利用TurboID邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法.pdf

DOI：10.11689/sc.2023030101刘佳欣，何明良，刘颖湘，等.利用 TurboID 邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法J.土壤与作物，2023，12（3）：256 263.LIU J X，HE M L，LIU Y X，et al.Experimental method for obtaining interaction proteome using TurboID-based proximity labeling technologyin riceJ.Soils and Crops，2023，12（3）：256 263.利用 TurboID 邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法刘佳欣1，何明良2,3，刘颖湘2,3，卜庆云2，李秀峰2，王臻昱2，刘剑锋1，田晓杰2（1.吉林师范大学 生命科学学院,吉林 四平 136000；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所,黑龙江 哈尔滨 150081；3.中国科学院大学,北京 100049）摘要：TurboID 邻近蛋白标记（TurboID-based proximity labeling,TbPL）技术是将诱饵蛋白融合 TurboID 生物素连接酶，在该工具酶的作用下将生物素标记到邻近蛋白上，最终通过链酶亲和素偶连磁珠将邻近蛋白富集下来，通过质谱分析的方式获得互作蛋白组。本文主要以水稻重要转录因子 OsWRKY53 为例，详细描述了利用 TbPL 技术获得水稻互作蛋白组的方法和注意事项。关键词：水稻；TurboID；邻近蛋白标记；互作蛋白组；实验方法中图分类号：Q756；S511文献标识码：AExperimental method for obtaining interaction proteome using TurboID-basedproximity labeling technology in riceLIU Jiaxin1，HE Mingliang2,3，LIU Yingxiang2,3，BU Qingyun2，LI Xiufeng2，WANG Zhenyu2，LIU Jianfeng1，TIAN Xiaojie2（1.College of Life Sciences,Jilin Normal University,Siping 136000,China；2.Northeast Institute of Geography and Agroecology,Chinese Academy of Sciences,Harbin 150081,China；3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China）Abstract：The TurboID-based proximity labeling(TbPL)technology is to fuse the bait protein with the TurboID biotin ligase;thenmark the biotin to the neighboring protein of bait protein under the action of the tool enzyme;finally,enrich the neighboring proteinthrough the streptavidin magnetic beads to obtain the interaction proteome through mass spectrometry analysis.TakingOsWRKY53,an important transcription factor,as an example,this article mainly describes the method and precautions for obtaininginteraction proteome using TbPL technology in rice.Key words：rice；TurboID；proximity labeling；interacting proteome；experimental method 0引言邻近蛋白标记（Proximity labeling,PL）是研究活体细胞内蛋白互作组和亚细胞结构蛋白组的一项重要技术，常用工具酶包括：抗坏血酸过氧化物酶（Engineered Ascorbate Peroxidase,APEX）、大肠杆菌生物素连接酶 BirA 的 R118G 位点突变体-AMP（BirA R118G,BioID）以及 BirA*定向进化的生物素连接酶TurboID1 5。TurboID 较 APEX、BioID 具有催化效率高、对温度要求低（催化温度为 22 30）及 收稿日期：2023 03 01；修回日期：2023 05 06.基金项目：黑龙江省自然科学基金（YQ2022C038）；中国科学院青年创新促进会项目（2021229）；中国科学院东北地理与农业生态研究所青年科学家小组项目（2023QNXZ02）.第一作者简介：刘佳欣（1998），女，在读硕士，研究方向为水稻分子育种.E-mail:.共同通信作者：刘剑锋(1976），男，教授，研究方向为植物学.E-mail:.田晓杰（1989），女，副研究员，研究方向为水稻分子育种.E-mail:.土壤与作物 2023 年 9 月 第 12 卷 第 3 期Soils and Crops,Sep.2023,12（3）：256 263标记范围广等优点，能将活体细胞内约 10 nm 范围内的邻近蛋白进行生物素标记，在植物和动物体系中得到广泛应用6。TurboID 邻近蛋白标记（TurboID-based proximity labeling,TbPL）技术是将诱饵蛋白与 TurboID 融合，TurboID 催化生物素形成 biotin-5-AMP，进而与邻近蛋白的赖氨酸结合，从而对邻近蛋白进行生物素标记。最后，利用链酶亲和素耦合磁珠富集纯化标记蛋白，并通过质谱的方式获得互作蛋白组1,5。近年来，TbPL 已成功应用于多种植物体系的互作蛋白组和细胞器蛋白组研究，在烟草、拟南芥、番茄、日本莲等植物体系中均已试验成功。Zhang 等7首次利用该技术在烟草（Nicotiana benthamiana）中鉴定出与抗烟草花叶病毒免疫受体蛋白 NLR 互作的蛋白组，并发现新的免疫受体负调控蛋白 UBR7 能够直接与 NLR 的 TIR 结构域相结合，UBR7 的下调使得 NIR 蛋白量增加，进而提高了对烟草花叶病毒的抗性。同时，TbPL 也被应用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）稳定转化体系，Mair 等6以核定位的 TurboID-NLS 蛋白和 FAMA-TurboID 融合蛋白，在拟南芥中鉴定了幼苗气孔保卫细胞核蛋白组和 FAMA 互作蛋白组，并发现 TurboID 可应用于建立特定细胞器和植物低水平表达蛋白的蛋白组。Kim 等8将油菜素内脂信号通路关键负调控因子 BIN2 融合 TurboID，在烟草瞬时转化体系和拟南芥永久表达体系中进行邻近蛋白标记，发现 BIN2 下游底物 BZR1 可被生物素成功标记，同时在拟南芥中鉴定到 BIN2 的互作蛋白组。Arora 等9在烟草叶片细胞、拟南芥悬浮细胞体系和番茄（Solanum lycopersicum）毛状根培养细胞中，利用 TurboID 技术成功鉴定出多个互作蛋白组，并以日本莲（Lotus japonicus）的受体激酶 RLKs 捕获到膜相关蛋白组。Kim 等10以 TurboID-BIN2 融合蛋白在拟南芥中进行邻近蛋白标记，获得 4 000 多个候选互作蛋白，并鉴定出 482 个互作蛋白，其中有三分之二都能被 BIN2 磷酸化，丰富和完善了拟南芥 BIN2 信号调控网络，并揭示植物和动物的 BIN2 与 O-GlcNAc 修饰途径之间存在信号交流。但目前 TbPL 技术还未在单子叶植物水稻中应用。本文以水稻重要转录因子 OsWRKY53 为例，详细描述了将 OsWRKY53 融合 TurboID-eYFP 表达，获得 TurboID-eYFP-OsWRKY53 过表达转基因水稻，以其愈伤组织为实验材料，通过 TbPL 技术获得互作蛋白组的方法和注意事项。1材料和方法 1.1载体和菌株载体：pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP（图 1）；pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP-Os-WRKY53。菌株：农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 EHA105。植物材料：TurboID-eYFP-OE 愈伤组织；TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 愈伤组织。1.2试剂配方试剂配方详见表 1。1.3实验方法（1）载 体 构 建：以 日 本 晴 的 cDNA 为 模 板，以 表 2 中 的 PCAMBIA1300-OsWRKY53-F 和PCAMBIA1300-OsWRKY53-R 为引物，通过 PCR 的方式扩增 OsWRKY53 全长 CDS 序列，通过 Asc 和Kpn 连接入植物表达载体 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP 上，构建成 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP-OsWRKY53 植物过表达载体。（2）将 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP-OsWRKY53 和 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP分别转化农杆菌 EHA105。随后，通过农杆菌介导的遗传转化方法，转化龙粳 11 的愈伤组织，获得融合TurboID-eYFP 的 OsWRKY53 过表达转基因植株（TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE）和 TurboID-eYFP 过表达转基因材料（TurboID-eYFP-OE）。第 3 期刘佳欣等：利用 TurboID 邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法257（3）以表 1 中 HPT-F 和 HPT-R 为引物，对以上所获得的转基因材料进行潮霉素鉴定，初步筛选获得阳性植株。然后，分别提取它们的 RNA，反转录成 cNDA，并以其为模板，用表 1 中的引物进行 RT-qPCR 鉴定，挑选合适表达量的转基因材料进行 Western blot 检测，或通过激光共聚焦显微镜直接进行黄色荧光观察。获得稳定遗传且合适表达的 TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 转基因植株用于后续实验。（4）TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照 TurboID-eYFP-OE 的种子去皮后，用 70%的酒精浸泡1 min；随后，用 30%次氯酸钠浸泡 15 min，并重复 2 次；最后，用灭菌水清洗 5 6 次，种植于含终浓度为 60 mgL1潮霉素（Solarbio，H8080）的诱导愈伤培养基上，培养 30 d 左右。待长出愈伤颗粒后，将其转移至新鲜的含 60 mgL1潮霉素的诱导愈伤培养基上，继续扩大培养 10 d 左右。（5）用 Protein Extraction Buffer 提取步骤 4 中所获愈伤组织的总蛋白，加入 5PAGE Loading Buffer至终浓度为 1，煮沸 10 min 后，于 4，12 000 rpm 离心 10 min，吸取上清，进行 SDS-PAGE 电泳，用 GFP 抗体（Abmart，M2000 4 L）检测转基因材料蛋白水平的表达情况，挑选信号较强的转基因株系进行后续实验。（6）称取上述 TurboID-eYFP-OE 和 TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 的愈伤组织各 2 g，用终浓度为100 M 生物素（Sigma-Aldrich，B4501），于 28 培养箱中避光处理 6 h 后，收集愈伤组织，用预冷灭菌水清洗 3 次左右，滤纸吸干水分，冻存于80 冰箱。（7）迅速研磨样品至均匀后，将样品转移至 5 ml 离心管中；向样品中加入 4 ml Protein Extraction(11 004)BIpI(10 853)BspHI(10 531)PsiI(10 405)SacII(9 881)PspXI(9 230)RsrII(9 186)AsiSI(8 849)AatII(8 847)ZraI(8 806)SmaI(8 804)TspMI-XmaICaMV 35S promoter(enhanced)(8 008)BstXI(7 672)MauBI(7 477)AflII(7 418)KpnI(7 414)Acc65I(7 407)AscI(7 401)BstBI(7 392)BsrGI(6 474)StuI*(6 155)ApaI*(6 151)PspOMI*(6 183)AfeIBamHI(5 696)PmlI(5 210)HindIII(5 056)PmeI(4 847)SphI(4 726)AclI(2 792)BsiWI(1 830)BstZ17I(734)MreI-SgrAI(932)BsaI(1 311)EcoNI(1 404)Li761(1 307.1 337)BspDI*-ClaI*(1 636)(10 812)EcoO109I-PpuMIpCAMBIA1300-UBQ10p:TurboID-eYFP11 610 bp(11 353)SspI图 1pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP 载体信息Fig.1Vector information of pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP258土 壤 与 作 物第 12 卷 表 1试剂配方Table 1Reagent formulation试剂Reagent试剂名Reagent name终浓度Final concentration诱导愈伤培养基（调pH至5.8）Callus induction medium（Regulated pH to 5.8）N6基础培养基 N6 Basal Medium（Phyto Tech Labs,C167）3.99 gL1氯化钴 CoCl26H2O0.025 mgL1硫酸铜 CuSO45H2O0.025 mgL1钼酸钠 Na2MO42H2O0.025 mgL1肌醇 Inosite（Amresco,87-89-8）0.1 gL1脯氨酸 Proline（Biomol,147-85-3）2.8 gL1酸水解酪蛋白 Casein acid Hydrolysate（Sigma,A2427）0.3 g2,4-D2 mgL1蔗糖 Sucrose30 gL1植物凝胶 Phytagar4 gL1蛋白质提取缓冲液Protein Extraction Buffer三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 Tris-HCl（pH 7.5）50 mmolL1氯化钠 NaCl150 mmolL1去氧胆酸钠 Sodium deoxycholate（Sigma-Aldrich,A60015）0.5%（w/v）十二烷基硫酸钠 SDS（Solarbio,S8010）0.1%（w/v）乙二胺四乙酸 EDTA（Solarbio,E8030）1 mmolL1聚乙二醇辛基苯基醚 Triton X-100（Solarbio,T8200）1%（v/v）二硫苏糖醇 DTT（Sigma,A620058）1 mmolL1苯甲磺酰氟 PMSF（Amresco,0754）1 mmolL1Leupeptin（Sigma-Aldrich,L2884）10 mgL1PI（GLPBIO,GK10019）15PAGE Loading Buffer三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 Tris-HCl（pH 6.8）250 mM十二烷基硫酸钠 SDS10%（w/v）溴酚蓝 Bromophenol blue0.5%（w/v）甘油 Glycerol50%（v/v）-巯基乙醇-Mercaptoethanol（Sigma,M6250）5%（v/v）表 2本文所用引物信息Table 2Primer information used in this article引物Primer碱基序列Base sequence载体构建Vector constructionPCAMBIA1300-TurboID-OsWRKY53-FgtacaagttcgaaggcgcgccgATGGCGTCCTCGACGGGPCAMBIA1300-TurboID-OsWRKY53-RctcgctctcgagtcaggtaccCTAGCAGAGGAGCGACTCGACGA潮霉素鉴定Hygromycin(Hyg)identificationHPT-FTGCGCCCAAGCTGCATCATHPT-RTGAACTCACCGCGACGTCTGT实时定量RT-PCRQuantitative real-time RT-PCRubiquitin-FTGTGAAGATTGTGATGCCCTACubiquitin-RCCACGCCAACGGATAAAAWRKY53-FGAGCGACATCGACATCCTWRKY53-RTTGTGCTTGCCCTCGTAG第 3 期刘佳欣等：利用 TurboID 邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法259 Buffer，置于冰上反应 30 min；4，15 000 rpm 离心 20 min；取上清至一新的 5 ml 离心管中，15 000 rpm离心 10 min，收集上清用于后续蛋白脱盐实验。（8）剪去脱盐柱（Thermo，89893）底部，将其放入50 ml 离心管中；将脱盐柱的盖子拧松，4，1 000 g 离心2 min，弃去管底储存液；向脱盐柱中加入 5 ml Protein Extraction Buffer，4，1 000 g 离心 2 min，弃去缓冲液；重复此步骤 3 4 次，彻底清洗脱盐柱。（9）向脱盐柱中缓慢加入步骤 7 的上清液，待样品逐渐吸收；4，1 000 g 离心 5 min，收集样品。如果离心后效果不佳，可延长离心时间。（10）向 1.5 ml 离心管中加入 150 l Streptavidin 磁珠悬浊液（MedChemExpress，HY-K0208），加入 1 ml Protein Extraction Buffer，轻轻混匀，置于磁力架上进行磁性分离，弃掉上清液；重复此步骤 2 次，以彻底清洗 Streptavidin 磁珠。（11）向上述洗涤好的 Streptavidin 磁珠中，加入步骤 9 中脱盐后的样品，置于静音混合器上，4，孵育 12 16 h。（12）孵育完毕后，4，低速离心 30 s，弃上清液；向磁珠沉淀中加入 1 ml 预冷的 Protein Extrac-tion Buffer，置于静音混合器上，4 条件下洗涤磁珠 1 min，磁性分离后，弃上清液；重复此步骤 2 次。（13）向上述磁珠中加入 1 ml 预冷的 1 M KCl 溶液,洗涤磁珠 2 min，磁性分离后，弃上清液。（14）向步骤 13 置于磁力架上的离心管中，沿管壁缓慢加入 1 ml 预冷的 100 mM Na2CO3溶液（现配现用），并迅速弃上清液，Na2CO3洗涤时间不超过 10 s。（15）向步骤 14 置于磁力架上的离心管中，沿管壁缓缓加入 1 ml 尿素溶液（2 M Urea（Sigma-Aldrich，A600148），10 mM Tris-HCl pH8.0，现配现用），并迅速弃上清，尿素洗涤时间不超过 10 s。（16）向步骤 15 的离心管中，加入 1 ml 预冷的 Protein Extraction Buffer，轻柔混匀 1 min，磁性分离后，弃上清。重复此步骤 2 次。（17）取上述 2%的磁珠进行 SDS-PAGE 电泳，检测效果理想后，剩余磁珠可送公司进行质谱分析，以获得目的蛋白互作蛋白组。2结果与分析 2.1TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE转基因植株的获得利用 Asc 和 Kpn 酶切位点，将 OsWRKY53 的 CDS 序列连入 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP 植物表达载体（图 2A），通过农杆菌介导的遗传转化方法，共获得 11 株独立的 TurboID-eYFP-Os-WRKY53-OE 转基因株系和 9 株独立的 TurboID-eYFP-OE 转基因材料（对照组）。经表达量和 Westernblot 检测，共获得 5 株稳定遗传且合适表达量的 TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 和 3 株 TurboID-eYFP-OE。因 TurboID-EYFP-OsWRKY53-OE 转基因株系均表现为相似的表型，且 TurboID-eYFP-OE 表型均与野生型背景遗传材料相似，本文仅以其中 1 株为代表展示其株型（图 2B），以 3 株为代表展示其粒型。RT-qPCR 和 Western blot 结果表明，所获得转基因材料确为 OsWRKY53 过表达基因（图 2C-D）。较对照相比，TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 表现为叶倾角增大、粒长和粒宽显著增加的表型（图 2E-H），与之前已报道的 OsWRKY53-OE 表型相似11，说明 OsWRKY53 融合 TurboID-eYFP 表达并不影响其生物功能。以上材料可进行后续 TurboID 邻近蛋白标记实验。2.2终浓度为 100 M 生物素处理 6 h 为水稻愈伤组织的最佳处理条件为确定水稻愈伤组织的最佳处理条件，以 TurboID-eYFP-OE 愈伤组织为实验材料，分别用终浓度为 0、50、100、150、200 M 的生物素于 28 条件下处理 6 h，分别提取它们的总蛋白，进行 Western blot 检测；同时，以野生型背景遗传材料作为对照。结果发现随着生物素处理浓度的提高，TurboID-eYFP-biotin蛋白水平的积累量显著增加，在 100 M 生物素处理时达到峰值后趋于平稳，而 TurboID-eYFP 和 ACTIN的蛋白表达水平没有显著变化，说明 100 M 生物素处理后，邻近蛋白被标记的效率最高（图 3）。因此，260土 壤 与 作 物第 12 卷100 M 生物素为水稻愈伤组织的最佳处理浓度。同时，发现水稻内源生物素化蛋白大小在 70 100 kD 之间，野生型材料生物素处理前后，内源生物素蛋白水平没有发生显著变化（图 3）。2.3TurboID 邻近蛋白标记技术获得 OsWRKY53 邻近蛋白组以 TurboID-eYFP-OE 和 TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 的 2 g 愈伤组织为实验材料，用 100 M 生物素于 28 条件下避光处理 6 h 后，分别提取它们的总蛋白，用 Streptavidin 磁珠富集生物素标记蛋白，吸取 2%的磁珠进行 PAGE-SDS 电泳，检测标记蛋白富集情况。从图 4 可以看到，生物素处理后，TurboID-eYFP-Biotin 和 TurboID-eYFP-OsWRKY53-Biotin 的信号显著增强。说明生物素处理后，TurboID 生物素连接酶对目的蛋白的邻近蛋白进行较高效率的标记。离心后的蛋白上清（Extract）与脱盐后的蛋白样品（After Desalting）杂交信号没有显著变化，说明蛋白样品脱盐效果理想，基本没有损失。与 Streptavidin 磁珠过夜孵育后的样品上清（Flow-through）杂交信号显著减弱，而洗脱的蛋白样品（Eluate）杂交信号较强，说明 Streptavidin 磁珠富集了大部分的生物素标记的蛋白。3实验注意事项（1）水稻愈伤组织状态比较重要，愈伤组织颗粒性较好，表面较干燥，颜色偏黄的状态更利于实验的成功。CKT-OsWRKY53-OE-1T-OsWRKY53-OE-5T-OsWRKY53-OE-3T-OsWRKY53-OE-5TurboID-eYFP-WRKY53TurboID-eYFP04080120叶倾角Leaf inclination/()*BDEF00.20.40.60.81.0粒长Grain length/cm135CKT-OsWRKY53-OE*GCK135T-OsWRKY53-OE00.20.40.6粒宽Grain width/cm*H0102030相对表达量Relative expression40*UBQproTurboIDeYFPOsWRKY53Nos CaMV 35SHygCaMV Poly ARBLBAsc Kpn ACIB:-GFP130 kD95 kD72 kD55 kD43 kDCKT-OsWRKY53-OE-5CKT-OsWRKY53-OE-5CKT-OsWRKY53-OE-5CKIB:-ACTINACTIN注：A.重组植物表达载体 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP-OsWRKY53 示意图。B.TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE（图中标为 T-Os-WRKY53-OE-5）及 TurboID-eYFP-OE（图中标为 CK）总体表型图。C.TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照中 OsWRKY53 基因表达水平检测。D.TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照的 Western blot 检测结果。E.TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照的叶倾角统计结果。F.TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照的粒型表型。G 和 H 为 TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 及对照的粒长和粒宽的统计结果。Note:A.Schematic diagram of recombinant vector pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP-OsWRKY53.B.Comprehensive phenotype of TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE（T-OsWRKY53-OE in the figure）and TurboID-eYFP-OE（CK in the figure）.C.Analysis of OsWRKY53 gene expres-sion level in TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE and control.D.Western blot test of TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE and control.E.Statistical results ofleaf inclination of TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE and control.F.Grain size phenotype of TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE and control.G and Hindicate statistical results of grain length and width of TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE and control.图 2TurboID-eYFP-OsWRKY53-OE 转基因植株表型分析Fig.2Phenotypic analysis of TurboID-eYFP-OsWRKY53 over expression transgenic plants第 3 期刘佳欣等：利用 TurboID 邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法261（2）由于 pCAMBIA1300-UBQpro:TurboID-eYFP 载体上带有黄色荧光蛋白（eYFP），获得的转基因苗可在激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光蛋白表达情况，同时需要用 YFP/GFP 抗体检测目的蛋白融合表达情况，挑选信号最强的株系进行实验，信号弱的株系邻近蛋白标记效率相对较低。（3）水稻体内有内源表达的生物素，实验过程中应尽量减少内源生物素的干扰，方法就是通过脱盐柱去除（详见研究方法部分）；同时 TurboID-eYFP 在植物体内也会对其物理空间上的蛋白进行标记，为 72 kD55 kD95 kDWT0 50 100 150 200 Biotin/uM0 200TurboID-eYFPEndogenous biotinTurboID-eYFP-biotin55 kDACTINIB:-ACTIN43 kDIB:SA-HRP72 kD55 kDTurboID-eYFPIB:-GFP95 kD注：以 TurboID-eYFP-OE 愈伤组织为实验材料，分别用 0、50、100、150、200 M 生物素于 28 处理 6 h；同时，以野生型材料作为对照。提取它们的总蛋白，SDS-PAGE 电泳后，分别用 SA-HRP 抗体（Beyotime，A0303）、GFP 抗体（Abmart，M20004L）以及ACTIN 抗体（Abmart，M20009M）检测蛋白表达情况。Note:TurboID-eYFP-OE callus was used as the experimental material,and 0,50,100,150,200 M biotin was treated at 28 for 6 h,wild typematerials were used as control.After extracting their total protein and SDS-PAGE electrophoresis analysis,and followed by immunoblots with SA-HRP antibody(Beyotime,A0303),GFP antibody(Abmart,M20004L)and ACTIN antibody(Abmart，M20009M),respectively.图 3100 M 生物素处理水稻愈伤组织 6 h 后邻近蛋白标记水平Fig.3Proximity labeling level of rice callus treated with 100 M biotin for 6 hours 72 kD55 kD43 kD95 kD+BiotinExtractEluate(2%beads)Eluate(2%beads)+BiotinTurboID-eYFP-OE TurboID-eYFP-OsWRKY53-OETurboID-eYFP-BiotinTurboID-eYFP-OsWRKY53-BiotinIB:SA-HRP注：“”代表未经生物素处理；“+”代表 100 M 生物素处理 6 h；Extract 代表离心后的蛋白上清；After Desalting 代表脱盐后的蛋白样品；Flow-through 代表与 Streptavidin 磁珠过夜孵育后的样品上清；Eluate 代表洗脱后 2%的蛋白样品。Note:-represents not treated with biotin,+represents 100 M biotin treatment for 6 h.Extract represents the protein supernatant after centrifuga-tion;After Desalting represents the desalted protein sample;Flow-through represents the supernatant of the sample after overnight incubation withStreptavidin magnetic beads;Eluate represents 2%of the protein sample after elution.图 4Western blot 检测被 Streptavidin 磁珠富集的生物素化蛋白Fig.4Western blot detection of biotinylated protein enriched by Streptavidin magnetic beads262土 壤 与 作 物第 12 卷排除其干扰，一定以 TurboID-eYFP-OE 转基因材料作为对照，排除假阳性。（4）由于邻近蛋白标记，是对与目的蛋白物理空间上的邻近蛋白进行标记，所获得的互作蛋白组不一定全部都是目的蛋白的互作蛋白，必须通过酵母双杂交、双分子荧光互补、CO-IP 等技术进行验证。（5）Protein Extraction Buffer 需提前预冷，整个蛋白提取过程必须严格置于冰上操作，防止蛋白降解。（6）需用 Protein Extraction Buffer 彻底清洗脱盐柱，使得脱盐柱里的成分被 Protein Extraction Buffer彻底浸透，才能便于后续蛋白提取液的脱盐。（7）获得永久表达的转基因水稻时间较长，也可以将 T0代的抗性愈伤进行扩大培养，从中挑选蛋白表达水平较高的抗性愈伤进行 TurboID 邻近蛋白标记实验，缩短实验进程。（8）水稻内源生物素蛋白大小大约为 70 100 kD，融合了 TurboID-eYFP 的目的蛋白大小最好与内源生物素分开，否则无法通过 Western blot 检测目的蛋白的邻近蛋白标记情况。参考文献 (References)：邝嘉怡，李洪清，沈文锦，等.基于TurboID的植物蛋白邻近标记实验方法J.植物学报，2021，56（5）：584593.KUANG J Y，LI H Q，SHEN W J，et al.Methods for TurboID-based proximal labeling in plantsJ.Chinese Bulletin of Botany，2021，56（5）：584593.1 ROUX K J，KIM D I，RAIDA M，et al.A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammaliancellsJ.The Journal of Cell Biology，2012，196（6）：801810.2 MARTELL J D，DEERINCK T J，SANCAK Y，et al.Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electronmicroscopyJ.Nature Biotechnology，2012，30（11）：11431148.3 苏田，韩笑，刘华东.邻近标记在蛋白质组学中的发展及应用J.中国生物化学与分子生物学报，2020，36（1）：3641.SU T，HAN X，LIU H D.The proceedings and applications of proximity labeling in proteomicsJ.Chinese Journal of Biochemistry andMolecular 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