蜡样芽胞杆菌根状生长实验方法探讨.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN144/分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.13.036蜡样芽胞杆菌根状生长实验方法探讨Discussion on the Experimental Method of Bacillus Cereus Rhizoid Growth 廖丽辉，侯艳飞，秦 捷，向忠平（湖南省怀化市疾病预防控制中心，湖南 怀化 418000）LIAO Lihui,HOU Yanfei,QIN Jie,XIANG Zhongping(Huaihua Center for Disease Control and Prevention,Huaihua 418000,China)摘 要：目的：研究和完善根状生长实验方法，降低蜡样芽孢杆菌检验结果假阳性率。方法：根据 GB 4789.142014，在单因素变量情况下，筛选根状生长实验最佳条件。选择蜡样芽胞杆菌标准菌株、蕈状芽胞杆菌标准菌株、实验室分离株，用普通营养琼脂培养基（Nutrient Agar，NA）、平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptose Soya Agar，TSA）、含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE），在不同条件下分别进行根状生长实验。结果：经 30 培养 72 h，PCA 倾注9 mL的琼脂量，蜡样芽胞杆菌与蕈状芽胞杆菌根状生长实验效果最好，不易出现假阳性。结论：单一变量情况下，PCA NA TSA TSA-YE，倾注的培养基厚度为 9 mL 12 mL 15 mL 18 mL 20 mL，30 培养效果好于 37，培养时间为 72 h。该实验条件优化为区分蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌提供了一定的理论依据。关键词：蜡样芽胞杆菌；蕈状芽胞杆菌；根状生长Abstract：Objective:Research and improve the experimental method of root growth to reduce the false positive rate of Bacillus cereus test results.Method:According to GB 4789.142014,under the condition of single factor variables,the optimal conditions for rhizoid growth experiment were screened.Standard strains of Bacillus cereus,standard strains of Bacillus fungoides and laboratory isolates were selected to conduct root growth experiments under different conditions with common nutrient nutrient agar medium(NA),plate counting agar medium(PCA),tryptose soya agar medium(TSA)and trypsin soy-yeast extract agar medium(TSA-YE)containing 0.6%yeast extract.Result:After culture at 30 for 72 h,9 mL agar was poured into PCA,the results of Bacillus cereus and Bacillus fungoides root growth experiment were the best,and false positivity was not easy to appear.Conclusion:Under single variable conditions,PCA NA TSA TSA-YE,and the thickness of poured medium was 9 mL 12 mL 15 mL 18 mL 20 mL.The culture effect at 30 was better than that at 37 ,and the culture time was 72 h.The optimization of the experimental conditions provides a theoretical basis to distinguish the wax form from the mushroom form.Keywords：Bacillus cereus;Bacillus fungoides;root growth中图分类号：Q934蜡样芽胞杆菌在自然界中广泛存在，很容易引起食物污染，食物受该菌产毒菌株污染后，从外观、气味上无显著变化，食入后会引起食物中毒1。中毒后，还可引起败血症、心内膜炎、创伤和肺部感染等疾病2。蜡样芽胞杆菌与蕈状芽胞杆菌在实验室检测中生化实验很相近，难以区分，而根状生长是区分二者作者简介：廖丽辉（1986），女，本科，主管技师，研究方向为食品安全风险监测和食源性疾病监测。现代食品XIANDAISHIPIN145/分析检测AnalysisandTesting的重要实验，而国标中的“山谷状生长”和“根状生长”受很多因素影响，易导致主观误判，造成假阳性。因此，精准快速的检测出蜡样芽胞杆菌尤为重要。为了解不同条件下蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌根状生长检测效果，本文选择蜡样芽胞杆菌标准菌株、蕈状芽胞杆菌标准菌株、实验室分离株，用普通营养琼脂培养基（Nutrient Agar，NA）、平板计数琼脂培养基（Plate Count Agar，PCA）、胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptose Soya Agar，TSA）、含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（Trypticase Soy-Yeast Extract Agar，TSA-YE），在单因素变量情况下，筛选根状生长实验最佳条件。1 材料与方法1.1 材料与设备NA 培养基、PCA 培养基、TSA 培养基、TSA-YE 培养基、脑心浸出液肉汤、血琼脂平板均由青岛海博技术有限公司生产；蜡样芽胞杆菌标准菌株（CMCC 63306）、蕈状芽胞杆菌标准菌株（ATCC 10206）、实验室检出的蜡样芽胞杆菌30株，蕈状芽孢杆菌20株。NU-425-400 生物安全柜（Nuaire 公司）、GHP-9160 隔水式恒温培养箱（上海一恒）、TP-3000E 电子天平（湘仪天平）、SQ510C 高压灭菌器（雅马拓科学）、HRCJ-2D 超净工作台（青岛海尔）。1.2 实验前准备将蜡样芽胞杆菌标准储备菌株（简称 LY 标株）、蕈状芽胞杆菌标准储备菌株（简称 XZ 标株）、实验室蜡样芽胞杆菌（简称LY）、实验室蕈状芽胞杆菌（简称 XZ）用脑心浸出液肉汤复苏，37 培养过夜，后转至血平板上，待培养过夜后做根状生长实验。1.3 实验方法将经过高压灭菌的 NA、PCA、TSA、TSA-YE培养基用移液管分别吸取9 mL、12 mL、15 mL、18 mL、20 mL 加入无菌平板中，打开盖子让其自然凝固，以减少琼脂表面的水分。不同的量体现平板培养基的厚度有所不同。将所有平板置于 37 温箱烘干 5 h 后，使其在室温条件下过夜干燥。本次实验中蕈状标株（XZ 标株）为阳性对照株，分别用一次性无菌接种针将复苏好的菌株在上述不同量不同种类的培养基上做根状生长实验，然后分别放置在 30 和 37 恒温隔水式培养箱中培养，分别在 24 h、48 h、72 h 时观察培养状态。1.4 判断标准依据食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验（GB 4789.142014）3对根状生长实验进行判别：山谷状生长判为阴性，根状生长判为阳性。2 结果与分析2.1 血平板培养结果蜡样芽胞标准菌株在血平板上出现较宽的溶血环，表现为完全透明的 溶血现象，蕈状芽胞杆菌标准菌株在血平板上溶血现象较蜡样标准菌株略弱，而实验室蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌大部分出现完全透明溶血环，仅个别菌株表现为草绿色溶血现象。2.2 20 h、24 h 观察结果经 20 h 观察，仅 37 和 30 PCA 上的 XZ 标株与其中的 3 株 XZ 划线边缘略有毛刺，表现有轻微根状现象，但其他平板上菌株划线边缘未见毛刺，仅沿接种线生长，结果无法判别。经 24 h 观察所有平板，30 培养条件下，9 mL 的 NA 和 TSA 琼脂平板上小部分 XZ 划线边缘有微细且短的毛刺生长，但不足以判别阴阳性。而 9 mL 和 12 mL PCA 琼脂平板上，经24 h 培养的 XZ 标株可见微小毛刺，其他 XZ 不够明显，LY 标株基本上沿划线生长，未表现山谷状生长，9 mL PCA上30 培养24 h的菌株生长形态如图1所示。图 130 24 h 9 mLPCA 上菌落生长形态图2.3 48 h 观察结果经 48 h 观察，30 培养条件下，9 mL 的 PCA、NA、TSA、TSA-YE 上大部分蕈状可见粗短不整齐的边缘，大部分蜡样在上述平板上沿接种线生长，边缘现代食品XIANDAISHIPIN146/分析检测Analysis and Testing有类似不规整的波浪状，扩张于接种线外，故此时判定根状生长阴阳性结果不够准确，但不同种类平板中，PCA 和 NA 效果更佳。37 培养条件下，因菌落生长快，整体偏大，导致蕈状毛刺不明显，且蜡样芽胞杆菌山谷状的形态不能显现出来，容易误判。30 PCA和 NA 平板上的生长特征如图 2 所示。（a）PCA 平板（b）NA 平板图 2 30 48 h 9 mL PCA 和 NA 上菌落生长形态图2.4 72 h 观察结果经 72 h 观察，30 条件下 9 mL 的 PCA、NA、TSA、TSA-YE均可判定根状生长阴阳性结果：LY及LY标株呈山谷状生长，结果判阴性，XZ 和 XZ 标株呈根状生长，结果判阳性。选取 LY 标株、XZ 标株及其中一株食品 LY 株，生长状态见图 3、图 4、图 5、图 6。因其他平板均带 XZ 标株、LY 标株做对照，故不一一呈现。图 3 30 72 h PCA 上菌落生长形态图图 430 72 h NA 上菌落生长形态图图 530 72 h TSA-YE 上菌落生长形态图现代食品XIANDAISHIPIN147/分析检测AnalysisandTesting图 630 72 h TSA 上菌落生长形态图经观察，琼脂厚度越薄，同一种培养基根状生长实验越容易区分。9 mL 和 12 mL 的 4 种不同种类的平板结果表明，在 PCA 平板、NA 平板、TSA 平板上 30 株 LY 均可明显看到菌苔沿接种线扩张生长，且呈波浪纹，无细小毛刺，即呈现明显山谷状生长现象，结果为阴性，20 株 XZ 均可见丰富的毛须，且较 LY的波浪状更细更密集，树根样扩展开，呈现根状生长，结果为阳性，生长现象见图3、图4、图5（右上角平板）。同时，LY标株和XZ标株均可判定结果。而TSA-YE上，30 株 LY 均呈现山谷状生长，18 株 XZ 判为根状生长，还有 2 株 XZ 根状现象无法判别。当琼脂量在 15 mL 时，PCA 琼脂上 29 株 LY 和18 株 XZ 仍可判断结果，NA 琼脂上 28 株 LY 和 19 株XZ 可判断结果，TSA 琼脂上 27 株 LY 和 14 株 XZ 可判断结果，TSA-YE 琼脂上 24 株 LY 和 5 株蕈状可判断结果。当琼脂量在 18 mL 和 20 mL 时，所有平板上菌苔均沿线扩大，整体较粗，易影响结果判断，PCA 琼脂上 15 株 LY 和 6 株 XZ 结果比较明显，NA 琼脂上 13 株 LY 和 5 株 XZ 结果也可判别。在 TSA 和 TSA-YE 上，18 mL 虽较 20 mL 菌苔窄，但总体偏粗，均出现大锯齿状，导致 XZ 和 LY 边缘生长特征均不明显，无法判别。37 培养条件下，菌株在划线上因生长过快而较粗大，会影响结果判断，整体看来，LY 结果受影响较少，故不容易出现假阴性，但 XZ 结果受琼脂厚度影响较大，易造成假阳性结果，且琼脂量越多，即厚度越厚，假阳性率越高。从不同种类的琼脂来看，PCA效果最佳。3 结论与讨论蜡样芽胞杆菌的繁殖体较为耐热，加热 100 20 min 可以被杀死，它产生的芽孢可在环境中长期存在并大量繁殖4，引起的中毒事件屡见不鲜，准确快速地区分蜡样和蕈状的实验工作极其重要，从上述实验结果可发现，根状生长实验可以受培养基种类、培养基厚度、培养温度、培养时间等因素影响，尤其对于从事蜡样芽胞杆菌检测的新人员来说有一定难度，实验结果受主观影响，容易将蕈状判为蜡样，从而直接影响肠毒素等后续检测工作，导致结果出错。尤其在由蜡样引起的食物中毒发生时，快速提高检测能力，准确查出致病因子是重中之重。受多因素影响，实际工作中蕈状和蜡样在 MYP 平板上形态很相近，不具有典型菌落形态，且因蜡样的动力实验有些型别为阴性，故动力实验并不能很好地区分蕈状和蜡样。根状生长实验在区分二者上意义重大，本次实验标准菌株和实验室随机选取的实验株更具有代表性，为实验室提供一定的理论基础。近年来，蜡样芽胞杆菌食物中毒比例较高，常见此菌检出自米面、谷物、肉制品等富含碳水化合物的食品5。实验室可以选择合适的平板，以提高工作效率。本次实验优化了培养条件，由图 1 可见，经 24 h 培养后，在 PCA 平板上，LY 的山谷状生长及 XZ的根状生长并不明显，极个别可粗略判断结果，在其他 3 种培养基上，XZ 毛刺未长出，且 LY 沿线生长，无山谷状现象，可能与培养时间不够，菌数达不到扩展生长量有关；经 48 h 后，PCA 平板优势显现出来，尤其是 XZ 毛须初形成，但与 LY 的波状纹相似，主观判断不肯定；经 72 h 后，菌落形态见图 3、图 4、图 5、图 6，经观察，XZ 的根状现象和 LY 的山谷状能明显区分，尤其XZ根状多而细长，在平板厚度相同条件下，不同培养基 PCA NA TSA TSA-YE；由 72 h培养的图片显示，同一平板不同量区别很大，但 9 mL和 12 mL 在 PCA 和 NA 上因仅 3 mL 体积差，对厚度的改变不大，效果尚可，其中以 9 mL 最明显，平板厚度9 mL12 mL15 mL18 mL20 mL。因此，实验室在用根状生长区分蜡样和蕈状时，可倾注 9 mL的 PCA 经干燥表面水分后在 30 培养 72 h，非常容易区分根状生长和山谷状生长，且 XZ 判为 LY 的假阳性率极低（20 株/20 株，0%），注意培养时间不能超（下转第157页）现代食品XIANDAISHIPIN157/分析检测AnalysisandTesting凉菜间菜刀、菜墩、案板等消毒记录，且盛装凉菜的容器存在生熟交叉使用情况，推断在海产品生加工环节可能存在公用器具被副溶血性弧菌污染，在未消毒公用器具的情况下直接使用其加工凉拌菜，造成凉拌菜被污染。依据副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则（WS/T 811996）7，结合流行病学调查和实验室检测结果，认为这是一起由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件。副溶血性弧菌具有嗜盐怕酸、不耐受高温的特点9，在海产品加工过程中，对所使用的公用器具、餐具进行消毒，对食材加热彻底可以降低此类事件的发生。为预防此类事件的再次发生，提出以下针对性建议。餐饮部门应加强自身管理，学习餐饮业相关卫生规范，严格执行餐具消毒规范，提高餐饮管理人员及从业人员卫生安全意识和责任意识10。监管部门应加强对各餐饮部门的监督管理，加大餐饮工作人员的培训力度，使其掌握食品安全相关知识。当地政府应加强食品卫生知识宣传，增强广大消费者的食品安全自我防范意识。本次调查还存在一些局限性。病例搜索不全，接报时，就餐人员已分散回家，无法调查全部就餐人员，流行病学调查存在局限。食物留样不全，导致实验室仅对部分剩余食物进行了检测。现场卫生学调查不全面，未能还原食物加工的整个详细过程，缺乏推断引起本次事件的完整证据链。参考文献1 夏琳琳，邱爽，王若彤，等.20112020 年中国食源性疾病暴发的时空趋势 J.卫生研究，2023，52（2）：226-231.2 刘颜，张先德，王乐，等.一起因食用热狗沙拉面包引起的肠炎沙门氏菌食源性疾病事件调查分析 J.中国食品卫生杂志，2022，34（2）：359-364.3 张珂，周倩倩，毕景然，等.硫醚类香料对沙门氏菌和副溶血性弧菌的抑制作用 J.中国食品学报，2022，22（6）：125-132.4 覃芳葵，吴朝学，宋阳，等.简阳市某酒店 1 起副溶血性弧菌食物中毒的流行病学调查 J.预防医学情报杂志，2019，35（9）：1053-1056.5 钟延旭，赵鹏，蒋玉艳，等.广西一起酒店宴席副溶血性弧菌食物中毒事件调查分析 J.应用预防医学，2020，26（6）：486-488.6 郁旷明，寇俊，刘战峰，等.一起酒店聚餐引起的食物中毒调查分析 J.现代预防医学，2018，45（9）：1698-1700.7 中华人民共和国卫生部.副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则：WS/T 811996S.北京：中国标准出版社，1996.8 邱艺燕，欧秀华.一起副溶血性弧菌食物中毒的实验室检测分析 J.中国卫生标准管理，2021，12（12）：58-61.9 刘焕文，董锐.浅析餐饮业和集体用餐配送单位卫生规范的实施 J.中国初级卫生保健，2009，23（4）：77.过 72 h，否则平板易干燥开裂，不利于结果观察。当基层实验室未储备 PCA 时，可按照 GB 4789.142014 使用 NA 平板，但培养时间可延长至 72 h（国标为2448 h），且琼脂的量控制在9 mL。当储备PCA时，该实验可首选 PCA，从而提高检出率，降低假阳性率，为蜡样芽孢杆菌引起的食源性突发事件处置提供一定的参考。参考文献1 杨广锐.食品中蜡样芽孢杆菌检测方法的分析及建立改进方法的研究 D.石河子：石河子大学，2014.2 黄俊云，胡蓉，何华.临床标本蜡样芽胞杆菌的分离及耐药性分析 J.临床检验杂志，2009，27（1）：27.3 国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验：GB 4789.142014S.北京：中国标准出版社，2014.4 于维森，王伟栋，孙建平.常见细菌性食物中毒快速处置 M.北京：人民卫生出版社，2013.5 许娇，陈磊，巩飙.开封市售奶茶中蜡样芽胞杆菌的鉴定与分析J.河南预防医学杂志，2020，31（4）：308-310.（上接第 147 页）