的反应过程
(1)变性：当系统温度上升到90 ℃以上时，双链间的氢键打开，DNA解旋为单链，如图

(2)复性：当系统温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合，如图：

(3)延伸：当系统温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A，G，C，T) 在DNA聚合酶的作用下，从引物的3′末端开始，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如图：

3．PCR扩增的计算
理论上DNA呈指数方式扩增。若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后有2n个；若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
名师点拨　
1．PCR原理是高温条件下，在耐高温DNA聚合酶的作用下完成体外DNA的复制。
2．PCR需要适宜，但又不同于细胞内复制的条件。比如耐热的DNA聚合酶，不需添加解旋酶，不需加生物能量ATP，但需添加PNA或DNA引物，能够人为控制温度和复制周期等。

例1　近十年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

(1)加热使DNA双链打开，这一步是打开 键，称为 。
(2)当温度降低时，引物与模板 端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最终合成两个DNA分子，此过程中原料是 ，遵循的原则是 。
(3)PCR技术的必要条件，除了模板、原料、酶以外，至少还需要三个条件，即：液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度由 自动调控，酸碱度则靠 来维持。
(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是(　　)
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链

【思维导图】　

PCR技术―→关键是明确PCR
技术的原理－PCR原理
【精讲精析】　(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性。
(2)PCR技术扩增DNA与细胞内DNA复制所需原料一样，为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸，遵循的原则是碱基互补配对原则。引物与模板的3′端结合后，DNA聚合酶才发挥作用。
(3)PCR技术除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境、适宜的温度和酸碱度，适宜的温度靠PCR仪自动调控，而酸碱度靠缓冲液来维持。
(4)引物的作用是结合在模板DNA上，提供DNA延伸的起始位点，而DNA聚合酶的作用是从引物的3′端开始催化DNA链的延伸，故选D。
【答案】　(1)氢　变性　(2)3′　四种脱氧核苷酸　碱基互补配对原则　(3)PCR仪　缓冲液　(4)D
变式训练
1．下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是(　　)
A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B．DNA复制不需要引物
C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D．PCR扩增的对象是氨基酸序列
【解析】　由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。
【答案】　C

探究2
实验操作的注意事项
【问题导思】　
①实验操作应注意哪些问题？
②PCR扩增成功的关键是什么？
1．PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。
2．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、吸液枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
4．PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。
5．PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。
名师点拨　
1．PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染。
2．在操作中离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果。

例2　下列操作过程的叙述中错误的是(　　)
A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换

【思维导图】　

【精讲精析】　为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中所用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等，在使用前要进行高压灭菌；还要将所用的缓冲液和酶分装成小份；并且使用一次性吸液枪头，则A、B、D项都正确。在使用前，将PCR所需试剂从冰箱内拿出来，放在冰块上缓慢融化，则C项错误。
【答案】　C
变式训练
2．PCR实验中使用的微量离心管、缓冲溶液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是(　　)
A．反复洗涤 B．用酒精擦洗
C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存
【解析】　为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。
【答案】　C
本 课 知 识 小 结
网 络 构 建

结 论 语 句
1．聚合酶链式反应，简称PCR，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的实验技术。
2．向离心管中加入模板DNA、脱氧核苷酸引物和4种脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
3．变性是在94 ℃高温下使模板双链DNA解旋。
4．退火是将反应体系温度降至40～60 ℃，使引物与模板DNA链配对。
5．延伸是将反应体系温度回升至72 ℃左右，在Taq聚合酶作用下，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。