锦带花组培快繁体系的建立.pdf

第 30 卷 第 3 期 天 津 农 学 院 学 报 Vol.30，No.3 2023 年 6 月 Journal of Tianjin Agricultural University June，2023 收稿日期：2022-07-06 基金项目：天津市科技计划项目（18ZXBFNC00370）；河北省产业创新创业团队项目（199A2905H）；河北省创新能力提升计划项目（20566301D）；河北省中央引导地方科技发展资金项目（206Z6303G）作者简介：李得萍（1997），女，硕士在读，主要从事植物组织培养研究。E-mail：。通信作者：黄俊轩（1973），男，副教授，硕士，主要从事园林植物的教学与科研。E-mail：。文章编号：1008-5394（2023）03-0012-04 DOI：10.19640/ki.jtau.2023.03.003 锦带花组培快繁体系的建立 李得萍，许丁帆，何远秦，杨森茹，黄俊轩通信作者，刘艳军（天津农学院 园艺园林学院，天津 300392）摘 要：以锦带花带腋芽茎段为外植体，探究最佳外植体消毒方法、最适初代培养基、最适增殖培养基，建立锦带花组培快繁体系。结果表明：外植体最佳消毒方法为 2%次氯酸钠溶液消毒 10 min后，接种至添加 125 mg/L 羧苄青霉素的 MS 培养基，外植体污染率仅 1.67%，萌发率 98.3%；初代培养最适基本培养基为WPM，组培苗平均株高可达5.58 cm、茎粗1.7 cm；最适增殖培养基为WPM1.0 mg/L BA0.5 mg/L IAA，增殖系数 8.0，增殖芽高度 1.7 cm，生长势强且未出现玻璃化现象。本研究可为锦带花工厂化生产和繁育提供有效的技术支撑。关键词：锦带花；茎段；基本培养基；增殖培养 中图分类号：S685.99 文献标识码：A Establishment of tissue culture and rapid propagation system of Weigela florida Li Deping,Xu Dingfan,He Yuanqin,Yang Senru,Huang JunxuanCorresponding Author,Liu Yanjun（College of Horticulture and Landscape,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300392,China）Abstract:The stem segment of axillary bud was used as explants to explore the best method of explants disinfection,the best medium for primary generation and the best medium for proliferation,and to establish the tissue culture and rapid propagation system of Weigela florida.The results showed that the best disinfection method for explants was 2%sodium hypochlorite solution for 10 min,and then inoculated into MS medium supplemented with 125 mg/L benzylpenicillin.The contamination rate of explants was only 1.67%,and germination rate was 98.3%.The optimal medium for primary culture was WPM.The average plant height and stem diameter of tissue culture seedlings were 5.58 cm and 1.7 cm respectively.The optimal medium for proliferation was WPM+1.0 mg/L BA+0.5 mg/L IAA,the proliferation coefficient was 8.0,the height of bud was 1.7 cm,and the growth potential was strong without vitrification.This study can provide effective technical support for the factory production and breeding of Weigela florida.Key words:Weigela florida;stem segment;basic medium;multiplication culture 锦带花（Weigela florida）为忍冬科（Caprifoli-aceae）锦带花属（Weigela）丛生灌木植物。主要分布于我国黑龙江、吉林、辽宁等地区，其花色艳丽、叶色多变、抗逆性强，是北方重要的园林观花植物1-3。同时，锦带花还具有抑菌、抗流感、镇痛等多种药用功效4-5，也可为纺织品染色6，以及作为防火树种7。锦带花因种子微小不易采集，且种子出芽率低，生产中极少采用播种法进行大规模繁殖。其种苗繁育多采用扦插、压条或分株等繁殖方法8，但以上方法繁殖效率较低，且长期无性繁殖会导致病虫害的积累，影响苗木的质量。组培快繁技术具有速度快、繁殖系数大等优点，且能维持原有品种的优良特性，适应周年工厂化生产，使苗木繁殖不受自然环境中季节和恶劣气候的影响9。目前，关于锦带花组培快繁方面的研究报道较多，前人在锦带花组培快繁研究中，一般先通过外植体诱导愈伤组织，进而分化出不定芽，采用不定芽再生的方式进行增殖10-12。然而愈伤组织诱导过程周期较长且可能产生变异13，导致锦带花变异植株发生频率相对较高。本试验采用茎段为外植体，通过诱导腋芽萌发增殖的方式进行离体快繁，腋芽繁殖出来的后代遗传稳定性较高，以此建立一种高效且遗传稳定的锦带花组培快繁体系，为锦带花工厂化育苗奠定基础。第 3 期 李得萍，等：锦带花组培快繁体系的建立 131 材料与方法 1.1 试验材料 供试材料为天津农学院东校区内生长健壮、无病虫害红王子锦带花植株。1.2 试验方法 1.2.1 锦带花的外植体消毒 剪取植株上当年生新梢中上部茎段，每个茎段带有 12 个腋芽。用 70%乙醇溶液浸泡 30 s，无菌水冲洗 30 s，再分别采用含有效氯 1%、2%、4%的次氯酸钠溶液消毒，消毒时间设置为 5、10 min，消毒后无菌水冲洗 3 次，每次冲洗 10 min，再用无菌滤纸吸干外植体表面水分，并剪去外植体两端褐化部分，分别接种至 MS、MS125 mg/L 羧苄青霉素培养基上。试验重复 3 次，每个处理接种 10 瓶，每瓶接种 3 个外植体。15 d 后观察并统计不同处理的外植体污染率、腋芽萌发率及腋芽生长情况。1.2.2 锦带花初代培养基筛选 将萌发后长至1.52.0 cm的腋芽从外植体上切下，取生长状况一致的组培苗接种到不同种类的初代培养基上。初代培养基分别采用 MS、B5、WPM、Anderson、White 为基本培养基。每个试验处理接种 15 瓶，每瓶接种 3 个腋芽，试验重复 3次。30 d 后观察并统计不同基本培养基中锦带花平均株高、平均茎粗及腋芽生长情况。1.2.3 锦带花的增殖培养 将锦带花组培苗作为外植体，将其剪成 23 cm 小段，每个茎段带有 2 个腋芽，接种到不同的增殖培养基上。增殖培养基以 WPM 为基本培养基，添加不同质量浓度的 BA 和 IAA，7 种增殖培养基分别为：WPM；WPM0.5 mg/L BA；WPM1 mg/L BA；WPM2 mg/L BA；WPM0.5 mg/L BA0.5 mg/L IAA；WPM1 mg/L BA0.5 mg/L IAA；WPM2 mg/L BA1 mg/L IAA。每个处理接种 15 瓶，每瓶接种 3 个茎段。30 d 后观察并统计每种处理增殖系数、增殖芽平均高度及增殖芽生长情况。1.2.4 培养条件 以上培养基均采用7 g/L琼脂粉，30 g/L蔗糖，pH 值 5.86.0，培养温度（252），光照强度2 0002 500 lx，连续照明。1.2.5 数据统计及方法 外植体污染率（%）污染外植体数/接种外植体数100；腋芽萌发率（%）萌发外植体数/接种外植体数100；平均株高（cm）同一处理株高之和/外植体数；平均茎粗（cm）同一处理茎粗之和/外植体数；增殖系数有效芽数/接种新梢数（有效芽为芽高1 cm）。采用 Excel 统计数据，并用 SPSS20.0 分析软件进行显著性分析。2 结果与分析 2.1 不同消毒处理方法对外植体消毒效果的影响 由表 1 可知，随着次氯酸钠质量分数和消毒时间的增加，外植体污染率逐渐减小，外植体腋芽萌发率逐渐上升，但并非质量分数越高越好，使用 4%次氯酸钠消毒 10 min 后，在植株死亡的情况下 MS 培养基仍出现外植体污染，污染率为10%，均为细菌污染，考虑是植株内生菌所造成。因此在处理组中加入质量浓度为 125 mg/L 的羧苄青霉素进行试验，2%次氯酸钠消毒 10 min 消毒效果最好，外植体污染率 1.67%，腋芽萌发率 98.3%。由此可知，次氯酸钠浓度过高会对植物产生毒害作用，从而影响其正常生长，甚至死亡。综合考虑外植体污染率和腋芽萌发率，最适合消毒方法为：2%次氯酸钠溶液消毒 10 min，接种到 MS125 mg/L 羧苄青霉素培养基中。表 1 不同消毒处理方法对锦带花消毒效果的影响 处理 NaClO浓度/%NaClO处理时间/min 羧苄青霉素质量浓度/mgL-1 污染率/%腋芽萌发率/%腋芽生长情况 1 1 5 0 98.3a 1.67j 弱 2 2 5 0 83.3b 16.7i 弱 3 4 5 0 60.0d 40.0g 弱 4 1 10 0 53.3f 46.7ef 弱 5 2 10 0 25.0i 75.0b 弱 6 4 10 0 10.0j 0.0j-7 1 5 125 80.0c 20.0hi 强 8 2 5 125 56.7ef 43.3f 强 9 4 5 125 41.6h 58.4c 强 10 1 10 125 46.7g 53.3d 强 11 2 10 125 1.67k 98.3a 强 12 4 10 125 0.0k 0.0j-注：表中同列数据后不同小写字母代表差异显著 （P0.05）。下同 2.2 不同基本培养基类型对锦带花生长的影响 由表 2 可知，锦带花腋芽在 5 种基本培养基天 津 农 学 院 学 报 第 30 卷 14中生长 30 d 后，其平均株高、茎粗均差异显著 （P0.05），其中 Anderson 培养基中长势最弱，平均株高 0.6 cm，平均茎粗 2.50 cm，显著低于其他 4 种培养基中的水平，不适于锦带花组培苗木的生长；基本培养基为 MS 和 B5 时，其平均茎粗没有显著性差异，显著高于 Anderson 和 White 培养基所培养组培苗，但显著低于 WPM 培养基所培养的组培苗，且植株生长情况一般；当基本培养基为 WPM 时植株平均株高和平均茎粗均显著高于其他基本培养基培养，且植株生长势较强。综上所述，WPM 基本培养基最适合锦带花组培苗生长，培养 30 d 后，植株的平均株高为 5.58 cm，平均茎粗 1.7 cm，植株生长旺盛，生长情况较强（图1）。表 2 不同基本培养基类型对组培苗生长的影响 基本培养基 平均株高/cm 平均茎粗/cm 生长情况 MS 3.70c 1.3b 一般 B5 4.20b 1.2b 一般 WPM 5.58a 1.7a 较强 Anderson 2.50e 0.6d 弱 White 2.99d 1.0c 一般 图 1 红王子锦带花组织培养和快速繁殖 注：a：WPM 培养基初代培养 30 d；b：组培苗增殖芽；c：组培苗 2.3 不同激素质量浓度配比对锦带花增殖培养的影响 不同激素处理对锦带花增殖影响不同。由表 3可知，当单独加入 BA 时，各处理的增殖系数均大于对照组 ck，随着 BA 质量浓度的增加，增殖系数由高到低再升高，当 BA 质量浓度达到 1.0 mg/L 及以上时生长势减弱并出现玻璃化，增殖芽的平均高度逐渐下降。因此，单独添加 BA 时，0.5 mg/L 的质量浓度条件下增殖效果最好，增殖系数 3.9，增殖芽平均高度 1.8 cm；在同时添加 BA与 IAA 时，各处理的增殖系数、增殖芽平均高度进一步提升，均大于未加 IAA 的处理组，其中添加 1.0 mg/L BA0.5 mg/L IAA 的增殖效果最好，增殖系数为 8.0，增殖芽高度为 1.7 cm，生长势强且未出现玻璃化。其次是添加 0.5 mg/L BA0.5 mg/L IAA 的处理组，增殖系数为 6.9，增殖芽高度为 3.2 cm，增殖芽平均高度显著高于其他处理；2.0 mg/L BA1.0 mg/L IAA 条件下效果最差，增殖芽平均高度低于对照组，可见此条件并不适用于锦带花腋芽增殖生长。因此，综合考虑得出，红王子锦带花最适的增殖培养基为 WPM1.0 mg/L BA0.5 mg/L IAA。表 3 不同增殖培养基对锦带花增殖培养的影响 不同培养基 增殖系数 增殖芽平均株高/cm 增殖芽生长情况 CK 1.34e 1.3c 生长势一般 0.5 mg/L BA 3.9c 1.8b 生长势一般 1.0 mg/L BA 2.9d 1.1d 生长势较弱，部分玻璃化 2.0 mg/L BA 3.2d 0.6f 生长势较弱，玻璃化 0.5 mg/L BA0.5 mg/L IAA 6.9b 3.2a 生长势强 1.0 mg/L BA0.5 mg/L IAA 8.0a 1.7b 生长势一般 2.0 mg/L BA1.0 mg/L IAA 4.0c 0.8e 生长势较弱，玻璃化 3 讨论与结论 植物组织培养过程中，外植体消毒是建立锦带花组培快繁体系的关键步骤。前人多采用升汞进行锦带花外植体消毒14-18，但升汞有剧毒、易残留，且管制较严不易获取，而次氯酸钠使用较为安全。本试验采用次氯酸钠溶液作为消毒液，使用 2%次氯酸钠溶液消毒 10 min 后，将外植体接种到含 125 mg/L 羧苄青霉素的 MS 培养基上，其污染率为 1.67%，腋芽萌发率达 98.3%，且腋芽生长势强。在锦带花外植体消毒试验结果中发现，使用2%次氯酸钠消毒 10 min 后接种到 MS 培养基中其消毒效果并不理想，污染率达 25%，然而在提高次氯酸钠溶液有效氯浓度后，外植体出现死亡现象，并且仍存在细菌污染现象，推测为锦带花植株内生菌所造成，因此试验采用添加抗生素的方法来抑制内生菌污染。通过在培养基中添加 125 mg/L 羧苄青霉素后，锦带花茎段污染率显著低于未加羧苄青霉素的处理组。黄俊轩等19在北美海棠脱菌组培试验中，使用含有 250 mg/L 羧苄青霉素和50 mg/L卡那霉素的MS培养基取得了理想的内生菌抑制效果。侯淑婧等20在花叶锦带花组织培养试验中，在初代培养基中添加 480 mg/L 羧苄青霉素也有效抑制了花叶锦带花内生菌的污染。第 3 期 李得萍，等：锦带花组培快繁体系的建立 15因此，抗生素在组培中对植株脱菌以及生长具有明显的促进作用，而其抗生素浓度使用差异可能与取材植株的生理状态、外植体的取材部位及老嫩程度等有关，在试验前应先进行预试验来确认使用抗生素的浓度范围。本试验得出 WPM 基本培养基更适合锦带花组培苗生长，这一结论与多位学者不一致15，21。WPM 培养基是经过 MS 培养基改良后的低盐培养基，主要用于木本植物的培养，因此，对于锦带花组培苗的培养也适用。B5 培养基是一种低盐培养基，也有利于锦带花组培苗的生长，且生长效果优于高盐 MS 培养基培养，因此，锦带花适合较低盐培养基培养。Anderson 培养基研制之初主要用于牡丹属植物组织培养22-23，锦带花属植物培养没有相关报道，本试验结果也表明，锦带花在Anderson 培养基中生长效果最差，不适合生长。增殖培养常用的增殖方法有不定芽增殖和腋芽萌发增殖24-25。不定芽增殖通常需脱分化形成愈伤组织，再经过再分化过程形成不定芽。而在诱导愈伤组织过程中，一般会使用大量的外源植物激素促使外植体脱分化，且愈伤组织脱分化与再分化过程中，其过程复杂，激素浓度使用不当时可能会导致组培苗遗传变异的产生。本研究采用诱导腋芽萌发增殖的方式进行离体快繁，这种方式具备遗传稳定性较高、成苗速度快等优点。本研究以锦带花带腋芽茎段为外植体，通过不同的消毒方式获得无菌苗，筛选适合锦带花组织培养的基本培养基和合适的增殖培养基，通过腋芽萌发的方式初步建立起了锦带花组培快繁体系。试验结果显示，外植体最佳消毒方法为 2%次氯酸钠溶液消毒 10 min 后，接种至添加 125 mg/L羧苄青霉素的 MS 培养基中，此方法外植体污染率仅 1.67%，萌发率可达 98.3%；初代培养最适基本培养基为WPM，组培苗平均株高可达5.58 cm，茎粗 1.7 cm；最适增殖培养基为 WPM1.0 mg/L BA0.5 mg/L IAA，增殖系数8.0，增殖芽高度1.7 cm，生长势强且未出现玻璃化现象。参考文献：1 沈夏淦.北方优良观花灌木锦带花J.植物杂志，2003（5）：10.2 庄倩，马立华，时亚军，等.锦带花杂交育种及新品种选育J.森林工程，2018，34（4）：36-39，107.3 余银娟，朱蓉，马水晶，等.斑叶锦带花扦插繁殖J.中国花卉园艺，2022（1）：60-63.4 郑婕，邓冰倩，罗学娅.中药锦带花的研究进展J.中国当代医药，2019，26（10）：21-23.5 李佳霓，应子斓，代鑫，等.锦带花乙酸乙酯提取物镇痛作用研究J.现代盐化工，2020，47（4）：40-42.6 于颖，杨东霞，吴晓杰，等.红王子锦带花染料对柞蚕丝绸的染色性能J.印染助剂，2017，34（4）：29-33.7 徐家琛.呼和浩特市 21 种园林植物抑燃性分析D.呼和浩特：内蒙古农业大学，2020.8 李子军，张海燕，曹玉忠.四季锦带、紫叶小檗嫩枝扦插技术J.吉林林业科技，1996（4）：57，14.9 王立娟，衣俊鹏，纪玉和，等.红王子锦带花组培快繁技术J.吉林林业科技，2002，31（1）：54-55.10 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