毛蕊花糖苷通过抑制AKT_mTOR通路减轻高糖诱导的HK2细胞凋亡.pdf

基金项目：山西省应用基础研究计划项目（）；山西省留学人员科技活动择优资助项目（）作者简介：刘志龙，男，生，在读硕士，：收稿日期：毛蕊花糖苷通过抑制 通路减轻高糖诱导的 细胞凋亡刘志龙，王军伟，张佩佩，马桂巧，马婵娟（山西中医药大学第三临床学院肾内科，晋中 ；山西医科大学第五临床医学院肾内科；山西省人民医院肾内科；通讯作者，：）摘要：目的探讨毛蕊花糖苷（，）对高糖诱导的人肾小管上皮细胞（，）凋亡的影响及其作用机制。方法采用 法检测对照组（葡萄糖）和不同葡萄糖浓度组（，）细胞活性，筛选最佳高糖干预浓度；检测对照组（葡萄糖）、高糖组（葡萄糖）、甘露醇（，）组（葡萄糖 甘露醇）、不同浓度 组（葡萄糖 ，）和卡托普利（，）组（葡萄糖 ）细胞活性，筛选最佳 干预浓度。细胞分为对照组（葡萄糖）、甘露醇组（葡萄糖 甘露醇）、高糖组（葡萄糖）、组（葡萄糖 ）、卡托普利组（葡萄糖 ）和 （抑制剂）组（葡萄糖 ）分别干预 。荧光染色法和流式细胞术检测各组 细胞凋亡情况，法检测各组 、的表达。结果与对照组相比，葡萄糖组 细胞活性最差（）；相比于高糖组，组细胞活性最强（）。与对照组和甘露醇组相比，高糖组 阳性表达增加，凋亡细胞数量增加（），表达降低，表达均升高（）；相比于高糖组，组和 组 阳性表达减少，凋亡细胞数量减少（），表达升高，、和 表达均降低（）；相比于高糖组，组和 组 表达增加，、表达降低（）。结论 可以通过抑制 信号通路的激活减轻高糖诱导的 细胞凋亡。关键词：毛蕊花糖苷；细胞凋亡；信号通路；糖尿病肾病；细胞中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，；，；，：）：（）（）（，），（），（），（）（），（，），（）（），（），（），（）（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）：；糖尿病肾脏病（，）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病（，）的主要病因之一。近年来我国的发病率在不断上升，逐渐取代慢性肾小球肾炎成为慢性肾脏病的主要原因 ，。糖尿病肾脏病存在十分复杂的代谢紊乱 。肾小管及其间质占肾实质的 以上，肾小管上皮细胞的凋亡过度是 的重要发病机制之一 ，。在 患者，模型小鼠和大鼠的肾切片中已检测到肾小管上皮细胞的凋亡 。肾小管上皮细胞凋亡是疾病进展的可靠预测因子，也是 进展的重要标志。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（，）属于磷脂酰肌醇激酶相关的激酶（）家族 ，是细胞生长和增殖的重要调节因子。位于许多信号通路主要的连接处，作为组织中葡萄糖代谢和脂肪生成的关键因子，过度激活容易影响甚至导致肥胖和糖尿病 。属于中医范畴“消渴”中的“肾消”，中医治疗以补肾固涩为核心，以封藏为主，这一治则与现代医学中的“抗凋亡”理念不谋而合 。中医统筹丰富多样的中草药和几千年的治疗经验，结合传统理论创造出许多经验方。地黄叶总苷胶囊是一种临床常用的中成药制剂 ，大量临床研究证明地黄叶总苷胶囊可以减少 患者的蛋白尿，延缓肾脏病进展 ，其主要作用成分为毛蕊花糖苷 。毛蕊花糖苷（，）广泛分布于双子叶植物中，具有多种药理活性：抗氧化、抗炎、抗癌、神经保护、心血管保护、抗糖尿病、骨和软骨保护、肝保护和抗菌性等 。可以通过对 、和 等多条信号通路的影响发挥其药理作用，但是其在糖尿病肾脏病中的作用机制尚未完全阐明。因此本文旨在讨论 对高糖干预人肾皮质近曲小管上皮细胞（，）凋亡的影响，并通过与现有临床常用药物卡托普利的干预效果进行对比，进一步探讨其临床应用价值，为 的治疗提供新的思路。材料和方法 主要试剂毛蕊花糖苷（，）、卡托普利（，）来自美国 公司；抗体、（）抗体、抗体、（）抗体、抗体、抗体、抗体、抗体、抗体来自武汉 公司；抗体来自美国 公司；膜（美国 公司）；发光液（中国 公司）；试剂盒（武汉 公 司）；（美 国 公司）。细胞培养人肾皮质近曲小管上皮细胞系（，）购自中国丰晖生物，从液氮罐中取出 细胞，在超净工作台内复苏。使用含 的低糖 （美国 公司）培养液，置于 ，体积分数 的培养箱中培养。当细胞密度生长至 时，胰蛋白酶消化，传代培养。法检测细胞活性将对数生长期的细胞以 密度接种于 孔板中。细胞分为对照组（葡萄糖），不同浓度葡萄糖组（，），采用 法检测各组细胞活性，筛选高糖干预糖浓度；细胞分为对照组（葡萄糖），高糖（）组（葡萄糖），甘露醇（，）组（葡萄糖 甘露醇），不同浓度 组（葡萄糖 ，），卡托普利（，）组（葡萄糖 ），在 和 二氧化碳条件下干预培养 。采用 法检测各组细胞活性，筛选 药物干预浓度；其中卡托普利作为阳性对照药物（在现代研究中已经被证明有确切的肾脏保护作用，并可以调控凋亡相关通路的表达 ）。每组设 个复孔。干预山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期 后，加入 溶液，孵育细胞 ，用酶标仪检测 处的 值。蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达细胞分为对照组（葡萄糖）、甘露醇组（葡萄糖 甘露醇）、高糖（）组（葡萄糖）、组（葡萄糖 ）、组（葡萄糖 ）、（抑制剂）组（葡萄糖 ），分别干预处理 ，使用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的预冷 裂解缓冲液对 细胞进行裂解以提取蛋白。法测定蛋白浓度。通过 分离，转移到 膜上，用含有 脱脂牛奶的 缓冲液室温封闭 ，与相应的一抗：（），（），（），（），（），（），（），（），（）孵育过夜，洗涤膜 次，每次 ，室温下孵育二抗，洗涤膜 次，每次 。使用超敏性 发光液进行显影，并用 软件进行定量分析。以探究 对 的保护作用，以及 通路的表达情况。免疫荧光法和 法检测细胞凋亡情况取对数生长期 细胞按每孔 个接种于铺有细胞爬片的 孔板，细胞分为对照组（葡萄糖）、甘露醇组（葡萄糖 甘露醇）、高糖（）组（葡萄糖）、组（葡萄糖 ）、组（葡萄糖 ），分别干预处理 。细胞经 多聚甲醛 固定 ，洗涤后置于含 的 中 ，平衡缓冲液 覆盖细胞，室温下放置 ，湿盒（含孵育缓冲液、核苷混合物和重组末端核苷酸转移酶）避光孵育 后洗涤，浸入 柠檬酸钠缓冲液终止反应，加入 荧光染剂染核，洗涤，用抗荧光淬灭封片液封片。用激光共聚焦显微镜（德国 公司）检查图像。这些切片由两名研究人员以盲法的方式进行独立评估。流式细胞术检测细胞凋亡情况细胞分为对照组（葡萄糖）、甘露醇组（葡萄糖 甘露醇）、高糖（）组（葡萄糖）、组（葡萄糖 ）、组（葡萄糖 ）、（抑制剂）组（葡萄糖 ），分别干预处理 。细胞用 洗涤，用 胰蛋白酶（不含 ）消化。离心后弃上清，清洗两次。收集细胞悬液（个细胞），离心 。弃上清后加入 结合缓冲液。将 和 分别加入细胞悬液中，在黑暗处孵育 。通过流式细胞术分析细胞凋亡水平。统计学分析应用 统计学软件进行数据的统计学分析。符合正态分布的计量资料采用（珋 ）表示，两组间比较使用成组 检验，为差异有统计学意义；三组间比较使用单因素方差（）分析，两两比较采用 法，认为差异有统计学意义。结果 促进高糖培养 细胞增殖本实验中，我们通过 实验对不同葡萄糖浓度和不同 浓度干预的 细胞进行细胞活性的检测，发现葡萄糖浓度在 时 细胞的活性受到抑制（，见图 ），选取该浓度进行后续的干预研究。对 的细胞活性有提升作用，在干预浓度达到 时，细胞活性最强（，见图 ）。抑制高糖培养 凋亡 结果显示，与对照组相比，高糖组 、的表达显著增加，表达降低（）；与高糖组相比，组 、表达降低（），表达增加（，见图 ）。接下来对干预后的 进行了 和 免疫荧光标记，与对照组相比，高糖组 的阳性表达明显更强；与高糖组相比，组和 组 表达则明显降低（见图 ）。在流式细胞术中我们也有着一致的结果，相比对照组，高糖组凋亡细胞明显增加，尤其表现在早期凋亡；相比高糖组 组干预后凋亡细胞显著减少（，见图 ）。，与 比较，与 组比较，；与 组比较，图 法检测不同葡萄糖浓度以及不同 浓度下 细胞的增殖情况（）（）与 组比较，；与 组比较，图 检测各组细胞凋亡相关标志物的表达情况（）（）抑制高糖干预 细胞 通路激活在本实验中通过 对 细胞 通路表达进行了检测，结果显示相比对照组和甘露醇组，高糖组 、表达显著增加（）；与高糖组相比，组和 组 、表达降低（，见图 ）。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期图 法检测 干预高糖环境下细胞凋亡情况（）（）与 组比较，；与 组比较，图 流式细胞术检测 和高糖对细胞凋亡的影响（）（）和 都可以抑制高糖干预 的凋亡为验证 是否通过 通路发挥抑制凋亡的作用，我们通过使用 抑制了 上游 的表达，阻断了该通路的后续表达，本实验中 与 对于高糖干预的 细胞有着一致的影响，抑制了 和 的表达，增强了 的表达（，见图 ）。，与 组比较，；与 组比较，图 检测 和高糖对细胞通路相关标志物表达的影响（）（）与 组比较，；与 组比较，图 检测 对高糖环境下细胞凋亡的影响（）（）讨论 以肾小球硬化、肾小管间质纤维化和肾血管疾病为主要特征，其中肾小管上皮细胞病变与肾功能恶化的关系十分密切 。早期只有 的糖尿病微量白蛋白尿患者有典型的肾小球结构损伤，而肾小管损伤更为严重 ，因此对于肾小管的治疗在 整体治疗中至关重要。肾小管上皮细胞的凋亡在 进程中是促进 病情进展的重要因素 ，病理过程中 的凋亡脱落过程往往是不可逆的。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡的过程。半胱天冬酶（），是细胞凋亡的主要介质 。其中 通常被认为是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，而其活化引起的细胞凋亡这一过程可以被 淋巴细胞瘤 基因（）阻断，而同属 家族的 （）的过表达则对 有着阻抑作用，二者皆广泛表达于肾小管上皮山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期细胞中 ，。作为经典的信号通路 信号通路中重要的一环，在细胞存活和凋亡中起重要作用 。很多研究表明，及其下游信号分子的激活往往会促进凋亡的发生 ，大量研究也在 患者肾脏切片中发现了 的高表达，而 的激活往往会进一步激活下游的 的表达 ，进而影响胰岛素的吸收和利用，影响脂质代谢。但是直接使用雷帕霉素的患者会经历更严重的胰岛素抵抗，这可能是因为雷帕霉素治疗破坏了 ，削弱胰岛素利用效率。为了避免这些副作用，有必要开发新的、真正特异性的 抑制剂，以及 功能的组织特异性调节剂。近些年研究发现，临床常用药物地黄叶总苷的主要有效成分毛蕊花糖苷可以通过影响一些信号通路的表达进而有效地保护肾脏组织，减轻病理损伤。比如可以通过抑制 通路的表达进而减少高糖模型下肾脏组织炎症反应和氧化应激 ，通过调控 信号通路减少慢性肾病中炎症反应的发生并延缓纤维化进程 等。并且本课题组在先前的研究中发现 可以通过抑制 通路的激活进而调控足细胞的自噬与凋亡 ，那么 能否通过抑制 通路的表达进而减轻 中肾小管上皮细胞的凋亡，是本研究旨在讨论的可能机制。本实验发现，体外实验中 表现出对高糖干预的 细胞显著的保护作用，在蛋白免疫印迹法实验中 、表达受到抑制，得到激活，提示 在一定程度上能够抑制肾小管细胞的凋亡，在 荧光染色和流式细胞术实验中我们也能看到类似的趋势，在流式细胞术的结果中我们可以看到经过 治疗凋亡细胞明显减少，这一点尤其体现在早凋的进程中，早凋的抑制有效避免了细胞的进一步凋亡和细胞状态的进一步恶化。同时，通过 的治疗抑制了在高糖条件下激活的 的表达，就此我们提出 的治疗有可能通过抑制 通路的激活来达到抑制凋亡的作用，减缓疾病进展的作用。因此，本实验进行了下一步的检测，通过 抑制 上游信号的表达，抑制该通路进一步的激活，再次进行蛋白免疫印迹法分析，我们发现 与 对 、的影响有着相同的趋势。最终，我们提出，可能通过抑制 通路的激活从而减轻高糖诱导的 的凋亡，减轻细胞损伤。但是本实验还缺乏进一步的临床验证，在临床的应用价值也值得进一步探讨。综上所述，我们通过研究发现毛蕊花糖苷可以通过抑制 通路的激活，进而减少高糖诱导的 细胞的凋亡，减轻细胞损伤。参考文献：，：，：，：，（），：，？，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：许惠越，闵晓俊 浅谈 金匮要略 论述消渴基础病机 光明中医，（）：冉丽莎，吴亚曾，劳筱清，等 糖尿病周围神经病变细胞凋亡机制及中医药干预研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：，：刘俊平，梁芳 地黄叶总苷联合替米沙坦对糖尿病肾病患者蛋白尿的影响 中国现代医生，（）：，书书书 ，（）：，：，：，：，：，（），：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：隋吉峰，原艺，李铮，等 真武汤通过 通路改善转基因扩张型心肌病小鼠心功能的作用机制 中华中医药学刊，（）：，：，：李小亚 毛蕊花糖苷通过抑制 信号通路减轻 小鼠足细胞凋亡 太原：山西医科大学，山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期